CN106148232B - 一株拮抗植物病原细菌的细菌菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株拮抗植物病原细菌的细菌菌株及其应用。本发明拮抗菌为深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ‑20，微生物保藏号为CGMCC No.12556。本发明的深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ‑20是从杨树根际土壤中分离获得，能产生蛋白酶，能抑制欧美杨溃疡病菌(Lonsdalea quercina)、猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae)、白菜软腐病菌(Erwinia carotovora)及核桃黑斑病菌(Xanthomonas juglandis)等植物病原细菌的生长，可用于防治由欧美杨溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌及核桃黑斑病菌等病原细菌引起的植物病害。本发明的拮抗菌是一种防治效率高、防治范围广、环境安全性好的生物防治潜力菌株，具有良好的开发应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株细菌菌株，特别涉及一株深层类芽孢杆菌菌株及其在拮抗植物病原细菌中的应用，属于微生物领域，可用于植物保护，防治植物病害。
背景技术
植物病害是世界上一种非常普遍的自然灾害。植物病害在世界范围分布广泛，其种类繁多，危害的寄主植物广，造成生态、经济以及社会的损失巨大。造成植物病害的病原多样，包括真菌、细菌、病毒等侵染源和环境因素等非侵染源。植物病害的生物防治是指通过人以外的一种或多种生物来降低病原菌数量或减弱病原菌的致病活力，从而减少病害的发生，并且有利于有益生物如作物、树木、动物、益虫及微生物。植物病害生物防治上可供利用的微生物种类包括真菌、放线菌、细菌、病毒甚至高等植物等。随着人类环保意识的不断增强，生物防治逐渐成为研究的重要发展方向之一。
杨树是我国主要的造林绿化、生态环境建设以及经济树种之一，具有适应性广、生长速度快等特点，在防风固沙、水土保持，农田保护和维护生态平衡等方面发挥着重要的作用，在我国大片地区栽植，在世界各地也有广泛分布。
近十年由欧美杨溃疡病菌(Lonsdalea quercina)引起的欧美杨溃疡病是一种发生严重的新植物细菌性病害，造成树皮开裂，树干韧皮部局部坏死，并从树皮裂缝处有大量伤流产生，发病树木树干顶梢及病枝枯死，严重消耗树木养分。自2006年至今对国内多地杨树造成严重影响，严重时树体衰弱甚至枯死，严重影响树木材积及其他可利用部分，造成巨大的经济和生态损失。目前对其的防治方法以合理栽培搭配抗病品种选育、营林措施和化学防治为主。但是，抗病品种的生态适应能力较低，对土壤气候的要求不同，抗病能力与种植地区有一定联系；而化学防治长期使用化学农药不仅使植物病原菌产生抗药性，而且会污染环境，影响人类健康，破坏生态 环境。自20世纪80年代中期，在生物防治蓬勃发展的带动下，植物病害的生物防治作为了一种安全、有效的控制植物病害的新途径，渐渐被人们所重视，并成为热点研究方向。
深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)是2013年新发现的一种类芽孢杆菌属细菌。类芽孢杆菌属成员具有芽孢杆菌属菌株的某些共性，具有显著的生防潜力，能产生耐热抗逆的芽孢，有利于生防菌剂的生产、剂型加工等，具有生长快，分布广泛，营养简单等特点，近年来，国内外对于类芽孢杆菌的研究逐渐增多，在生物农药、环境治理等方面取得了一定成果。目前，国内外还未有应用深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)作为拮抗菌防治植物病原细菌的报道，将深层类芽孢杆菌应用在植物病害防治上具有创新性，并具有较高的意义与价值。从杨树根际土壤中分离筛选获得的一株能高效抑制欧美杨溃疡病菌生长的拮抗菌，使得生物防治应用范围更加广泛、使用更加灵活，这些对于包括欧美杨溃疡病在内的一系列细菌性植物病害的生物防治上具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对在植物病害防治中的植物溃疡病尤其是欧美杨溃疡病的防治存在的技术问题提供一种抑菌谱广、抑制效率高的用于拮抗植物病原细菌的细菌菌株深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20。
本发明的拮抗菌Paenibacillus profundus XZQ-20是从杨树根际土壤中分离筛选获得的对多种植物病原细菌具有显著拮抗作用的生防细菌菌株，本发明的深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20对多种病原细菌具有高效抑制作用，是一种广谱生防细菌菌株，应用本发明的拮抗菌株能显著防治植物病害尤其是欧美杨溃疡病的发生，解决了目前植物病害化学农药防治药物残留及环境污染严重等问题。
本发明的拮抗菌Paenibacillus profundus XZQ-20拮抗欧美杨溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃黑斑病菌等植物病原菌。
本发明另一目的是提供上述拮抗菌Paenibacillus profundus XZQ-20在防治植物病原细菌引起的植物病害方面的应用，尤其在防治欧美杨溃疡病、核桃黑斑病、白菜软腐病、猕猴桃溃疡病等方面的应用。
