CN109370959A - 一种防治马铃薯晚疫病的根际细菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种防治马铃薯晚疫病的根际细菌及其用途，属于生物防治领域。所述根际细菌为链霉菌属Streptomyces sp.FXP04，已于2018年11月26日在中国普通微生物菌种保藏管理中心进行保藏，保藏号为CGMCC No.16826。该菌株通过产生活性物质抑制马铃薯晚疫病病菌的生长，对马铃薯晚疫病表现出较好的防治效果。本发明的链霉菌属Streptomyces sp.FXP04还有明显的促生作用，能够显著促进黄瓜和马铃薯生长，属于根际促生菌。本发明所述的链霉菌属Streptomyces sp.FXP04是从马铃薯根际分离获得，属于根际细菌，无毒、无致病性，因此在马铃薯晚疫病的生物防治中具有良好的应用前景。

Description

一种防治马铃薯晚疫病的根际细菌及其用途
技术领域
本发明属于生物防治领域，具体涉及一种防治马铃薯晚疫病的根际细菌及其用途。
背景技术
马铃薯(Solanum tuberosum)俗称地蛋、土豆，是全球仅次于小麦和玉米的第三大重要粮食作物和蔬菜作物，也是我国五大主食之一；其营养价值高、适应力强、产量大，是东北地区，特别是黑龙江地区冬季主要的贮存性蔬菜。然而现代农业生产中过分追求“高产、优质和高效”，大规模的重茬(连作)种植模式、及单一品种的大力推广，造成马铃薯晚疫病病原菌(致病疫霉菌)(Phytophthora infestans)的大量积累；同时密植和高水肥的田间管理方式又降低了作物的抗病性；造成了马铃薯晚疫病(世界第一大作物病害)的大面积爆发，成为影响马铃薯生产的主要威胁。
国内外研究学者已经筛选到能几十种够抑制致病疫霉菌甚至控制马铃薯晚疫病的有益微生物，但是这些有益微生物的功能较单一，仅仅具有抑制效果或促生效果，但是同时具有抑制和促生效果的促生菌则非常少。值得注意的是，很多益生菌在实验室条件下对致病疫霉菌具有抑制作用，但是田间条件下的马铃薯晚疫病的控制作用则往往效果不佳，形成商用的促生菌还很少。因此还需要大规模的筛选更多的促生菌，以期获得更高效的马铃薯晚疫病促生菌。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明通过从健康马铃薯根际分离筛选细菌，意外地获得一株能够防治马铃薯晚疫病的根际促生细菌，从而完成本发明。
为此，本发明人一方面提供一种防治马铃薯晚疫病的根际细菌，经鉴定，该根际细菌为链霉菌属菌株Streptomyces sp.FXP04，该菌株于2018年11月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16826。
经生理生化鉴定，该链霉菌属菌株Streptomyces sp.FXP04能够利用D-葡萄糖、甘油、2-酮基-葡萄糖酸盐、D-半乳糖、D-山梨醇、N-乙酰-葡萄糖苷、D-纤维二糖、D-果糖作为碳源，不能利用L-阿拉伯糖、D-木糖、侧金盏花醇、木糖醇、肌醇、α-甲基-D-葡萄糖、D-乳糖、D-麦芽糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-松三糖、D-棉子糖、L-鼠李糖、甘露糖作为碳源。
进一步地，该链霉菌属菌株Streptomyces sp.FXP04类黑色素反应、明胶液化反应、淀粉水解反应、氧化酶反应、硫化氢反应、硝酸盐还原反应呈阴性，酪蛋白水解反应和过氧化氢酶反应呈阳性。
进一步地，该链霉菌属菌株Streptomyces sp.FXP04的16S rDNA具有如SEQ IDNo:1所示的核苷酸序列。
本发明的第二方面提供一种生防菌剂，其包含本发明第一方面所述的根际细菌。
在本发明的一些实施方案中，所述根际细菌在生防菌剂中的含量为1×107～5×109个/mL。
在本发明的一些优选实施方案中，所述根际细菌在生防菌剂中的含量为0.5×108个/mL。
本发明的第三方面提供本发明第二方面所述生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)种子液的制备：将所述的链霉菌属菌株Streptomyces sp.FXP04接种于Lb液体培养基中，30℃，120转/min，培养2d，制成种子液；
2)发酵：将种子液接种于发酵培养基中，发酵条件为：接种量1％～2％vol、装瓶量100mL/250mL、发酵培养基初始pH值7.0～7.2，30℃，120转/min，培养至指数生长期；
3)无菌滤液的制备：将发酵液5000转/min离心10min后，弃上清；
4)沉淀用无菌水清洗，再离心一次，弃上清，沉淀用无菌水重悬，即为所述生防菌剂。
