CN103436457A - 一种双向伯克霍尔德氏菌及其培养方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双向伯克霍尔德氏菌及其培养方法和应用，属于植物保护（微生物农药）领域。所述双向伯克霍尔德氏菌保藏编号为CGCC No.5384；其培养方法是在发酵条件下：LB培养基，装液量50ml，加入1ml 2d龄种子菌株，以200r/min在25～30℃条件下培养20～24h；该菌对水稻纹枯病菌、稻瘟病菌、香蕉炭疽病菌、枯萎病菌、小麦赤霉病菌、荔枝霜疫霉菌、甘蔗黑腐病菌、番茄叶霉病菌、水稻白叶枯病菌、细菌性条斑病菌等具有显著的抑制作用，可用于植物病原菌的生物防治，且具备低毒、易降解、对环境友好等优点，应用前景广阔。

Description

一种双向伯克霍尔德氏菌及其培养方法和应用

技术领域

本发明属于植物保护（微生物农药）领域，具体涉及一种双向伯克霍尔德氏菌及其培养方法和应用。

背景技术

植物病原菌（包括真菌、细菌、病毒等）引起的植物病害给农业生产造成了重大的经济损失。目前，防治水稻、香蕉等重要植物病害的主要方法是使用杀菌剂。但是杀菌剂的大量使用具有增加病原菌抗药性的风险，并且会对环境造成严重的污染，对人畜健康也构成威胁，而生物防治是一种对环境友善的防治植物病害的新途径。

植物周围不仅存在病原菌，还存在着大量的非病原菌，其中有的还是病原菌的拮抗微生物。这些拮抗微生物可通过与病原菌的抗生作用、竞争作用、重寄生作用及诱导植物产生系统抗性等机理来抑制病原菌，达到防治植物病害的目的。此外，拮抗微生物对环境安全，不像化学农药那样会造成环境污染以及对人畜的毒害，同时拮抗微生物不易使病原菌产生耐药性，有些还具有促进植物生长的作用，且实际生产工艺简单。因此，利用拮抗微生物来防治植物病害的研究越来越受到国内外的重视。目前，人们已经分离到多种对各种不同植物病害有不同程度防治效果的拮抗微生物，其中有些已经进入实际应用阶段，产生了相当可观的社会效益和环境效益。

目前对伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）的研究已较多，主要集中在应用该属内的菌株产生酶或用于治理环境污染，如以下专利文献：公开号1195373（日本，中山美香等，公开日2004/03/24）的降解卤代烃的微生物及应用；公开号1484703（日本，早出广司，公开日2004/03/24）的葡萄糖脱氢酶和生产该脱氢酶的方法；公开号1867676（日本，山口将宪等，公开日2006/11/22）的鲨肌醇的制备方法；公开号101198695（德国，贝赛林等，公开日2008/06/11）的生产脂肪酶的方法；公开号101153272（中国，盛下放等，公开日2008/04/02）的一种铅镉抗性细菌及其用于土壤重金属污染的植物修复方法；公开号102046778A（日本，古贺一治、增田绅吾，公开日2011/05/04）的降低植物体中的重金属含量的细菌；公开号101671636（中国，郭军康等，公开日2010/03/17）的一种抗重金属植物促生菌制剂及其施用方法。但以上文献都没有涉及到植物病原菌生物防治的相关应用。

在植物病害的生物防治方面，任嘉红等发现吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007对杨树溃疡病具有防治效果（任嘉红等，吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007抗菌蛋白的分离纯化，微生物学通报，2010-06-20；任嘉红等，吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007的发酵条件及其对杨树溃疡病的防治效果，中国生物防治，2010-08-08；叶建仁等，一种吡咯伯克霍尔德氏菌及其在防治杨树溃疡病中的应用，中国专利，2009-10-14；）；查传勇发现双向伯克霍尔德氏菌Lu10-1能够产生抗菌活性物质（查传勇等，双向伯克霍尔德氏菌Lu10-1产生抗菌活性物质的发酵培养基和发酵条件优化，蚕业科学，2009-06-15）；林善海等发现伯克霍尔德氏菌对香蕉褐缘灰斑病具有防治效果（林善海等，拮抗伯克霍尔德氏菌对香蕉褐缘灰斑病的生物防治试验，中国植物病理学会2007年学术年会论文集，2007-08-01）。