本发明的拮抗菌Paenibacillus profundus XZQ-20防治由欧美杨溃疡病菌(Lonsdalea quercina)引起的欧美杨溃疡病、由核桃黑斑病菌(Xanthomonas juglandis)引起的核桃黑斑病、白菜软腐病菌(Erwinia carotovora)引起的白菜软腐病、猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae)引起的猕猴桃溃疡病等细菌性植物病害。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明的用于拮抗植物病原细菌的细菌菌株为深层类芽孢杆菌(Paenibacillusprofundus)XZQ-20，其微生物保藏号是：CGMCC NO.12556；分类命名是：Paenibacillusprofundus；保藏时间：2016年5月27日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。
本发明的拮抗菌株Paenibacillus profundus XZQ-20拮抗欧美杨溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃黑斑病菌；能高效防治欧美杨溃疡病、猕猴桃溃疡病、白菜软腐病、核桃黑斑病；而且还能产生蛋白酶，产生的蛋白酶降解病原菌细胞壁，从而抑制甚至杀死欧美杨溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃黑斑病菌等的生长。
本发明的用于拮抗植物病原菌的细菌菌株的形态特征：
深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20为革兰氏阳性杆菌，菌体大小约0.80-2.03μm×2.75-7.49μm，有芽孢，具鞭毛。
菌体在LB培养基平板上呈乳白色，不透明，菌落圆形、光滑，边缘隆起、完整，菌体粘稠。
其中，每1000mL所述LB培养基含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，pH 7.0-7.2。
本发明的用于拮抗植物病原菌的细菌菌株Paenibacillus profundus XZQ-20的分离、筛选方法：
1)取杨树根际土层厚度为5-25cm处的土壤5g，置于盛有45mL无菌水的三角瓶中，于摇床上在28℃下、180rpm、振荡30min，静置，得到的菌悬液(即为10-1的土壤稀释液，也就是稀释10倍的土壤溶液)；接着用10倍梯度稀释法依次稀释得到10-3、10-4、10-5浓度梯度的稀释液；然后从各个浓度梯度悬浮液中分别取0.1mL，用无菌涂布棒分别涂于LB(每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉15g，pH 7.0-7.2)培养基平板上，以无菌水为对照，涂抹均匀后放到 恒温箱中28℃恒温倒置培养；
2)连续观察8天后，挑取菌落形态不同的菌株，再次在平板上进行划线纯化培养，获得杨树土壤细菌菌株，并4℃保存备用。
3)将活化的欧美杨溃疡病菌(由中国林业微生物菌种保藏管理中心提供的，保藏编号为CFCC 11195)接种于LB液体培养基中于30℃恒温摇床中，200rpm条件下培养24h，制得欧美杨溃疡病菌种子液(OD600值为1.90)；
4)在将加热融化后冷却至40℃-50℃的灭菌LB固体培养基倒入培养皿时混合欧美杨溃疡病菌种子液，制成混合有欧美杨溃疡病菌的LB培养基平板，在培养皿中央分别采用点涂抹法接种步骤2)分离所得的杨树土壤细菌菌苔，放置于培养箱中，30℃恒温倒置培养，每个实验平行重复3次。
5)每天观察并记录拮抗菌菌落周围抑菌圈的有无以及直径大小，选出对欧美杨溃疡病菌具有最强抑菌效果，抑菌圈直径最大的杨树根际细菌。
观察结果表明：XZQ-20菌株的抑菌效果最好，抑菌圈直径最大，抑菌圈直径≥11.75±1.06mm。
本发明的深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20的筛选及防治植物病原细菌采用的培养基如下：
LB固体平板培养基成分：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，15g琼脂粉，去离子水调节总体积为1000mL，pH 7.0-7.2。灭菌后冷却倒平板待用。
LB液体培养基成分：10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g NaCl，去离子水调节总体积为1000mL，pH 7.0-7.2。
Modified Landy培养基(MLM液体培养基))成分：20g葡萄糖，2g酵母提取物，5g L-谷氨酸，2g KH2PO4，0.16mg CuSO4，0.5g MgSO4·7H2O，0.15mg FeSO4，0.5g KCl，0.835gNH4Cl，3.083g NaCl，1.077g NaNO2，1g(NH4)2SO4，45mgMnSO4·H2O，去离子水调节总体积为1000mL，pH自然。灭菌后冷却待用。
NB培养基成分：10g蛋白胨，3g牛肉膏，5g NaCl，蒸馏水调节总体积至1000mL，pH7.0-7.2。灭菌后冷却待用。
脱脂牛奶培养基：50g脱脂奶粉，15g琼脂，去离子水调节总体积为1000mL，pH 7.2-7.4。灭菌后冷却倒平板待用。
本发明的深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20的培养特性：
本发明的深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20生长温度范围为10℃～41℃，最适生长温度范围为30℃～37℃；生长pH范围为4～9，最适生长pH范围为6～7；能在0.5％-2％的NaCl浓度的NB培养基中生长。能氧化甘露醇、D-木糖，产酸；能氧化葡萄糖，且产气，氧化酶实验呈阳性，V-P实验呈阴性，具有水解淀粉、卵磷脂的能力，不能水解苯丙氨酸，能利用柠檬酸盐，硝酸盐还原能力呈阳性，能产生硫化氢，能液化明胶。
