CN110468083B - 一株分离的链霉菌dl70及其生防促生应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株分离的链霉菌及其生防促生应用，属于生物技术领域。本发明所涉及的链霉菌(Streptomyces sp.)DL70，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO.M 2019475，保藏日期为2019年06月20日。该链霉菌分离于大连沿海滩涂健康植物根际的深层土壤，营养需求低，细胞生长快速，液体发酵48h即可实现有效活菌数不低于1010cfu/mL。本发明链霉菌(Streptomyces sp.)DL70及其发酵产物对多种植物病原真菌产生高效拮抗作用，同时显著促进植物快速生长，具有明显的生防促生应用优势与工业化生产潜力。

Description

一株分离的链霉菌DL70及其生防促生应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株分离的链霉菌及其在防治植物病害、促进植物生长中的应用。
背景技术
链霉菌是一种广泛分布在土壤、海洋以及极端环境的高G+C含量革兰氏阳性丝状放线菌，适宜生长温度在30℃左右，pH在7.0左右。链霉菌代谢途径复杂，能够合成包括大环内酯类、醌类、萜烯类、吲哚类、聚酮类、多肽类、酶类及脂类等在内的多种次级代谢产物，主要用于生产抗菌素、生长素、苯乙酸、琥珀酸及细胞分裂素等抗菌活性物质与植物生长必须调节剂，因而在医疗、农业、食品与环保等领域具有重要应用价值。其生防促生作用，一方面抑制多种植物病原真菌繁殖，防病保苗，另一方面刺激植物细胞分裂，促进植物生根发芽，有效提高农作物产量与品质。
现有链霉菌在好氧发酵过程中生长增殖速率相对缓慢，且有效活性物质主要来源于5-7天发酵的中后期的次级代谢产物，因而兼顾细胞生长与活性产物生产效率两方面特性筛选优良链霉菌菌株尤为重要。与此同时，提高具有生防促生作用的链霉菌细胞生长速率与有效活菌数，抗菌或促生活性产物浓度，简化营养需求，是实现生防促生菌剂生产制备和降低工业化生产成本的重要前提。
大连沿海滩涂环境由于具有强紫外线、低氧以及高盐等环境特点，促使链霉菌在长期适应性进化过程中表现出细胞生长或代谢产物合成等方面的遗传差异，因而在菌种资源发现和应用中具有重要的地位。目前，有关大连沿海滩涂地区土壤或植物根际来源的生防促生链霉菌研究还较少，因此以大连沿海滩涂的健康植物根际的深层土壤分离链霉菌具有重要生产价值和实际意义。
发明内容
为解决现有链霉菌生长速率缓慢，有效活菌数低的问题，本发明提供了一株分离的链霉菌，并提供了该菌株防治植物病害、促进植物生长中的应用。
本发明一方面提供了一株分离于大连沿海滩涂健康植物根际的深层土壤的菌株，该菌株分类命名为链霉菌(Streptomyces sp.)DL70，该菌株已于2019年6月20日在中国典型培养物保藏中心保藏(地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，邮编430072)，保藏编号为：CCTCC NO.M 2019475。
本发明第二方面提供了链霉菌(Streptomyces sp.)DL70在防治植物病害、促进植物生长中的应用。
上述应用中，所述植物病害由植物病原真菌引起，植物病原真菌包括黄瓜枯萎病菌、黄瓜黑斑病菌、番茄青枯病菌、辣椒疫霉病菌、马铃薯立枯病菌或油菜菌核病菌。
上述应用中，促进植物生长包括促进植物生根发芽。
具体的，所述植物为玉米、番茄、油菜、黄瓜和草莓。
本发明第三方面提供了一种用于防治植物病害、促进植物生长的菌剂，所述菌剂的有效作用成分为权利要求1所述链霉菌(Streptomyces sp.)DL70及其发酵产物或链霉菌(Streptomyces sp.)DL70的发酵菌液。
进一步地，所述菌剂按重量份由权利要求1所述链霉菌(Streptomyces sp.)DL70的发酵菌液90～100份，脱脂奶粉1～5份，微量元素营养液5～10份混合而成的液体菌剂。
更进一步地，所述微量元素营养液由下述质量比的原料组成：硫酸锌0.5-1％、硫酸亚铁0.1-0.2％、硫酸镁1-2％、硼砂1-2％、其余为无菌水。
上述用于防治植物病害、促进植物生长的菌剂，所述链霉菌(Streptomyces sp.)DL70≥1010cfu/mL。
本发明第四方面提供了链霉菌(Streptomyces sp.)DL70发酵液的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)无菌条件下将链霉菌(Streptomyces sp.)DL70接种于斜面培养基，28-32℃培养3天后，使用无菌水收集斜面培养基上孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
(2)在无菌条件下将上述步骤(1)中孢子悬液接种到液体种子培养基中，28-32℃，150-200rpm振荡培养24-48h，制备液体种子液；
(3)在无菌条件下，将上述步骤(3)中液体种子液按体积比5％～10％接入液体发酵培养基中，28-32℃，150-200rpm，通入无菌空气发酵培养24-48h，得到发酵菌液，所得发酵菌液中链霉菌(Streptomyces sp.)DL70≥1010cfu/mL。
