CN110373344A - 鲤链霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株鲤链霉菌，保藏编号为CCTCC NO：M2019120，分类命名为Streptomyces carpaticus T33。试验表明，该鲤链霉菌能够抑制植物病原菌，对香蕉炭疽菌、芒果炭疽菌、珍珠李炭疽病、葡萄座腔菌、香蕉尖孢镰刀菌4号和链格孢菌有明显的拮抗作用。因此，该鲤链霉菌可用于生物防治，其菌株及其发酵液具有开发植物病原菌抑制剂的潜在价值，具有很好的应用前景。此外，研究发现，该菌株的发酵液能够增强香蕉苗的抗病性，并能显著地促进香蕉植株的生长，可用作蕉生长促进剂。综上，本发明具有生物防治和促进香蕉生长特性的鲤链霉菌对农业安全可持续发展具有重要意义。

Description

鲤链霉菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种鲤链霉菌及其应用。
背景技术
世界人口增长速度不断加快，粮食问题和环境问题一直困扰着人类。化学杀菌剂、除草剂和肥料等极易破坏土壤的生态环境，促使病原菌产生耐药性，危害人类健康。为了食品和环境安全，无污染和环境友好型的生物源农药的需求日益增长。链霉菌属(Streptomyces)属于放线菌目，是一种高G+C含量(50％～80％)的革兰氏阳性细菌，菌丝体纤细，在自然界中分布很广。链霉菌能生产多种多样的活性化合物，抗生素和胞外酶，是具有重要应用价值的生防菌资源之一。大部分链霉菌因产生鳌铁化合物和植物激素并且具有解磷活性，能够促进植物的生长。虽然链霉菌已被广泛用作生防制剂研究，其作为菌肥应用于果树栽培上还较少。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种鲤链霉菌及其应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
鲤链霉菌，保藏编号为CCTCC NO：M2019120，分类命名为Streptomycescarpaticus T33。
上述鲤链霉菌，其16S rDNA基因具有序列表SEQ.ID.NO.1的碱基序列。
上述鲤链霉菌在抑制植物病原菌中的应用。
植物病原菌为香蕉炭疽菌、芒果炭疽菌、珍珠李炭疽菌、葡萄座腔菌、香蕉尖孢镰刀菌4号或链格孢菌。
上述鲤链霉菌在制备植物病原菌抑制剂中的应用。
上述鲤链霉菌的发酵液在制备植物病原菌抑制剂中的应用。
鲤链霉菌在促进香蕉生长中的应用。
鲤链霉菌在制备香蕉生长促进剂中的应用。
上述鲤链霉菌的发酵液在制备香蕉生长促进剂中的应用。
上述发酵液按以下制备：将鲤链霉菌接种至含有海盐的ISP2固体培养基上培养，再将菌块接种至发酵培养基，在28℃下培养，然后收集发酵液。
发明人从广西钦州茅尾海红树林保护区的无瓣海桑根际的土壤中分离得到一株链霉菌，经鉴定为鲤链霉菌，保藏编号为CCTCC NO：M2019120，分类命名为Streptomycescarpaticus T33。试验表明，该鲤链霉菌能够抑制植物病原菌，对香蕉炭疽菌、芒果炭疽菌、珍珠李炭疽菌、葡萄座腔菌、香蕉尖孢镰刀菌4号和链格孢菌有明显的拮抗作用。因此，该鲤链霉菌可用于生物防治，其菌株及其发酵液具有开发植物病原菌抑制剂的潜在价值，具有很好的应用前景。此外，研究发现，该菌株的发酵液能够增强香蕉苗的抗病性，并能显著地促进香蕉植株的生长，可用作蕉生长促进剂。综上，本发明具有生物防治和促进香蕉生长特性的鲤链霉菌对农业安全可持续发展具有重要意义。
附图说明
图1是鲤链霉菌T33在不同培养基上的生长状态图片，图中：NA是蛋白胨琼脂培养基； TSA是胰蛋白胨大豆琼脂培养基；R2A是R2A琼脂培养基；P5是L-天冬酰胺琼脂培养基；AGG是高氏琼脂培养基；P3是燕麦琼脂培养基；P7是酪氨酸琼脂培养基。
图2是鲤链霉菌T33对香蕉炭疽菌抑制活性检测图，图中：a为香蕉炭疽菌，b为鲤链霉菌T33。
图3是鲤链霉菌T33对芒果炭疽菌抑制活性检测图，图中：a为芒果炭疽菌，b为鲤链霉菌T33。
图4是鲤链霉菌T33对珍珠李炭疽菌抑制活性检测图，图中：a为珍珠李炭疽菌，b为鲤链霉菌T33。
图5是鲤链霉菌T33对葡萄座腔菌抑制活性检测图片，图中：a为葡萄座腔菌，b为鲤链霉菌T33。
图6是鲤链霉菌T33对链格孢抑制活性检测图片，图中：a为链格孢菌，b为鲤链霉菌T33。