根据《常见细菌鉴定手册》，对照菌株XZQ-20的形态特征、生理生化特性以及系统发育树分析鉴定菌株XZQ-20为Paenibacillus属菌株，并根据Paenibacillus属中部分模式种的文献所述生理生化特性以及16S rDNA序列比对，确认本发明菌株为深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20。
本发明还包括以上述用于拮抗植物病原菌的菌株深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20，微生物保藏号为CGMCC NO.12556的培养物、细菌菌株的菌液、发酵培养液及培养液的过滤液。
以上述深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20为活性成分的生物制剂也属于本发明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。
本发明的细菌菌株还包括上述拮抗菌的菌株Paenibacillus profundus XZQ-20的突变体、变异体或其各种代谢产物、衍生物。
本发明的细菌菌株Paenibacillus profundus XZQ-20在拮抗欧美杨溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃黑斑病菌中的应用。
本发明的细菌菌株Paenibacillus profundus XZQ-20的培养物、菌株菌液、菌株发酵培养液、发酵培养液的过滤液在拮抗欧美杨溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃黑斑病菌等植物病原菌中的应用。
包括将本发明拮抗菌Paenibacillus profundus XZQ-20进行培养，得到细菌菌株、菌株培养物、发酵培养液、发酵培养液过滤后的过滤液；用所得的菌株培养物或发酵培养液、发酵培养液过滤后的过滤液抑制欧美杨溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃黑斑病菌的生长。
本发明的细菌菌株Paenibacillus profundus XZQ-20在防治由欧美杨溃疡病菌引起的欧美杨溃疡病；由核桃黑斑病菌(Xanthomonas juglandis)引起的核桃黑斑病；由白菜软腐病菌(Erwinia carotovora)引起的白菜软腐病；由猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonassyringae)引起的猕猴桃溃疡病中的应用。
本发明的细菌菌株Paenibacillus profundus XZQ-20的培养物、菌株菌液、菌株发酵培养液、发酵培养液的过滤液在在防治由欧美杨溃疡病菌引起的欧美杨溃疡病；由核桃黑斑病菌(Xanthomonas juglandis)引起的核桃黑斑病；由白菜软腐病菌(Erwiniacarotovora)引起的白菜软腐病；由猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae)引起的猕猴桃溃疡病中的应用。
将本发明拮抗菌Paenibacillus profundus XZQ-20接种于液体培养基中，进行培养，培养得到的培养物、发酵培养液或发酵培养液的过滤液用于拮抗欧美杨溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃黑斑病菌的处理，其中，所述液体培养基为ModifiedLandy培养基(MLM)。
Modified Landy培养基(MLM)成分：每1000mL培养基含有葡萄糖20g，酵母提取物2g，L-谷氨酸5g，KH2PO4 2g，CuSO4 0.16mg，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO40.15mg，KCl 0.5g，NH4Cl 0.835g，NaCl 3.083g，NaNO2 1.077g，(NH4)2SO4 1g，MnSO4·H2O 45mg，去离子水调节总体积为1000mL，pH自然。高压灭菌后备用。
本发明的拮抗菌深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20在产生蛋白酶中应用。
深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20能产生蛋白酶。
本发明细菌菌株通过下述蛋白酶检测培养基培养，产生蛋白酶：其中检测产生蛋白酶的固体培养(脱脂牛奶培养基)：50g脱脂奶粉，15g琼脂，去离子水调节总体积为1000mL，pH 7.2-7.4。灭菌后冷却倒平板待用。
包括将细菌菌株接种于含有脱脂奶粉的培养基中，进行培养，菌株生长，产生蛋白酶，降解植物病原菌细胞壁，抑制病原菌生长。
将深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20细菌菌株进行培养，得到菌株的菌液、菌株培养物、发酵培养液及其过滤后的过滤液；用所得的菌株的菌液、发酵培养液、过滤后的过滤液中产生蛋白酶，降解病原菌细胞壁，抑制病原菌欧美 杨溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃黑斑病菌的生长，拮抗植物病原细菌。