在本发明的一些实施方案中，所述根际细菌在生防菌剂中的含量为1×107～5×109个/mL。
在本发明的一些优选实施方案中，所述根际细菌在生防菌剂中的含量为0.5×108个/mL。
本发明的第四方面提供本发明第一方面所述的根际细菌或本发明第二方面所述的生防菌剂在制备用于促进植物生长的生物液肥中的用途。
在本发明的一些实施方案中，所述根际细菌在生物液肥中的含量为1×107～5×109个/mL。
在本发明的一些优选实施方案中，所述根际细菌在生物液肥中的含量为0.5×108个/mL。
在本发明的具体实施方案中，所述植物为黄瓜或马铃薯。
本发明的有益效果
本发明提供的链霉菌属Streptomyces sp.FXP04是从马铃薯根际分离获得，属于根际细菌，无毒、无致病性，且能显著促进生长，因此在马铃薯晚疫病的生物防治中具有良好的应用前景。
附图说明
图1示出了菌株FXP04的形态学特征。
图2示出了16S rDNA分析菌株FXP04进化树。
图3示出了菌株FXP04对致病疫霉的抑制作用，A所示结果为培养10天后；B所示结果为培养25天后；C左侧的平板为FXP04与致病疫霉对峙培养，右侧的平板中为致病疫霉单独培养。
图4示出了不同浓度Streptomyces sp.FXP04处理下黄瓜幼苗长势(A：第一组，B：第二组，C：第三组)。
图5示出了Streptomyces sp.FXP04对黄瓜幼苗根系生长的影响(上图为经FXP04处理，下图为CK)。
图6示出了Streptomyces sp.FXP04对马铃薯晚疫病发病情况(接入致病疫霉15天后)。
图7示出了Streptomyces sp.FXP04对马铃薯晚疫病的影响。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
实施例1菌株的鉴定
本发明的菌株是发明人利用Lb培养基从健康马铃薯根际土壤中分离得到的，编号为FXP04。参考Hamdali et al.(2011)等人的方法对FXP04进行形态学和生理生化特征分析。
其形态学特征如图1所示。在ISP2培养基，28℃培养12d，菌落表面绒粉状，气生菌丝白色，基内菌丝浅橙色，无可溶性色素(图1A)；孢子丝柔曲，孢子卵圆形(图1B)。在ISP3培养基，28℃培养12d，菌落表面绒粉状，气生菌丝白色，基内菌丝黄色，无可溶性色素(图1C)。在ISP4培养基，28℃培养12d，菌落表面絮状，气生菌丝白色，基内菌丝乳黄色，无可溶性色素(图1D)。在ISP5培养基，28℃培养12d，菌落表面绒粉状，气生菌丝白色，基内菌丝浅橙色，无可溶性色素(图1E)。在ISP6培养基，28℃培养12d，菌落表面绒粉状，气生菌丝白色，基内菌丝橙色，无可溶性色素(图1F)。
生理生化特征如表1所示。
表1菌株FXP04生理生化特征
符号说明：“+”，阳性；“+w”，弱阳性；“-”，阴性
16S rDNA序列测序使用Applied Biosystems(型号3730XL)进行，获得菌株FXP04的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。经序列比较，发现其与Streptomyces spp.属菌株相似性较高，如表2所示。
表2菌株FXP04的16S rDNA比对结果
采用MEGA5.0软件构建系统发育树。结果如图2所示，邻位连接法显示“FXP04”与相关种的16S rDNA序列系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，图中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。
经过FMIC-QO01-001微生物学检测和细菌多相鉴定等多种方法，鉴定该FXP04菌株为链霉菌的一个新种，命名为Streptomyces sp.FXP04。发明人于2018年11月26日将该菌中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)进行保藏，保藏号为：CGMCC NO.16826。
实施例2Streptomyces sp.FXP04对致病疫霉菌的抑制作用
配制黑麦固体培养基，121℃高压灭菌20分钟，倒平板，凝固后在培养基的中央位置放置一直径为0.5厘米的致病疫霉菌柄；用灭菌的移液器头在致病疫霉菌柄两侧2.5厘米处各打一个孔，孔的直径为0.5厘米，向孔中注入100微升处于指数生长期的Streptomycessp.FXP04菌液。置于21℃黑暗培养。Streptomyces sp.FXP04对致病疫霉的抑制率＝(对峙培养的菌落直径-单独培养的菌落直径)/单独培养的菌落直径*100％.