虽然目前研究已表明伯克霍尔德氏菌可用于拮抗某些植物病原菌，但是筛选、鉴定对植物病原菌抑制作用显著的拮抗微生物，以及对该种微生物进行大规模培养和应用仍是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中各种植物病原真菌和细菌引起的植物病害化学药剂防治副作用大、生物防治药物缺乏的缺陷，提供一种可抑制包括香蕉炭疽病菌和水稻纹枯病菌在内的多种植物病原菌的广谱生防菌株。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种双向伯克霍尔德氏菌，分类命名为：双向伯克霍尔德氏菌Burkholderia cepacia，于2011年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号 CGCC No.5384。该菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了一种生物菌剂，该生物菌剂含有上述双向伯克霍尔德氏菌或含有上述双向伯克霍尔德氏菌发酵液（即培养液）经过滤后的无菌滤液，所述无菌滤液优选用上述双向伯克霍尔德氏菌培养液经过离心取得的上清再经过细菌过滤器过滤获得。

该双向伯克霍尔德氏菌的培养方法是，发酵条件下：LB培养基（蛋白胨：10g/L、酵母浸粉：5g/L等,NaCl：10g/L、pH：7.0-7.2），装液量50mL，加入1mL 2天龄的种子菌株（即每50mL LB培养基接种1mL2天龄的种子菌株），以200r/min在25～30℃条件下培养20～24h。

上述双向伯克霍尔德氏菌在防治植物病原真菌和/或植物病原细菌引起的植物病害中的应用，以及在制备防治植物病原真菌和/或细菌引起的植物病害菌剂中的应用。所述植物病原真菌为水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、小麦赤霉病菌（Gibberella zeae）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）、荔枝霜疫病菌（Peronophythora litchii）、甘蔗黑腐病菌（Ceratocystis adiposum）或番茄叶霉病菌（Fulvia fulva）；所述植物病原细菌为水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）或水稻细菌性条斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola）。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

经过实验证实，本发明的双向伯克霍尔德氏菌SD7的无菌发酵滤液对水稻纹枯病菌菌丝的抑制率为88.79%，对菌核萌发的抑制率为90%；离体实验表明对水稻纹枯病的防效达90.0%，对苗期水稻纹枯病的防效为53.7%；同时，对香蕉果实炭疽病的室内生防效果也达52.12%；对稻瘟病菌、小麦赤霉病菌、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉、甘蔗黑腐病菌和番茄叶霉病菌、水稻白叶枯病菌及水稻细菌性条斑病菌均具有抑制作用。上述结果提示该菌株是一种对多种植物病原菌都具有强烈抑制作用的广谱生防菌株，同时其具有对人畜无害、绿色安全、环境兼容性好、不容易产生抗性等优点，因此应用前景十分广阔。

附图说明

图1.SD7菌株在LB培养基上的培养形态。

图2.SD7菌株的16S rDNA序列与相近菌株序列的系统发肓树。

图3.双向伯克霍尔德氏菌SD7对香蕉果实炭疽病的防治效果，其中1为只接种炭疽病菌的对照组CK1，2～5为双向伯克霍尔德氏菌SD7的无菌滤液处理后又接种炭疽病菌的实验组，6～7为仅加入双向伯克霍尔德氏菌SD7无菌滤液的对照CK2。

图4.双向伯克霍尔德氏菌SD7发酵液对水稻纹枯病的防效实验结果，其中1为SD7无菌液，2为SD7菌液，3为LB培养液，4为井冈霉素，5为无菌水对照。

具体实施方式

实施例1 双向伯克霍尔德氏菌SD7的筛选及鉴定

1、菌株的筛选

（1）土壤样品的采集

本实验从华南农业大学农场果园采集土样，根据采集地的地形等采用5点取样，取样深度为耕作层或地表以下15cm，取样量200～250g，将每个地点采集的5个样本均匀混合，装入灭菌的封口聚乙烯袋，带回实验室马上分离。

（2）样品悬浮液的制备

将土壤样品加入灭菌水中激烈震荡。样品:水＝1:9（质量与体积比），如：10g土壤加入装有90mL灭菌水的三角瓶中所得悬浮液浓度为10^-1。每种样品各准备5支装有9mL灭菌水的试管按10倍梯度稀释法，将上述浓度为10^-1的悬浮液稀释成10^-2 ～10^-6的系列浓度悬浮液，即从1号试管中吸取1mL悬浮液放入2号试管（盛有9mL灭菌水）中，充分震荡混匀，再从2号试管中吸取1mL悬浮液放入3号试管（盛有9mL灭菌水）中，依次类推，直至第6支试管为止。

