CN103361294A

CN103361294A - 抗疫霉的放线菌及其应用

Info

Publication number: CN103361294A
Application number: CN2013103362902A
Authority: CN
Inventors: 周倩; 刘珊珊; 熊兴耀; 朱宏建; 刘双清
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2013-08-05
Filing date: 2013-08-05
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2033-08-05
Also published as: CN103361294B

Abstract

本发明公开了一种抗疫霉的放线菌，属于湿链霉菌（Streptomyces humidus），其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2013268。本发明放线菌的发酵液对疫霉的生长有明显的抑制作用，可用于疫霉导致的植物病害。

Description

抗疫霉的放线菌及其应用

技术领域

本发明属农业科学技术领域，具体涉及生物防治领域，更具体涉及抗疫霉的放线菌的湿链霉菌（Streptomyces humidus）及其在生物防治中的应用。

背景技术

马铃薯(Solanum tuberosum L.)是全球主要的粮食作物，每年的消耗量仅次于水稻和小麦^[1]，同时也是菜、饲、加工及工业兼用的原料作物，在农业生产和人民生活中占有重要地位。而晚疫病是马铃薯生产上一种毁灭性病害，在全球范围绝大多数马铃薯栽培地区广泛传播，造成巨大损失。最著名的例子是1845年由晚疫病引起的爱尔兰大饥荒，直接导致百万人饿死，数百万人移民他乡。目前马铃薯晚疫病的危害性、防治难度以及社会影响已超过了水稻稻瘟病和小麦锈病，被视为国际第一大作物病害^[2]。我国每年因晩疫病造成的损失在也在10亿美元以上^[3]。目前马铃薯晚疫病的主要防治方法是利用抗病品种和喷施化学药剂。由于马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans）存在有性和无性两种生殖方式，具有极高的进化潜力，导入到栽培种中的抗性 R 基因很容易被克服^[4]。化学杀菌剂一度成为控制马铃薯晚疫病的主要措施，然而80年代开始使用的甲霜灵类杀菌剂，目前在大部分地区抗性菌株频率超过了50%，抗性水平达到了万倍以上^[5]，抗药性问题日益突出。不仅如此，化学防治还给生态环境、人畜生存质量和非靶标生物生存等带来了一系列负面影响。因此，研发出可替代化学杀菌剂的生物源杀菌剂用于马铃薯晚疫病的防治已是刻不容缓。

放线菌是产生抗生素活性物质最多的一类微生物，迄今已知的抗生素中，有2/3是由放线菌产生。放线菌产生的许多抗生素能够对植物病原菌产生很强的抑制杀灭作用。其中许多抗生素已经用于防治农作物上的有害生物，如井冈霉素、春雷霉素等。

近年来，利用拮抗微生物进行生物防治越来越受到各国科学家的重视，已逐渐成为植物病害防治研究的一大趋势。放线菌是一类极其丰富的微生物资源，其中很多，尤其是链霉菌属能产生多种抗生素类物质，用于植物病害防治有着广阔的前景。因此，筛选出抗马铃薯晚疫病菌的放线菌株，将有助于晚疫病生防产品的开发，促进该病害的安全控制。

近年来，马铃薯晚疫病的生物防治受到越来越多的重视。前人的工作已经证实，一些细菌发酵液^[6-10]，根围和叶围真菌对晚疫病菌表现出了直接的抑制作用^[11-13]。一些化学物质、生物及生物产品可以诱导马铃薯产生局部或系统的诱导抗病性^[14-16]。但利用放线菌及其发酵液抑制马铃薯晚疫病的研究还不多见。Lee等^[17] 报道放线菌AMG-P1产生的巴龙霉素在100μg.ml⁻¹的浓度对马铃薯晚疫病菌的抑制作用达到80%以上；王家琛等^[18]报道放线菌株MC- 15的发酵物冻干粉在6mg.ml⁻¹的浓度下对晚疫病菌的抑制率达92.12%，但具体的活性成分未做鉴定；许凤春等^[19]也筛选获得了一株对马铃薯晚疫病菌具有抑制作用的放线菌，平板抑菌试验的效果在75%以上。虽然生物防治目前还存在诸多问题, 但却显示出非常好的应用前景。

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[19]许凤春,董美玉,张玲玲等.放线菌G1 - 8菌株发酵液抗菌谱及稳定性的研究[J].生物技术,2008,18(4):81-83。

发明内容

本发明人从湖南浏阳烟田的土壤中筛选到一种抗疫霉的放线菌株L24，经形态观察、生理生化性状和分子生物学研究初步鉴定为湿链霉菌L24（拉丁名：Streptomyces humidus L24），已于2013年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心（保藏地址是：中国.武汉.武汉大学），保藏编号CCTCC NO：M2013268。

由于所述菌株对疫霉病菌有明显的抑制作用，包括对马铃薯晚疫病菌、黄瓜疫霉病菌、辣椒疫霉病菌、烟草黑胫病菌。因而本发明提供所述菌株及代谢产物在生物防治中应用，具体是用于防治由马铃薯晚疫病菌、黄瓜疫霉、辣椒疫霉或烟草黑胫病菌导致的植物病害。