进一步地，所述种子培养基或发酵培养基的组成按质量百分比为：蔗糖5％，玉米浆1.0％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.05％，硫酸亚铁0.01％；用50％氨水溶液将培养基pH调至7.0-7.5。
本发明的有益效果：本发明所提供的链霉菌(Streptomyces sp.)DL70，在液体发酵培养过程中，营养需求低，细胞生长快速且有效活菌数高，液体发酵48h即可实现有效活菌不低于1010cfu/mL，本发明菌株的这些优势是实现生防促生菌剂生产制备和降低大规模工业化生产成本的重要前提。此外，本发明菌株对植物病原真菌及植物病害具有高效的抑制作用，促进植物生长。本发明菌株及菌剂一方面丰富了生物菌剂与生物农药菌种资源，拓宽生防促生应用产品的功能化发展，另一方面提高作物产量和品质，促进农业可持续发展。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施例，下面将对所述实施例中所使用的附图作以简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1链霉菌(Streptomyces sp.)DL70菌丝与孢子形态图；
图2为实施例6中链霉菌(Streptomyces sp.)DL70发酵产物处理玉米种子5天后促生效果；a.无菌水处理，b.发酵产物原液处理，c.发酵产物稀释50倍处理，d.发酵产物稀释200倍处理。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明本发明内容，但不应该理解为对本发明的限制。若未特别说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：链霉菌(Streptomyces sp.)DL70的分离
本发明的链霉菌(Streptomyces sp.)DL70分离于大连沿海滩涂健康植物根际的深层土壤，对紧贴在根际末端上的土壤进行梯度稀释涂布后分离获得的。具体操作步骤为：
a.在大连星海滩涂健康作物根际的土壤，采样深度为15～20cm。称取根际土壤1g，放入加有玻璃珠的99mL无菌水的三角瓶中，于30℃，200rpm条件下振荡培养60min。
b.用移液枪进行梯度稀释(10-3、10-4、10-5)，取100μL稀释液涂布于高氏一号培养基平板上，每个稀释浓度涂布5个培养皿，30℃培养箱中培养3-5天。每天观察形成的放线菌菌落生长情况，挑取培养时间内最早形成的放线菌单菌落分别进行稀释划线分离培养，转接到高氏一号培养基上划线纯化与保藏。
所述高氏一号培养基组分组成为(g/L)：可溶性淀粉20、硝酸钾1、氯化钠0.5、磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.01，琼脂20。其余为水补足至1000mL，调pH到7.2-7.4，121℃高压湿热灭菌15min。
其中，在按不同稀释浓度所涂布的15个培养皿上，培养24h即出现生长最快的放线菌单菌落，纯化保藏后将该菌株命名为DL70。
实施例2：链霉菌(Streptomyces sp.)DL70的鉴定
菌株DL70形态特征如下：最适培养温度30℃条件下，在高氏一号培养基上培养3-5天后，形成菌落圆形致密且呈微黄色，基内菌丝无横隔、不断裂且呈玳瑁黄,气生菌丝分枝且呈粉红色，孢子丝呈直线状或波浪状，孢子呈椭圆或圆形，表面光滑，成熟时粉红发紫。依据《链霉菌鉴定手册》判断，菌株DL70具有典型链霉菌属形态特征(图1)。
提取上述分离并纯化得到的菌株DL70基因组DNA，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行16s rDNA测序分析(测序结果详见序列SEQ ID NO.1)，通过NCBI数据库中BLAST同源比对，选取同源性较高的模式菌株与菌株序列用ClustalX1.81软件进行多序列比对分析，同时结合菌落形态特征，初步鉴定分离纯化菌株为链霉菌(Streptomyces sp.)，已于2019年6月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，命名为链霉菌(Streptomyces sp.)DL70，以下叙述或简称链霉菌DL70，保藏编号为CCTCC NO.M 2019475，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
实施例3：链霉菌DL70发酵菌液的制备及其有效活菌数的测定
1.链霉菌DL70发酵菌液的制备
利用实施例2中获得的链霉菌DL70，先后进行孢子悬液制备、种子培养与发酵培养，具体操作步骤如下：
a.在无菌条件下将链霉菌DL70接种于斜面培养基，30℃培养3天后，使用无菌水收集斜面培养基上孢子，制备孢子浓度1010个/mL的孢子悬液；
b.在无菌条件下将上述步骤a中孢子悬液接种到液体种子培养基中，30℃，180rpm振荡培养24h，制备液体种子液；
c.在无菌条件下，将上述步骤b中液体种子液按体积比10％接入液体发酵培养基中，30℃，200rpm，通入无菌空气发酵培养48-72h，即得到链霉菌DL70发酵菌液。