从图1中可以看出，致病疫霉单独培养时，其菌落向各个方向是均匀生长的，但是在对峙培养中对峙方向致病疫霉的生长受到严重的抑制，Streptomyces sp.FXP04和致病疫霉没有接触(图3C)。在FXP04和致病疫霉的对峙方向上，致病疫霉的菌落生长受到严重抑制，其菌落直径在培养第10天(图3A)和第25天(图3B)时分别比对照(单独培养)减少了26.97％和53.5％；在第25天时，非对峙区的致病疫霉的菌落直径也显著小于对照，显著大于对峙区，但是在第十天时，非对峙区的致病疫霉菌落直径则和对照无显著差异。
实施例3Streptomyces sp.FXP04对黄瓜幼苗生长的效果
Lb培养基，调pH至7.2-7.4之间，接种Streptomyces sp.FXP04种子液，30℃120转/分黑暗培养，培养至指数生长期，5000转/分离心10分钟，弃上清，沉淀用无菌水清洗，再离心一次，弃上清，沉淀用无菌水重悬，调OD620至0.6(经稀释平板实验，OD值为0.6时，菌液浓度约为1.0×108个/mL，即1亿个/mL)。将黄瓜种子分别在无菌水、OD值为0.6的菌悬液原液(以后简称原液)、1/2浓度的原液(简写1/2)、1/5浓度的原液(简写1/5)，浸种30分钟，于26度黑暗培养催芽，每个处理3个重复，每个重复(每个培养皿)16粒种子。24小时后统计种子发芽率，经调查，各处理种子发芽率无显著差异。从每个处理发芽的种子中选择发芽势一致的种子播种于育苗钵中，每个钵中1粒种子，之后向每个处理的种子上加入菌液2mL(菌液浓度分别同上，CK用无菌水代替)，每个处理三次重复(三组)，每个重复5株。育苗钵中用土为普通菜园土。常规管理。播种25天后调查黄瓜幼苗生长状况。
从表3可以看出，不同浓度的Streptomyces sp.FXP04菌液对黄瓜幼苗的生长是有影响的：浓度为原液时(OD值为0.6)，对黄瓜幼苗的鲜重、干重、茎粗和壮苗指数没有显著影响，黄瓜的株高有下降的趋势。浓度为原液的1/5时，和对照相比，增加了鲜重和茎粗；浓度为原液的1/2时，则显著增加了黄瓜的株高、茎粗、鲜重、干重和壮苗指数，在选定的几个浓度范围内，原液的1/2浓度时黄瓜幼苗的长势最好，苗齐(图4)。说明菌液的浓度太大或太小都对黄瓜幼苗的生长无影响，甚至浓度太大会抑制黄瓜幼苗生长。比较适合的菌液浓度为原菌液浓度的一半，即0.5×108个/mL。利用根系扫描仪对1/2浓度处理后生长至15天的的黄瓜幼苗进行扫描分析，发现菌液处理后，黄瓜根系的直径没有显著变化，但是根系长度、根系表面积、根系体积和根尖数都显著高于对照(表4，图5)，说明1/2的菌液浓度处理能够促进黄瓜幼苗根系的生长，从而促进幼苗地上部分的生长。
表3不同浓度Streptomyces sp.FXP04菌液对黄瓜幼苗生长的影响
表4Streptomyces sp.FXP04菌液对黄瓜幼苗根系生长的影响
因此，我们确定菌液浓度在0.5×108个/mL即0.5亿个/mL时通过根部施用可对黄瓜幼苗的生长有促进作用。菌液浸种对黄瓜种子没有显著影响，因此农业生产中，穴播育苗时可以向穴内注入2mL该浓度菌液，然后放入种子，此种方法可以获得黄瓜壮苗。
实施例4Streptomyces sp.FXP04对马铃薯幼苗生长及马铃薯晚疫病的影响
配制Lb液体培养基，接入Streptomyces sp.FXP04种子，30℃120转/分黑暗培养，培养至指数生长期，稀释菌液至0.5亿个/mL。将带有1个芽眼且大小相同、芽大小一致的马铃薯薯块在菌液中浸泡30分钟，以在无菌水中浸泡的马铃薯为对照。之后，将薯块播种于盆中，浇透水，常规管理，记录马铃薯生长状况。配制黑麦液体培养基，121℃高压灭菌后接入致病疫霉菌，20℃120转/分黑暗培养，至菌悬液浓度1×107个/mL时，将10mL菌液浇灌入生长30天的马铃薯苗根部。然后将马铃薯苗的培养温度设为20℃，湿度保持在80％，并每天用喷壶喷洒叶片，创造晚疫病的发病条件，并观察记录晚疫病发病情况。马铃薯晚疫病的病情指数根据陈亚兰等(2017)的四级分级标准。
通过图6可以看出，用Streptomyces sp.FXP04处理后的马铃薯幼苗长势较好好，苗高将近对照的2倍。且对照的马铃薯苗发病较重，下部叶子基本脱落，叶子皱缩不伸展。部分幼苗已经枯死。相反，Streptomyces sp.FXP04处理后的马铃薯幼苗发病较轻，下部叶片基本保存。从图7可以看出，Streptomyces sp.FXP04处理显著降低了晚疫病的发病率，在接种致病疫霉后的5天、10天和15天的发病率分别为59.43％、25.89％和36.06％；并且，显著降低了马铃薯晚疫病的严重程度，在接种致病疫霉后的5天、10天和15天的病情指数分别为77.54％、43.88％和31.27％；这些数据表明，用Streptomyces sp.FXP04处理可以降低晚疫病的发病率，降低晚疫病的发病程度。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 齐齐哈尔大学
<120> 一种防治马铃薯晚疫病的根际细菌及其用途
<130> XY-2018-1-W-024
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1354
<212> DNA
<213> Streptomyces sp. FXP04
<400> 1
gcttcggtgg tggattagtg gcgaacgggt gagtaacacg tgggcaatct gccctgcact 60
ctgggacaag ccctggaaac ggggtctaat accggatatg actaccgatc gcatggttgg 120
tggtggaaag ctccggcggt gcaggatgag cccgcggcct atcagcttgt tggtggggtg 180