本发明具有以下有益效果：采用含毒介质法进行离体生测发现菌株L24的发酵液对疫霉的生长有明显的抑制作用，对马铃薯晚疫病菌的抑制效果尤其显著，在发酵条件未经优化的情况下，摇瓶培养3天的发酵液稀释5倍后抑制率100%。此前关于Streptomyces humidus及其代谢产物拮抗马铃薯晚疫病未见报道，这一发现为筛选控制马铃薯晚疫病的生防菌，以及以此为材料开发生物农药提供了重要的新材料。深入研究放线菌株L24代谢产物抑制马铃薯晚疫病菌的活性成分，不仅可以加深微生物代谢产物对该类病原菌作用机制的了解，而且有助于生物防治产品开发，为马铃薯晚疫病的安全有效控制提供帮助。

附图说明

图1 L24菌株对马铃薯晚疫病菌的抑制作用。

图2 L24菌株对黄瓜疫霉病菌的抑制作用。

图3 L24菌株对辣椒疫霉的抑制作用。

图4 L24菌株对烟草黑胫病菌的抑制作用。

图5 L24菌株菌丝形态。

图6 L24菌株孢子丝形态。

图7 菌株L24的16SrDNA系统发育树。

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例一抗疫霉的放线菌株 L24 的筛选

具体过程如下：

1、土壤样品的采集

从湖南省各地分别采集不同地块3-10cm深处的土壤约200g，共32份，带回实验室，自然风干，过20目筛后分离。

2、放线菌的分离

采用平板法分离：称取10g土壤样品，加到盛有100mL无菌水的三角瓶中，振荡器中震荡30 min，然后分别配制成10^-2、10^-3、10^-4、10^--5的悬浮液，分别吸取不同浓度的悬浮液各1 mL于灭菌培养皿中，每一浓度3皿，然后倒入15-18 mL 50℃左右的高氏一号培养基，混均后平放，待冷却凝成平板后置于30℃的温箱中培养2-3 d。对培养基上长出的菌落形态明显的放线菌单株菌落进行纯化培养，并转移至斜面培养基中保存备用。共得到228个放线菌菌株。

3、抗马铃薯晚疫病菌的放线菌株L24的获得

采用平板对峙法测定228株放线菌株的拮抗活性。初筛有拮抗作用的菌株用高氏一号培养液在28℃条件下200rpm 振荡培养3天。培养物用滤纸过滤后，再用细菌滤器过滤得到培养滤液。取3mL 培养滤液与15mL培养基混合，摇匀制成平板。接种马铃薯晚疫病菌菌饼于平板中央，28℃下培养，待对照长满后测量菌落直径，记录结果并按下式计算抑制率：

菌落直径=相垂直的两直径的平均值- 菌饼直径

抑制率（%）=（对照菌落直径- 处理菌落直径）/(对照菌落直径-菌饼直径）×100

从中筛选出了一个对马铃薯晚疫病菌具有明显抑菌效果的放线菌株L24，对马铃薯晚疫病菌菌丝抑制率达100%（图1）。该菌株是从湖南浏阳烟田的土壤中筛选到。

抑菌谱的试验结果显示L24的发酵液对黄瓜疫霉、辣椒疫霉、烟草黑胫病菌等其他疫霉的抑制效果也非常显著（图2-4）。该菌株是从湖南浏阳烟田的土壤中筛选到的。

实施例二放线菌菌株 L24 的分类地位

（1）形态、培养特征观察

使用高氏一号培养基和插片法接种，电镜下观察到L24菌株的孢子丝初旋至螺旋形，孢子长卵圆形，表面光滑（图5、6）。肉眼观察划线接种在不同培养基平板上气生菌丝、基内菌丝和可溶性色素的颜色变化，取成熟期的颜色作为定种的依据（表1）。

表1 L24菌株的培养特征

培养基种类	气生菌丝	基内菌丝	可溶性色素
				高氏一号	初生灰白色，老熟灰褐色	白色	无
淀粉培养基	初生白色，老熟灰褐色	白色	无
				PDA	初生白色，老熟淡紫色	黄白色	无
察氏琼脂	初生灰白色，老熟灰褐色	白色	无
				酪氨酸琼脂	初生白色，老熟灰色	灰色	无

（2）分子生物学鉴定

提取放线菌L24的DNA，对其16S rDNA进行PCR扩增及扩增产物克隆测序。测序结果用BLAST与GenBank中已发表的16SrDNA序列进行同源性比较，并用MEGA软件构建系统发育树(图7)。由系统发育树可知放线菌L24菌株与已报道的湿链霉菌（Streptomyces humidus）和生暗灰链霉菌（Streptomyces caniferus）亲源关系最近。

（3）生理生化特征鉴定

根据Bergey＇s Manual of Systemaic Bacteriology（第九版）的湿链霉菌和生暗灰链霉菌的生理生化差异设计利用纤维素和明胶液化试验。试验结果：生暗灰链霉菌明胶液化快、不利用纤维素的特点与L24不吻合。

因此，根据形态特征、16SrDNA序列和生理生化特征将L24鉴定为湿链霉菌（Streptomyces humidus）。

Claims

1.一种抗疫霉的放线菌，属于湿链霉菌（Streptomyces humidus），其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2013268。

2.如权利要求1所述的抗疫霉的放线菌及其代谢产物在生物防治中应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于用于疫霉导致的植物病害。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述生物防治中的应用是防治由马铃薯晚疫病菌、黄瓜疫霉、辣椒疫霉或烟草黑胫病菌导致的植物病害。