（3）分离方法

采用LB培养基（蛋白胨：10g/L、酵母浸粉：5g/L等,NaCl：10g/L、pH：7.0-7.2）。用移液器分别吸取上述不同稀释度的溶液0.5mL，滴加于培养基平板上（3平板/稀释度），用灭菌的L型玻棒涂布均匀，稍晾干，作好标记和日期，培养皿倒置，于25～30℃温箱中培养20～24h，将平板上长出的单菌落挑出到新的培养基上纯化培养，对全部分离到的菌株（称为待测菌株）进行编号，然后对其拮抗活性进行初筛和复筛，以获得本专利菌株。

（4）拮抗菌的初筛和复筛

采用平板对峙培养法，检测上述各种待测菌株对水稻纹枯病菌和香蕉炭疽病菌等病原菌的抑菌活性。用打孔器在培养好的水稻纹枯病菌和香蕉炭疽病菌等病原菌的菌落边缘打取直径5mm的菌丝块，接种在PDA平板中央，再将已经活化的各种待测菌株接种在水稻纹枯病菌或香蕉炭疽病菌等病原菌的菌丝块周围2～3cm处，每个PDA平板接种4个待测菌株，设置不接种待测菌株的对照，每处理3次重复。在25～30℃下培养20～24h，然后测量待测菌株与水稻纹枯病菌或香蕉炭疽病菌等病原菌之间的抑菌带宽度，作为拮抗活性强弱的指标。

经过上述初筛和复筛，获得一株对水稻纹枯病菌和香蕉炭疽病菌等多种病原菌具有强烈抑制作用的菌株，编号为SD7，保存备用。

SD7菌株的形态学和分子鉴定

（1）形态学观察

在LB培养基上培养48 h，菌落为圆形，乳白色，半透明，粘质，边缘较整齐，随着培养时间增长，菌落变厚，中间降起，且其菌体培养物较粘稠（图1）；液体LB培养能丰富生长、菌液较浑浊。

（2）分子生物学和生理生化鉴定

经PCR反应和特异片段的克隆测序，获得SD7菌株的16S rDNA序列（SEQ ID NO:1）；将SD7菌株的16S rDNA序列用Blast软件与从GenBank中搜索的已经登录的Burkholderia cepacia (DQ387437)、Burkholderia vietnamiensis (AY741147)、Burkholderia anthina(AJ420880)、Burkholderia cenocepacia(FJ810079)、Burkholderiamultivorans(AB222021)、Paenibacillus daejeonensis(NR025170)的16S rDNA序列进行同源性比较，构建系统发肓树（图2）。

根据《伯杰氏细菌学手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，测得SD7菌株的生理生化性状，实验结果如下（表1）。

表1 SD7菌株的生理生化性状

生理生化性状	反应
		反硝化	-
柠檬酸盐利用	+
		亮氨酸利用	+
洒石酸盐利用	-
		接触酶	+

注：+表标呈阳性；-表标呈阴性。

经过形态、生理生化性状及16S rDNA序列比对分析，最终将SD7菌株鉴定为双向伯克霍尔德氏菌Burkholderia cepacia。本发明简称双向伯克霍尔德氏菌SD7。

实施例2 双向伯克霍尔德氏菌SD7对植物病原菌的抑制作用

双向伯克霍尔德氏菌SD7对香蕉果实炭疽病的防治作用

（1）供试香蕉炭疽病菌菌株

用于接种的香蕉炭疽病菌（C. musae）系从发病的香蕉果实上分离纯化获得，并由本实验室保存。

（2）双向伯克霍尔德氏菌SD7对香蕉果实炭疽病的防治作用

2d龄的双向伯克霍尔德氏菌SD7菌株种子按每100mL LB培养基（蛋白胨：10g/L、酵母浸粉：5g/L等，NaCl：10g/L、pH：7.0-7.2）接种1mL种子的比例接种扩大培养，培养条件为：转速200 r/min、25～30℃培养20～24h后，离心后收集上清液，用细菌过滤器过滤，获得无菌滤液。选取七八成熟度的香蕉，用70%酒精进行表面消毒后，分别在上、中、下三个位置打孔作为加样孔。对照组（CK1）孔内只接种20μL的香蕉炭疽病菌孢子悬浮液；实验组孔内加入20μL双向伯克霍尔德氏菌SD7的无菌滤液，自然风干后再加入20μL的香蕉炭疽病菌孢子悬浮液；对照组（CK2）孔内只接种双向伯克霍尔德氏菌SD7菌液（目的是确定其是否对香蕉致病）。25～30℃保湿培养，5d后观察结果，测量病斑大小。每处理10个重复。