atggcctacc aaggcgacga cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc acactgggac 240
tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgaa 300
agcctgatgc agcgacgccg cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa cctctttcag 360
cagggaagaa gcgagagtga cggtacctgc agaagaagcg ccggctaact acgtgccagc 420
agccgcggta atacgtaggg cgcgagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagagctcgt 480
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gaactaggtg tgggcgacat tccacgtcgt ccgtgccgca gctaacgcat taagttcccc 780
gcctggggag tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 840
ggcggagcat gtggcttaat tcgacgcaac gcgaagaacc ttaccaaggc ttgacataca 900
ccggaaacgg ccagagatgg tcgccccctt gtggtcggtg tacaggtggt gcatggctgt 960
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgttctg 1020
tgttgccagc atgcctttcg gggtgatggg gactcacagg agactgccgg ggtcaactcg 1080
gaggaaggtg gggacgacgt caagtcatca tgccccttat gtcttgggct gcacacgtgc 1140
tacaatggcc ggtacaatga gctgcgatac cgtgaggtgg agcgaatctc aaaaagccgg 1200
tctcagttcg gattggggtc tgcaactcga ccccatgaag tcggagtcgc tagtaatcgc 1260
agatcagcat tgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacgtca 1320
cgaaagtcgg taacacccga agccggtggc ccaa 1354

Claims (10)

1.一种防治马铃薯晚疫病的根际细菌，其特征在于，所述根际细菌为链霉菌属菌株Streptomyces sp.FXP04，该菌株于2018年11月26日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16826。
2.根据权利要求1所述的根际细菌，其特征在于，所述链霉菌属菌株Streptomycessp.FXP04能够利用D-葡萄糖、甘油、2-酮基-葡萄糖酸盐、D-半乳糖、D-山梨醇、N-乙酰-葡萄糖苷、D-纤维二糖、D-果糖作为碳源，不能利用L-阿拉伯糖、D-木糖、侧金盏花醇、木糖醇、肌醇、α-甲基-D-葡萄糖、D-乳糖、D-麦芽糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-松三糖、D-棉子糖、L-鼠李糖、甘露糖作为碳源。
3.根据权利要求1所述的根际细菌，其特征在于，所述链霉菌属菌株Streptomycessp.FXP04类黑色素反应、明胶液化反应、淀粉水解反应、氧化酶反应、硫化氢反应、硝酸盐还原反应呈阴性，酪蛋白水解反应和过氧化氢酶反应呈阳性。
4.根据权利要求1所述的根际细菌，其特征在于，所述链霉菌属菌株Streptomycessp.FXP04的16S rDNA具有如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
5.一种生防菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的根际细菌。
6.根据权利要求5所述的生防菌剂，其特征在于，所述根际细菌在生防菌剂中的含量为1×107～5×109个/mL，优选0.5×108个/mL。
7.权利要求5所述生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)种子液的制备：将所述的链霉菌属菌株Streptomyces sp.FXP04接种于Lb液体培养基中，30℃，120转/min，培养2d，制成种子液；
2)发酵：将种子液接种于发酵培养基中，发酵条件为：接种量1％～2％vol、装瓶量100mL/250mL、发酵培养基初始pH值7.0～7.2，30℃，120转/min，培养至指数生长期；
3)无菌滤液的制备：将发酵液5000转/min离心10min后，弃上清；
4)沉淀用无菌水清洗，再离心一次，弃上清，沉淀用无菌水重悬，调OD620至0.6，即为所述生防菌剂。
8.权利要求1所述的根际细菌或权利要求4所述的生防菌剂在制备用于促进植物生长的生物液肥中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述根际细菌在所述生物液肥中的含量为1×107～5×109个/mL，优选0.5×108个/mL。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述植物为黄瓜或马铃薯。
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