本发明的深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20能显著降低欧美杨溃疡病菌的生长及繁殖速率，拮抗菌XZQ-20发酵培养液的过滤液对欧美杨溃疡病菌的生长及繁殖具有较高抑制水平，与液体LB培养基以1:10(V/V)混合后能保持100％的抑菌效果，与液体LB培养基以1:20(V/V)混合时也可保持28.28％的抑制率，表明拮抗菌XZQ-20对欧美杨溃疡病菌的菌体生长率抑制明显，显著降低其生长量。
本发明的深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20能有效抑制欧美杨溃疡病菌的生长，具有很好的防治由欧美杨溃疡病菌引起的欧美杨溃疡病的植物病害的潜力，同时，对猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌以及核桃黑斑病菌有很好的平板抑菌活性，能产生蛋白酶。深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20作为生物防治菌株，具有防治由欧美杨溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌以及核桃黑斑病菌引起的植物病害的潜力，为防治欧美杨溃疡病、猕猴桃溃疡病、白菜软腐病以及核桃黑斑病提供了一条环保、简单且有效的途径，利于环境保护。
附图说明
图1为本发明深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20菌株对欧美杨溃疡病菌的平板拮抗效果图。
图2为本发明深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20的菌落形态图，其中，A为Paenibacillus profundus XZQ-20菌株在LB培养基上的培养形态；B为Paenibacillus profundus XZQ-20菌株革兰氏染色后的阳性观察结果(10×100)。
图3为本发明深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20基于16SrDNA序列构建的系统发育树；图中拉丁名后为相应菌株在Genbank的编号。
图4为本发明深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20在脱脂牛奶培养基平板上产生蛋白酶降解蛋白质形成明显的透明圈的效果图。
图5为本发明深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20菌株对多种植物病原细菌平板拮抗效果图；其中，A为拮抗菌XZQ-20对猕猴桃溃疡病菌的抑制 效果；B为XZQ-20对白菜软腐病菌的抑制效果；C为XZQ-20对核桃黑斑病菌的抑制效果。
图6为本发明深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20无菌滤液对欧美杨溃疡病菌的平板拮抗试验效果图。
图7为本发明深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20无菌滤液对欧美杨溃疡病菌的梯度抑菌试验效果图，其中，A为CK-1，即在LB液体培养基中加入与XZQ-20无菌滤液等体积的MLM液体培养基的空白培养基；B为CK-2，即在LB液体培养基中加入与XZQ-20无菌滤液等体积的MLM液体培养基，并接种欧美杨溃疡病菌；C、D、E、F、G、H分别为本发明拮抗菌Paenibacillus profundusXZQ-20的无菌滤液与LB液体培养基体积之比分别为1:1、1:2、1:3、1:5、1:10、1:20的抑菌效果。
图8为本发明深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20无菌滤液对多种植物病原细菌的平板拮抗效果图；其中，A为拮抗菌XZQ-20无菌滤液对猕猴桃溃疡病菌的抑制效果；B为XZQ-20对白菜软腐病菌的抑制效果；C为XZQ-20对核桃黑斑病菌的抑制效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
下述实施例中的方法，无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，无特殊说明，均为质量百分含量。
本发明实施例中OD600值的测定选择在600nm波长下用分光光度计测定。
实施例1本发明的深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20的分离、筛选及其鉴定
1、深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20的分离与筛选
本发明的菌株采集自北京市海淀区北京林业大学校园内杨树根际土壤中。
1A)取杨树根际土层厚度为5-25cm处的土壤5g，置于盛有45mL无菌水的三角瓶中，于摇床上在28℃下、180rpm、振荡30min，静置，得到的菌悬液(即为10-1的土壤稀释液，也就是稀释10倍的土壤溶液)；接着用10倍梯度稀释法依次稀释得到10-3、10-4、10-5浓度梯度的稀释液；然后从各个浓度梯度悬浮液中分别取0.1mL，用无菌涂布棒分别涂于LB培养基平板上，以无菌水为对照，涂抹均匀后放到恒温箱中30℃恒温倒置培养；
1B)连续观察8天后，挑取菌落形态不同的菌株，再次在平板培养基上进行划线纯化培养，获得多株杨树根际土壤细菌菌株，并4℃保存备用。
1C)挑取一菌环活化后的欧美杨溃疡病菌(由中国林业微生物菌种保藏管理中心提供，保藏编号CFCC 11195，拉丁名：Lonsdalea quercina)接种于装有40mL LB培养基的100mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于30℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得欧美杨溃疡病菌种子液(OD600值为1.90)；