所述种子培养基或发酵培养基组成为(g/L)：蔗糖50，玉米浆10，磷酸二氢钾5，硫酸镁1，硫酸锌0.5，硫酸亚铁0.01，用50％氨水溶液将培养基pH调至7.0-7.5。
2.链霉菌DL70发酵菌液有效活菌数的测定
在无菌条件下，取上述步骤c中48h与72h培养后的链霉菌DL70发酵菌液，用移液枪进行梯度稀释(10-7、10-8、10-9)，取100μL稀释液涂布于高氏一号培养基平板上，每个稀释浓度涂布5个培养皿，30℃培养箱中培养3-5天后进行平板菌落计数，结果取平均值，如表1所示。
表1链霉菌DL70发酵菌液有效活菌数
Figure BDA0002208118990000041
结果表明，链霉菌DL70具有快速生长的生理特性，发酵48h即可实现有效活菌数≥1010cfu/mL。
实施例4：链霉菌DL70发酵菌液的生防作用
利用无菌水将实施例3中获得的链霉菌DL70发酵菌液进行梯度稀释50～200倍，置于4℃环境冷藏备用。在PDA培养基平板中央位置接入新鲜的黄瓜枯萎病菌、黄瓜黑斑病菌、番茄青枯病菌、辣椒疫霉病菌、马铃薯立枯病菌以及油菜菌核病菌菌饼(用打孔器打下5mm大小的真菌菌饼进行接种)，在距离平板中心菌饼5cm处固定5mm大小的无菌滤纸圆片，在其上分别接入链霉菌DL70发酵菌液原液与梯度稀释后的发酵菌液，于30℃恒温倒置对峙培养，3-5天后观察并记录抑菌带的有无以及大小。每个处理设置三次重复，结果取平均值。
表2链霉菌DL70发酵菌液(48h)对植物病原真菌的拮抗作用
Figure BDA0002208118990000051
由上表结果可知，本发明链霉菌DL70只需发酵48h，其发酵菌液对黄瓜枯萎病菌、黄瓜黑斑病菌、番茄青枯病菌、辣椒疫霉病菌、马铃薯立枯病菌已表现出良好的抑菌效果，表明链霉菌DL70在快速生长同时，促生与抑菌活性产物生产强度大幅提升；以链霉菌DL70发酵菌液为主要有效成分的菌剂对黄瓜枯萎病菌、黄瓜黑斑病菌、番茄青枯病菌、辣椒疫霉病菌、马铃薯立枯病菌有抑制作用。
实施例5：链霉菌DL70发酵产物的促生作用
将玉米种子在60℃烘箱中烘2h，然后用1％的NaClO浸泡15s，无菌水漂洗5次后，转移到无菌毛巾上，晾干。对实施例4中稀释50和200倍后的链霉菌DL70发酵菌液进行离心去除菌体，利用上述稀释后的链霉菌DL70发酵产物分别浸泡上述玉米种子半小时，播种于无菌的按照体积比1:1混和的基质和砂子中。每种处理重复3次，每次15颗种子，共45颗种子，以等体积无菌水处理的种子为对照，在一周内每天分别记录各组出根种子数与发芽种子数，最终计算出根率与发芽率。
表3链霉菌DL70发酵产物(48h)对玉米种子的促生作用
Figure BDA0002208118990000061
由上表3可看出，稀释50倍后的链霉菌DL70发酵产物对玉米具有高效的促生作用，处理仅5天即可实现玉米种子100％出根发芽(图2)，处理7天后玉米种子最长根可达10cm。同时，实验过程发现链霉菌DL70发酵产物原液并不能很好的快速促进种子出根发芽，是由于发酵产物原液中过高浓度的植物促生激素所致反馈抑制，进而影响了促生作用。
实施例6：链霉菌DL70菌剂的制备
将实施例3中获得的链霉菌DL70发酵菌液与脱脂奶粉，微量金属元素营养液混合制备成液体菌剂，具体操作步骤为：按重量份称取95份链霉菌DL70的发酵菌液，2份脱脂牛奶与5份微量营养液，混合均匀，即得液体菌剂，其中微量元素营养液组成为(g/L)：硫酸锌5、硫酸亚铁1、硫酸镁1.5、硼砂10、其余为无菌水。脱脂奶粉与微量营养液起到菌剂贮存过程中的稳定保护作用，该液体菌剂使用时可根据实际需要作以稀释使用。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 大连理工大学 大连金微德生物科技有限公司
<120> 一株分离的链霉菌DL70 及其生防促生应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gatgaagcct 60
ttcggggtgg attagtggcg aacgggtgag taacacgtgg gcaatctgcc cttcactctg 120
ggacaagccc tggaaacggg gtctaatacc ggataacact ctgtcctgca tgggacgggg 180
ttaaaagctc cggcggtgaa ggatgagccc gcggcctatc agcttgttgg tggggtaatg 240
gcctaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggcg accggccaca ctgggactga 300
gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgaaagc 360
ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct ctttcagcag 420
ggaagaagcg aaagtgacgg tacctgcaga agaagcgccg gctaactacg tgccagcagc 480
cgcggtaata cgtagggcgc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag agctcgtagg 540