图7是基于16S rDNA基因序列构建的鲤链霉菌T33的系统发育树。
图8是鲤链霉菌T33发酵液稀释50倍后对香蕉苗生长的影响结果图，图中：a实验组：鲤链霉菌T33发酵液稀释50倍后施用于香蕉苗，b清水组：仅施用清水的香蕉苗。
保藏信息说明
Streptomyces carpaticus T33，保藏编号为CCTCC NO：M2019120，保藏日期：2019年3月4日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
T33菌株在海盐ISP2培养基上培养5d后气生菌丝呈白色，菌落光滑，无孢子生成。
具体实施方式
1材料与方法
1.1供试材料
1.1.1菌株的分离与纯化
收集红树林植物无瓣海桑根须表面附着的土壤(距离根须5mm以内)，称取2.0g土壤样品装于20ml无菌水(内有玻璃珠)的锥形瓶中，手动摇匀；依次用无菌水稀释100 倍和1000倍，制成涂布样液。取200μl样品置于6种不同培养基中进行涂布，放入28℃培养箱中培养20天，观察菌落形态特征，挑取菌落进行纯化。纯化后的菌株置于20％(v/v) 甘油中，-80℃冷冻保藏。
供试植物病原菌菌株香蕉炭疽菌、芒果炭疽菌、珍珠李炭疽菌、葡萄座腔菌、香蕉尖孢镰刀菌4号以及链格孢菌由广西农业科学研究院提供。
1.1.2供试培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉15～20g、水1000ml。
蛋白胨琼脂培养基(NA)：蛋白胨10g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂16.0g，去离子水1000mL，pH7.2-7.4。
胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)：胰蛋白胨15.0g，大豆蛋白水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂16.0g，去离子水1000ml，pH7.2-7.4。
改良的R2A琼脂培养基：胰蛋白胨0.25g，酸水解酪蛋白0.5g，酵母浸粉0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾0.3g，硫酸镁0.1g，丙酮酸钠0.3g，蛋白胨0.5g，葡萄糖0.5g，琼脂16.0g，去离子水1000ml，pH7.2-7.4。
L-天冬酰胺琼脂培养基(P5)：L-天冬酰胺1.0g，甘油10ml，复合盐母液10mL，琼脂13.0g，去离子水1000ml，pH7.2-7.4。
高氏琼脂培养基(AGG)：可溶性淀粉10.0g，葡萄糖1.0g，甘油5mL，复合盐母液10mL，琼脂13.0g，去离子水1000mL，pH7.2-7.4。
燕麦琼脂培养基(P3)：燕麦粉20.0g，复合盐母液10mL，琼脂13.0g，去离子水1000ml。
酪氨酸琼脂培养基(P7)：甘油10ml，L-酪氨酸0.5g，L-天冬酰胺1.0g，复合盐母液10mL，琼脂13.0g，去离子水1000ml，pH7.2-7.4。
1.2菌株的鉴定
对菌株T33的16S rDNA基因序列进行PCR扩增、纯化以及测序，得到长度为1542bp的序列(序列表SEQ.ID.NO.1)。在GenBank数据库进行序列比对后发现，菌株T33与鲤链霉菌(Streptomyces carpaticus)的同源性最高，相似值在99％以上(如表1)。选择与菌株T33同源性较高的菌株进行进化分析，根据进化树显示(如图7所示)，菌株T33与鲤链霉菌亲缘关系最近，因此初步鉴定菌株T33为鲤链霉菌。
表1 菌株T33的16S rDNA基因测序BLAST结果
菌株T33碳源利用如下表2所示。
表2 菌株T33碳源利用情况
表中，+：阳性，-：阴性，w：弱阳性。
1.3鲤链霉菌T33抑菌活性检测
采用平板对峙培养法对菌株T33的广谱抗性进行鉴定。将活化后的鲤链霉菌T33菌株接种在距病原菌菌丝块2～3cm处，每平板接种四个鲤链霉菌T33菌株，以不接任何鲤链霉菌T33菌株的病原菌为对照，每个菌株三次重复，28℃恒温培养5～7d后，测定对照病原菌菌落直径和处理病原菌菌落直径，并计算菌株T33拮抗病原菌的抑菌率，抑菌率＝(对照病原菌菌落直径-处理病原菌菌落直径)/对照病原菌菌落直径×100％。抑菌活性检测结果如图2至图6所示，抑菌率如表3所示。