1D)在加热融化后冷却至40℃-50℃的灭菌LB培养基(每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉17g，pH 7.0-7.2)中，以1％(V/V)比例混合欧美杨溃疡病菌种子液，倒入培养皿中，倒平板，在培养皿中央点涂抹法接种，放置于培养箱中，30℃恒温倒置培养，每个实验平行重复3次。
1E)每天观察，直到能清晰观察到抑菌圈时测量抑菌圈直径的大小，选出对欧美杨溃疡病菌具有最强抑制效果的1株杨树根际土壤菌株。
结果表明XZQ-20菌株的抑菌效果最好，抑菌圈直径最大，抑菌圈直径≥11.75±1.06mm，如图1所示。
2、深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20鉴定
参照东秀珠等人编著的《常见细菌系统鉴定手册》(北京:科学出版社，2001:349-398)以及蔡妙英等人编著的《芽孢杆菌属》(北京:农业出版社，1983:19-108)中介绍的方法以及16S rDNA对Paenibacillus profundus XZQ-20菌株进行鉴定，鉴定出该菌株属于深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)。
2A)深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20在LB培养基(每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉15g，去离子水1000ml，pH 7.0-7.2)平板上呈乳白色，不透明，菌落圆形、光滑，边缘隆起、完整，菌体粘 稠，如图2A所示。
2B)通过显微镜观察表明Paenibacillus profundus XZQ-20菌体大小约0.80-2.03μm×2.75-7.49μm，有芽孢，具鞭毛，革兰氏染色呈阳性，如图2B所示。
2C)生化实验结果表明，Paenibacillus profundus XZQ-20，兼性厌氧，氧化酶实验呈阳性，V-P实验呈阴性，具有水解淀粉、卵磷脂的能力，不能水解苯丙氨酸，能利用柠檬酸盐，能进行硝酸盐还原，能产生硫化氢，能液化明胶。依据《常见细菌鉴定手册》，进一步对Paenibacillus profundus XZQ-20菌株的形状、大小、其他生理生化反应进行检测，明确形态和基本生理生化特性。本发明的Paenibacillus profundus XZQ-20菌株的形态和基本生理生化特征如表1所示。
表1 Paenibacillus profundus XZQ-20菌株的形态和基本生理生化特性
注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。
2D)挑取少量单菌落，放入盛有500μL无菌水的EP管中，100℃煮沸10min后，离心(12000rpm、2min),取上清，4℃保存，即为菌株XZQ-20的基因组DNA。以菌株XZQ-20的基因组DNA为模板，采用如下引物
fD1：5’-ccgaattcgtcgacaacagagtttgatcctggctcag-3’
rD1：5’-cccgggatccaagcttaaggaggtgatccagcc-3’
(参见William G.Weisburg等，16S Ribosomal DNA Amplification forPhylogenetic Study，Journal of Bacteriology，1991,173(2)：697-703)进行PCR扩增，扩增体系为25μL，含有2×ES Taq MasterMix 12.5μL、正反向引物各1μL、DNA模板1μL，最后用去离子灭菌超纯水调整反应总体积为25μL。扩增条件：94℃3min；94℃1min，52℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min，最后系统温度降至4℃，反应结束。
PCR扩增产物由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，PCR扩增出约为1500bp左右的产物片段，测序结果表明序列全长为1481bp，具有序列表中序列3的核苷酸序列。将该序列经Chromas序列拼接软件校正，在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)基因库进行同源性比对分析，并在GenBank上下载类芽孢杆菌属中的模式菌株序列数据矩阵，采用MEGA6.0软件用邻解法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，并重复推导以评估各分支的可靠性。菌株系统发育树见附图3。
通过在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)基因库进行同源性比对分析，发现菌株XZQ-20与Paenibacillus profundus的同源性最高。结合菌株的形态特征、生理生化特性以及系统发育树分析(见图3)，发现菌株XZQ-20与菌株Paenibacillus profundus Sl79(AB712351)亲缘性最近，并聚在同一分支中，表明该菌株为Paenibacillus profundus，并命名为深层类芽孢杆菌。
本发明的深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20菌株已于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,北京市朝阳区北辰西路)，中国科学院微生物研究所；保藏号为CGMCC NO.12556。