防治效果的计算方法：

防治效果（%）=[（CK1的病斑面积-实验组的病斑面积）/CK1的病斑面积]×100%

防治效果：双向伯克霍尔德氏菌SD7对香蕉果实炭疽病的防效为52.12%（图3）。

2、双向伯克霍尔德氏菌SD7菌株对水稻纹枯病的防治实验

（1）水稻纹枯病菌供试菌株

本实验用到的水稻纹枯病菌供试菌株GD-118为本实验室保存的强致病力菌株（参见文献：杨迎青等，水稻纹枯病菌原生质体制备与再生条件的优化，华中农业大学学报，2010年10月，第29卷第5期：546-551）。

（2）水稻离体叶片试验

剪取水稻成株叶片，取中部10cm长的叶段作为实验材料，分别进行以下处理：

SD7无菌液组：用SD7无菌滤液浸泡叶段10min，无菌滤液为25～30℃培养20～24h的双向伯克霍尔德氏菌SD7发酵液经过离心，上清液用细菌过滤器过滤所得的无菌液；

SD7菌液组：用25～30℃培养20～24h的双向伯克霍尔德氏菌SD7发酵液按10¹⁰CFU/ml的浓度浸泡叶段10min；

LB 培养液对照组：用灭菌的空白LB培养液浸泡叶段10min；

井冈霉素对照组：用浓度为40μg/ml的井冈霉素溶液浸泡叶段10min；

无菌水对照组（CK）：用无菌水浸泡叶段10min。

以上各组分别处理20片叶段，将处理后的叶段整齐摆放在铺垫有2层无菌纱布的塑料盆中，将5mm的水稻纹枯病菌供试菌株GD-118的菌丝块接种于叶段中部，其中CK不接种GD-118菌株。全部处理用保鲜膜密封保湿，置于25～30℃、光照条件下处理3d后调查发病叶片数和病级。病斑分级标准参照文献（周而勋等，广东省水稻纹枯病菌的致病力和融合群研究，广东农业科学，1999年第5期：36-38）的方法。即以病斑占叶片的面积将发病情况分为5级：不发病为0级；0～1/8（不包括1/8）为1级；1/8～1/4（不包括1/4）为2级；1/4～1/2（不包括1/2）为3级；1/2～3/4（不包括3/4）为4级；3/4及以上为5级。

实验结果：双向伯克霍尔德氏菌SD7发酵液防效高达90.0%（图4）。

（3）苗期水稻纹枯病的防治实验

将感病水稻品种武肓粳3号催芽播于白色的大面包箱中，每盆6排，每排10株，共播10盆。当水稻秧苗长到3叶1心时，采用谷粒接种体进行接种，即将稻谷粒平铺在接有菌株GD-118菌丝块的PDA培养平板上，待菌丝布满谷粒后，每株苗的基部接种2粒带菌稻谷。次日进行喷施处理，共设4个组，SD7菌液组喷施浓度为10¹⁰CFU/ml的菌液50mL，SD7无菌滤液组喷施无菌液（30℃培养24h的双向伯克霍尔德氏菌SD7发酵液经过离心，上清液经细菌过滤器过滤所得）50mL，井冈霉素对照组喷施浓度为40μg/ml井冈霉素溶液50mL，另外选择一组不做任何处理作为阴性对照。喷施后用塑料薄膜将水稻盖住，10d左右待对照发病到合适程度后调查水稻秧苗的发病率和相对病斑高度，并计算病级和病情指数。病害分级（9级）标准采用唐芳的方法（参考文献：唐芳.水稻纹枯病菌的致病力分化及遗传多样性研究.广州：华南农业大学硕士学位论文.2009：1-89），病情指数计算参照方中达的方法（参考文献：方中达.植病研究方法（第三版）.北京：中国农业出版社，1998：11-12）。病级和病情指数的计算公式如下：

病级=（病斑高度÷植株高度）×9级

病情指数=[∑（各级病株数×相应级数）/调查总数×最高级别值]×100

防治效果：双向伯克霍尔德氏菌SD7发酵液对水稻纹枯病的防效达53%（表2）。

表2双向伯克霍尔德氏菌SD7发酵液对水稻纹枯病的防治效果

处理组	发病率（%）	病情指数	防效（%）
				SD7菌液组	76.74	22.38d	53.73
SD7无菌滤液组	94.44	24.86c	48.60
				井冈霉素对照组	67.39	14.99e	69.00
无菌水对照组	100	48.37a	0