cggcttgtca cgtcggatgt gaaagcccgg ggcttaaccc cgggtctgca ttcgatacgg 600
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aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgttgggaa 780
ctaggtgttg gcgacattcc acgtcgtcgg tgccgcagct aacgcattaa gttccccgcc 840
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ggagcatgtg gcttaattcg acgcaacgcg aagaacctta ccaaggcttg acatataccg 960
gaaagcatca gagatggtgc cccccttgtg gtcggtatac aggtggtgca tggctgtcgt 1020
cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgttctgtgt 1080
tgccagcatg cccttcgggg tgatggggac tcacaggaga ctgccggggt caactcggag 1140
gaaggtgggg acgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc ttgggctgca cacgtgctac 1200
aatggccggt acaatgagct gcgatgccgc gaggcggagc gaatctcaaa aagccggtct 1260
cagttcggat tggggtctgc aactcgaccc catgaagtcg gagttgctag taatcgcaga 1320
tcagcattgc tgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacgtcacga 1380
aagtcggtaa cacccgaagc cggtggccca accccttgtg ggagggagct gtcgaaggtg 1440
ggactggcga ttgggacgaa gtcgtaacaa ggtagccgta ccggaaggtg a 1491

Claims (7)

1.一株链霉菌(Streptomyces sp.)DL70，其保藏编号为：CCTCC NO.M 2019475。
2.根据权利要求1所述的链霉菌(Streptomyces sp.)DL70在防治植物病害或促进植物生长中的应用；
所述植物病害由植物病原真菌引起，植物病原真菌为黄瓜枯萎病菌、黄瓜黑斑病菌、番茄青枯病菌、辣椒疫霉病菌、马铃薯立枯病菌或油菜菌核病菌；
所述植物为玉米、番茄、油菜、黄瓜和草莓。
3.一种用于防治植物病害或促进植物生长的菌剂，其特征在于，所述菌剂的有效作用成分为权利要求1所述链霉菌(Streptomyces sp.)DL70及其发酵产物或链霉菌(Streptomyces sp.)DL70的发酵菌液。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂按重量份由权利要求1所述链霉菌(Streptomyces sp.)DL70的发酵菌液90～100份，脱脂奶粉1～5份，微量元素营养液5～10份混合而成的液体菌剂；
所述微量元素营养液由下述质量比的原料组成：硫酸锌0.5-1％、硫酸亚铁0.1-0.2％、硫酸镁1-2％、硼砂1-2％、其余为无菌水。
5.根据权利要求3或4所述的菌剂，其特征在于，所述链霉菌(Streptomyces sp.)DL70≥1010cfu/mL。
6.权利要求1所述的链霉菌(Streptomyces sp.)DL70的发酵液的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
(1)无菌条件下将链霉菌(Streptomyces sp.)DL70接种于斜面培养基，28-32℃培养3天后，使用无菌水收集斜面培养基上的孢子，制备孢子浓度108-1010个/mL的孢子悬液；
(2)在无菌条件下将上述步骤(1)中孢子悬液接种到液体种子培养基中，28-32℃，150-200rpm振荡培养24-48h，制备液体种子液；
(3)在无菌条件下，将上述步骤(2)中液体种子液按体积比5％～10％接入液体发酵培养基中，28-32℃，150-200rpm，通入无菌空气发酵培养24-48h，得到发酵菌液，所得发酵菌液中链霉菌(Streptomyces sp.)DL70≥1010cfu/mL。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基或发酵培养基的组成按质量百分比为：蔗糖5％，玉米浆1.0％，磷酸二氢钾0.5％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.05％，硫酸亚铁0.01％；用50％氨水溶液将培养基pH调至7.0-7.5。
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