实施例2本发明的深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20生物学特性的探究
1A)将斜面活化后的深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20菌株挑取一菌环(接种菌环)，接种到装有100mL LB液体培养基(每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0-7.2)的250mL的三角瓶中，然后于30℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得Paenibacillus profundus XZQ-20菌株种子液，其中，Paenibacillusprofundus XZQ-20菌株种子液的OD600值约为1.564。
1B)按照1％(V/V)的接种量将Paenibacillus profundus XZQ-20菌株种子液接种到装有40mL的不同盐(NaCl)浓度、pH值的NB培养液的100mL三角瓶中，于 30℃，200rpm的条件下振荡培养2d后，分别吸取0.4mL的Paenibacillus profundusXZQ-20菌株种子液接入到装有40mL NB培养液的100mL的三角瓶中，分别置于不同温度,200rpm条件下振荡培养2d，然后分光光度计测定各个培养液的OD600值。测定结果如表2所示。
表2 Paenibacillus profundus XZQ-20菌株的生物学特性
注：“+++”表示生长最好，“++”表示生长较好，“+”表示生长好，“-”不能生长。
测定结果表明：Paenibacillus profundus XZQ-20菌株能在pH范围为4.0～8.0的条件下能够生长，在偏酸的条件下均生长良好，最适生长pH为6.0；菌株XZQ-20在20℃～40℃的条件下能够生长，其中最适生长温度温度范围为30℃～37℃；在NaCl浓度为0.5％～3％的NB培养基中菌株XZQ-20能够生长，最适生长NaCl浓度为2％。菌株的生物学特性如表2所示。
实施例3本发明的深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20菌株产蛋白酶能力的测定
1A)挑取一菌环活化后的深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20，点种于倒有脱脂牛奶培养基(每1000mL含有脱脂奶粉50g，琼脂15g，pH 7.2-7.4)的平板中央，然后将平板置于30℃的恒温培养箱中倒置培养，分别于1、3、5、7d后观察菌落周围及平板上的脱脂牛奶是否被分解而呈透明。有透明圈出现代表菌株能产蛋白酶，没有透明圈出现则代表菌株不能产生蛋白酶。
测定结果显示：拮抗菌Paenibacillus profundus XZQ-20菌株在脱脂牛奶培养平板 上能形成明显的透明圈(图4)，表明本发明的深层类芽孢杆菌(Paenibacillusprofundus)XZQ-20能产生蛋白酶，从而能降解病原菌细胞壁，抑制甚至杀死病原菌。
实施例4本发明的深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20对其他几种植物病原细菌的拮抗作用
1A)各挑取一菌环活化后的植物病原细菌(猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌和核桃黑斑病菌)，分别接种于装有40mL LB液体培养基(每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，pH 7.0-7.2)的100mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于30℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得三种植物病原细菌的种子液(即猕猴桃溃疡病菌种子液、白菜软腐病菌种子液、核桃黑斑病菌种子液，菌液OD600值分别为：0.17，2.01，1.85)，其中所述植物病原菌如表3所示；
表3 其他植物病原细菌的名称及来源
1B)分别吸取猕猴桃溃疡病菌种子液、白菜软腐病菌种子液、核桃黑斑病菌种子液混入到灭菌后，加热融化并冷却至40℃-50℃的LB固体培养基中，其中，猕猴桃溃疡病菌种子液、白菜软腐病菌种子液、核桃黑斑病菌种子液分别与LB固体培养基的体积之比为1:100(V/V)，混匀后分别倒平板(即倒入培养皿中)，待平板冷却凝固后，分别制成混合有猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃黑斑病菌的LB固体培养基平板，接着用接种环挑取少许活化后的本发明拮抗菌XZQ-20点涂抹接种在平板上，放置于培养箱中，30℃恒温倒置培养，每个实验平行重复3次。
1C)每天观察，直至能清晰观察到抑菌圈时，测量抑菌圈直径并记录。
结果表明，拮抗菌XZQ-20菌株对猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌和核桃黑斑病菌均具有良好的抑菌效果(如图5)，对猕猴桃溃疡病菌的抑菌圈直径为13.3±2.26mm，对白菜软腐病菌的抑菌圈直径为16.75±0.07mm，对核桃黑斑病菌的抑菌圈直径为 7.55±1.06mm(表4)。
表4 Paenibacillus profundus XZQ-20对几种植物病原细菌的平板拮抗作用
| 病原菌 | 猕猴桃溃疡病菌 | 白菜软腐病菌 | 核桃黑斑病菌 |