注：表中数据采用Duncan氏新复极差法（DMRT）进行差异显著性分析，同列数据后具有相同字母者表标在5%水平上（P=0.05）差异不显著。

双向伯克霍尔德氏菌SD7对多种植物病原真菌的抑制作用

（1）供试菌株

本实验所用的植物病原真菌和病原细菌均系由本实验室保存的菌株。

（2）对多种植物病原真菌的抑制作用

用灭菌的接种针将双向伯克霍尔德氏菌SD7菌株接种于PDA培养基平板一边，同时将稻瘟病菌（P. oryzae）、小麦赤霉病菌（G. zeae）、香蕉枯萎病菌（F. oxysporum f. sp. cubense）、香蕉炭疽病菌（C. musae）、荔枝霜疫霉（P. litchii）、甘蔗黑腐病菌（C.adiposum）和番茄叶霉病菌（C. fulvum）等病原真菌的菌丝接种于PDA培养基平板另一边进行对峙培养（一个平板中对应培养一种病原菌与双向伯克霍尔德氏菌SD7进行对峙），置生化培养箱中在25～30℃下培养20～24h，观察抑菌状况及抑菌圈大小（表4）。

（3）对两种植物病原细菌的抑制作用

用灭菌的接种针将双向伯克霍尔德氏菌SD7菌株接种于PSA平板中心，37℃下培养到菌落约为5mm大小（24～28 h）。在培养皿盖上加3.0ml氯仿，反扣培养皿2h以杀死细菌。在通风厨抽去氯仿后在培养皿中倒入约200μL水稻白叶枯病菌（X. oryzae pv. oryzae）或水稻细菌性条斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola）等菌液（见表4），均匀铺于培养基表面，在超净台上吹干，然后25～30℃下培养20～24h左右，观察抑菌状况及抑菌圈大小（表4）。

表4双向伯克霍尔德氏菌SD7对多种植物病原真菌和细菌的抑制效果

病原菌	SD7菌株抑菌圈半径（cm）
		香蕉炭疽病菌（Cm）	1.60±0.35
稻瘟病菌（Po）	0.93±0.15
		小麦赤霉病菌（Gz）	1.18±0.44
香蕉枯萎病菌（Foc）	2.20±0.16
		荔枝霜疫霉（Pl）	1.06±0.20
甘蔗黑腐病菌（Ca）	0.54±0.08
		番茄叶霉病（Cf）	1.15±0.13
水稻白叶枯菌（Xooe）	1.72±0.20
		水稻细菌性条斑病菌（Xooa）	1.38±0.35

综上所述，双向伯克霍尔德氏菌SD7对多种重要的植物病原真菌和细菌均具有拮抗作用，为广谱拮抗菌，可用于防治多种植物病害，尤其是对香蕉果实炭疽病和水稻纹枯病的防治效果较佳。

Claims (8)

1.一种双向伯克霍尔德氏菌，于2011年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGCC No.5384。

2.权利要求1所述双向伯克霍尔德氏菌，其特征在于该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种生物菌剂，其特征在于含有权利要求1或2所述双向伯克霍尔德氏菌或含有双向伯克霍尔德氏菌发酵液经过滤后的无菌滤液。

4.权利要求1或2所述双向伯克霍尔德氏菌的扩大培养方法，其特征在于培养条件如下：每100ml LB培养基加入1mL 2天龄的种子菌株，以180r/min在25℃条件下培养3d；所述LB培养基配方为：酵母浸出粉5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g、琼脂粉15～18g、水1000ml，pH6.0～7.0。

5.权利要求1或2所述双向伯克霍尔德氏菌在防治植物病原真菌和/或植物病原细菌引起的植物病害中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述植物病原真菌为水稻纹枯病、香蕉炭疽病、稻瘟病菌、小麦赤霉病、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉病、甘蔗黑腐病菌或番茄叶霉病菌；所述植物病原细菌为水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌。

7.权利要求1或2所述双向伯克霍尔德氏菌在制备防治植物病原真菌和/或植物病原细菌引起的植物病害菌剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述植物病原真菌为水稻纹枯病、香蕉炭疽病、稻瘟病菌、小麦赤霉病、香蕉枯萎病菌、荔枝霜疫霉病、甘蔗黑腐病菌或番茄叶霉病菌；所述植物病原细菌为水稻白叶枯病菌或水稻细菌性条斑病菌。

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