表3 鲤链霉菌T33对不同菌株的抑制作用
由表3可知，鲤链霉菌T33对上述病原菌均有不同程度的抑制作用，对珍珠李炭疽菌抑制效果最好，其次为链格孢菌。推知，对于综合防控植物病害，鲤链霉菌T33具有一定应用价值。
1.4鲤链霉菌T33菌株发酵液对香蕉植株生长的影响
鲤链霉菌T33菌株发酵液：将鲤链霉菌接种至含有海盐的ISP2固体培养基上培养，再将菌块接种至发酵培养基，在28℃下培养，然后收集发酵液。
盆栽试验检测鲤链霉菌T33菌株发酵液对香蕉植株生长的影响，光照培养箱的培养条件为26℃～28℃，选取长势一致的香蕉苗，营养钵装土500g/钵，将香蕉苗栽入其中。试验设2个处理，1)空白处理：施用清水；2)发酵液处理：施用稀释50倍的发酵液原液。各处理设3个重复，每个重复8株香蕉苗。发酵液处理组每盆倒入50倍稀释的链霉菌T33发酵液50ml，每5d重复一次。除此之外，发酵液处理组与空白处理组每天施入等量清水；试验期间，各处理其他管理措施一致。在香蕉移栽第50d时，记录各处理每株香蕉株高、茎围、叶宽。
表4 菌株T33发酵液对香蕉植株生长的影响
由表4可以看出，施用稀释50倍的菌株T33发酵液原液后，香蕉苗植株的叶片面积、根茎周长和株高都明显高于清水组。与清水组相比，鲤链霉菌T33的菌株发酵液具有提高香蕉苗生长的特性。
1.5鲤链霉菌T33菌株发酵液对香蕉苗抗病性的影响
将香蕉尖孢镰刀菌4号接种至灭菌的小米里，28℃，200rpm/min培养5天。选取长势一致的香蕉苗，营养钵装土500g/钵。试验设3个处理，1)空白组：施用清水；2)处理组1：将含有香蕉尖孢镰刀菌4号的小米100克与土壤混合，然后栽种香蕉苗，每天使用清水浇灌；3)处理组2：将含有香蕉尖孢镰刀菌4号的小米100克与土壤混合，然后栽种香蕉苗，除用等量清水浇灌外，每隔5天施用50ml稀释50倍后的T33菌株发酵液。各处理设3次重复，每个重复5株香蕉苗。试验期间，各处理其他管理措施一致。在香蕉移栽第50d时，统计香蕉苗发病率，计算病情指数和防病效果。
病情指数＝Σ(发病数×级数)×100/(调查总株数×最高级别)
病情分级：0级为无病状；1级为整株叶片只有最下部1片叶片发黄轻度萎蔫，嫩叶完好；2级为1-2片叶片变黄萎蔫；3级为全株1/3-1/2叶片变黄萎蔫；4级为全株1/2-3/4叶片变黄萎蔫；5级为全株3/4以上叶片变黄萎蔫或整株死亡。
防病效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)×100/对照病情指数表5 菌株T33发酵液对香蕉苗抗病性的影响
序列表
<110> 广西科学院
<120> 鲤链霉菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1542
<212> DNA
<213> 鲤链霉菌T33(Streptomyces carpaticus T33)
<400> 1
cctctagaga ttagagtttg atcatggctc aggacgaacg ctggcggcgt gcttaacaca 60
tgcaagtcga acgatgaacc ggtttcggcc ggggattagt ggcgaacggg tgagtaacac 120
gtgggcaatc tgccctgcac tctgggataa gcccgggaaa ctgggtctaa taccggatac 180
gacattccaa ggcatcttgg ggtgtggaaa gttccggcgg tgcaggatga gcccgcggcc 240
tatcagcttg ttggtggggt aatggcctac caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag 300
ggtgaccggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg 360
gaatattgca caatgggcga aagcctgatg cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt 420
cgggttgtaa acctccttca gcagggaaga agcgagagtg acggtacctg cagaagaagc 480
accggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gtgcgagcgt tgtccggaat 540
tattgggcgt aaagagctcg taggcggttt gtcgcgtcga ttgtgaaagc ccggggctta 600
accctgggtc tgcagtcgat acgggcaggc tagagttcgg caggggagac tggaattcct 660
ggtgtagcgg tgaaatgcgc agatatcagg aggaacaccg gtggcgaagg cgggtctctg 720
ggccgatact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt 780
agtccacgcc gtaaacggtg ggcactaggt gtgggcaaca ttccacgttg tccgtgccgc 840
agctaacgca ttaagtgccc cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa 900
ttgacggggg cccgcacaag cggcggagca tgtggcttaa ttcgacgcaa cgcgaagaac 960
cttaccaagg cttgacatac atcggaaacg gccagagatg gtcgccccct tgtggtcggt 1020
gtacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080
acgagcgcaa cccttgtcct gtgttgccag cggagccttc gggctgccgg ggactcacgg 1140
gagactgccg gggtcaactc ggaggaaggt ggggacgacg tcaagtcatc atgcccctta 1200
tgtcttgggc tgcacacgtg ctacaatggc cggtacaatg agctgcgatg ccgtgaggtg 1260
gagcgaatct caaaaagccg gtctcagttc ggattggggt ctgcaactcg accccatgaa 1320
gtcggagtcg ctagtaatcg cagatcagca ttgctgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1380
tacacaccgc ccgtcacgtc atgaaagtcg gtaacacccg aagccggtgg cctaacccct 1440
tgtgggaggg agctgtcgaa ggtgggactg gcgatcggga cgaagtcgta acaaggtagc 1500
cgtaccggaa ggtgcggttg gatcacctcc ttaatcgtcg ac 1542

Claims (10)

1.一株鲤链霉菌，其特征在于保藏编号为CCTCC NO：M2019120，分类命名为Streptomyces carpaticus T33。
2.根据权利要求1所述的鲤链霉菌，其特征在于其16S rDNA基因具有序列表SEQ.ID.NO.1的碱基序列。
3.权利要求1所述鲤链霉菌在抑制植物病原菌中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述植物病原菌为香蕉炭疽菌、芒果炭疽菌、珍珠李炭疽菌、葡萄座腔菌、香蕉尖孢镰刀菌4号或链格孢菌。
5.权利要求1所述鲤链霉菌在制备植物病原菌抑制剂中的应用。
6.权利要求1所述鲤链霉菌的发酵液在制备植物病原菌抑制剂中的应用。
7.权利要求1所述鲤链霉菌在促进香蕉生长中的应用。
8.权利要求1所述鲤链霉菌在制备香蕉生长促进剂中的应用。
9.权利要求1所述鲤链霉菌的发酵液在制备香蕉生长促进剂中的应用。
10.根据权利要求6或9所述的应用，其特征在于所述发酵液按以下制备：将鲤链霉菌接种至含有海盐的ISP2固体培养基上培养，再将菌块接种至发酵培养基，在28℃下培养，然后收集发酵液。
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