| 抑菌圈直径/(mm) | 13.3±2.26 | 16.75±0.07 | 7.55±1.06 |
实施例5本发明的Paenibacillus profundus XZQ-20的无菌滤液对欧美杨溃疡病菌的拮抗作用
1A)挑取一菌环活化后的深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20，接种于装有100mL LB液体培养基的250mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于30℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得Paenibacillus profundus XZQ-20菌株种子液(即XZQ-20菌液)，其中，Paenibacillus profundus XZQ-20菌株种子液的OD600值约为1.564，备用；
1B)按照1％(V/V)的接种量，将步骤1A)中制备的XZQ-20菌株种子液接种到装有100mL MLM液体培养基中(每1000mL含有葡萄糖20g，酵母提取物2g，L-谷氨酸5g，KH2PO4 2g，CuSO4 0.16mg，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4 0.15mg，KCl 0.5g，NH4Cl 0.835g，NaCl 3.083g，NaNO2 1.077g，(NH4)2SO4 1g，MnSO4·H2O45mg，去离子水适量，pH自然)的500mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于30℃，200rpm的条件下振荡培养5d，将培养后的滤液在4℃，12000rpm的条件下离心25min，收集上清液，上清液通过0.45μm细菌滤膜过滤除菌，得到本发明的深层类芽孢杆菌XZQ-20无菌滤液，备用；
1C)挑取一菌环活化后的欧美杨溃疡病菌，接种于装有40mL LB液体培养基的100mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于30℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得欧美杨溃疡病菌种子液(OD600值为1.90)；
1D)在加热融化并冷却至40℃-50℃的LB固体平板培养基中以1％(V/V)的比例混合1C)制备的欧美杨溃疡病菌种子液，混合均匀后倒平板(即倒入培养皿中)，待平板冷却凝固后，将无菌的6mm滤纸片置于平板上，然后分别向滤纸片上逐滴滴加40μL步骤1B)制备的XZQ-20无菌滤液，倒置于培养箱中，30℃恒温倒置培养，2天后观察滤纸片周围的透明圈大小及直径并记录，每个实验平行重复3次；
1E)吸取步骤1B)制备的XZQ-20无菌滤液混入灭菌的LB液体培养基中，其 中XZQ-20无菌滤液与LB液体培养基的体积比分为1:1、1:2、1:3、1:5、1:10、1:20(V/V)，振荡混合均匀，接着向XZQ-20无菌滤液和LB液体培养基的混合液中分别加入40μL步骤1C)制备的欧美杨溃疡病菌种子液，作为处理组；
对照组CK-1为在LB液体培养基中加入与XZQ-20无菌滤液等体积的MLM液体培养基的空白培养基；对照组CK-2为在LB液体培养基中加入与XZQ-20无菌滤液等体积的MLM液体培养基，振荡混匀后分别加入40μL步骤1C)制备的欧美杨溃疡病菌种子液；
每个处理3个重复，于30℃恒温摇床中200rpm培养1d；然后通过分光光度计测定处理组与对照组培养液的最终OD600值，并计算抑菌率，抑菌率的计算采用公式如下：
抑菌率＝(对照组CK-2的OD600值-处理组的OD600值)/对照组CK-2的OD600值×100％。
其中，OD600值的测定选择在600nm波长下用分光光度计测定。
测定结果表明：拮抗菌Paenibacillus profundus XZQ-20的无菌滤液对欧美杨溃疡病菌有明显抑菌效果，无菌滤液培养两天后平板上的抑菌圈直径达8.18±0.75mm(如图6)；进一步测定了拮抗菌XZQ-20无菌滤液在液体培养中对欧美杨溃疡病的抑菌效果，结果显示拮抗菌XZQ-20无菌滤液与LB培养基以1:1、1:2、1:3、1:5、1:10(V/V)比例混合后，欧美杨溃疡病菌不生长，对欧美杨溃疡病菌的抑制效果达到100％；以1:20(V/V)比例混合时，通过测定菌液的OD600值，发现在混合比例在1:20(V/V)时，拮抗菌XZQ-20无菌滤液对欧美杨溃疡病菌的抑制效果为28.28％(表5)。表明拮抗菌XZQ-20无菌滤液对欧美杨溃疡病菌的生长具有较好的抑制作用(如图7)。
表5 Paenibacillus profundus XZQ-20无菌滤液对欧美杨溃疡病菌的抑制效果
实施例6深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20无菌滤液对其他几种植物病原细菌的平板拮抗作用
1A)挑取一菌环活化后的深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20，接种于装有100mL LB液体培养基的250mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于30℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得Paenibacillus profundus XZQ-20菌株种子液(即XZQ-20菌液)，其中，Paenibacillus profundus XZQ-20菌株种子液的OD600值约为1.564，备用；
1B)按照1％(V/V)的接种量，将步骤1A)中的XZQ-20菌株种子液接种到装有100mLMLM液体培养基(每1000mL含有葡萄糖20g，酵母提取物2g，L-谷氨酸5g，KH2PO4 2g，CuSO40.16mg，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4 0.15mg，KCl 0.5g，NH4Cl 0.835g，NaCl 3.083g，NaNO21.077g，(NH4)2SO4 1g，MnSO4·H2O 45mg，去离子水适量，pH自然)的500mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于30℃，200rpm的条件下振荡培养5d，将培养后的滤液在4℃，10000rpm的条件下离心25min，收集上清液，上清液通过0.45μm细菌滤膜过滤除菌，得到本发明的深层类芽孢杆菌XZQ-20无菌滤液，备用；
1C)分别挑取一菌环活化后的猕猴桃溃疡病菌、核桃黑斑病菌、白菜软腐病菌，分别接种于装有40mL LB液体培养基的100mL的三角瓶中，然后将三角瓶置于摇床上，于30℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得三种植物病原细菌种子液(即猕猴桃溃疡病菌种子液、白菜软腐病菌种子液、核桃黑斑病菌种子液，菌液OD600值分别为：0.17，2.01，1.85)；
1D)分别吸取猕猴桃溃疡病菌种子液、白菜软腐病菌种子液、核桃黑斑病菌种子液混入到灭菌后，加热融化并冷却至40℃-50℃的LB平板固体培养基中，其中，猕猴桃溃疡病菌种子液、白菜软腐病菌种子液、核桃黑斑病菌种子液与LB固体培养基的体积之比为1:100(V/V)，混匀后分别倒平板(即倒入培养皿中)，待平板冷却凝固后，分别制成混合有猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃黑斑病菌的LB固体培养基平板；接着，将无菌的6mm滤纸片分别置于平板中央上，然后分别向滤纸片上逐滴滴加40μL步骤1B)制备的XZQ-20无菌滤液，倒置于培养箱中，30℃恒温倒置培养，2天后观察滤纸片周围的透明圈大小及直径并记录，每个实验平行重复3次。
测定结果表明，拮抗菌XZQ-20的无菌滤液对猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌和核桃黑斑病菌均有较好的抑菌作用(如图8、表6)，对猕猴桃溃疡病菌抑菌圈直径达到7.63±0.88mm，对白菜软腐病菌抑菌圈直径达到8.03±0.93mm，对核桃黑斑病菌抑菌圈直径达到8.60±0.53mm。表明拮抗菌XZQ-20能防治由多种病原细菌引起的植物细菌病害。
表6 Paenibacillus profundus XZQ-20无菌滤液对多种植物病原细菌的平板拮抗活性
| 病原菌 | 猕猴桃溃疡病菌 | 白菜软腐病菌 | 核桃黑斑病菌 |
| 抑菌圈直径/(mm) | 7.63±0.88 | 8.03±0.93 | 8.60±0.53 |
Claims (14)
1.一株拮抗植物病原细菌的细菌菌株深层类芽孢杆菌(Paenibacillus profundus)XZQ-20，其微生物保藏号为CGMCC No.12556。
2.如权利要求1所述的深层类芽孢杆菌XZQ-20，其特征是，所述植物病原细菌为欧美杨溃疡病菌(Lonsdalea quercina)、猕猴桃溃疡病菌(Pseudomonas syringae)、白菜软腐病菌(Erwinia carotovora)、核桃黑斑病菌(Xanthomonas juglandis)。
3.一种由权利要求1所述的深层类芽孢杆菌XZQ-20制备得到的菌株培养物。
4.一种由权利要求1所述的深层类芽孢杆菌XZQ-20制备得到的菌株发酵培养液。
5.一种由权利要求1所述的深层类芽孢杆菌XZQ-20制备得到的菌株发酵培养液的过滤液。
6.以权利要求1所述的深层类芽孢杆菌XZQ-20为活性成分的生物菌剂。
7.如权利要求1所述的深层类芽孢杆菌XZQ-20在拮抗欧美杨溃疡病菌中的应用。
8.如权利要求1所述的深层类芽孢杆菌XZQ-20在拮抗植物病原细菌中的应用，其中，所述的病原细菌为猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃黑斑病菌。
9.如权利要求3所述的菌株培养物在拮抗病原细菌中的应用，其中，所述病原细菌为欧美杨溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃黑斑病菌。
10.如权利要求9所述的应用，其特征是，包括将权利要求1所述的深层类芽孢杆菌XZQ-20进行培养，得到菌株培养物；用所得的菌株培养物抑制欧美杨溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃黑斑病菌的生长。
11.如权利要求4所述的菌株发酵培养液在拮抗病原细菌中的应用，其中，所述病原细菌为欧美杨溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃黑斑病菌。
12.如权利要求5所述的菌株发酵培养液的过滤液在拮抗病原细菌中的应用，其中，所述病原细菌为欧美杨溃疡病菌、猕猴桃溃疡病菌、白菜软腐病菌、核桃黑斑病菌。
13.如权利要求1所述的深层类芽孢杆菌XZQ-20在产生蛋白酶中的应用。
14.如权利要求13所述的应用，其特征是，包括将深层类芽孢杆菌XZQ-20接种于含有脱脂奶粉的培养基中，进行培养，菌株生长，产生蛋白酶，其降解植物病原菌细胞壁，抑制病原菌生长。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| TR01 | Transfer of patent right |