CN113801819B

CN113801819B - 一株产炭疽霉素的环圈链霉菌及生产方法

Info

Publication number: CN113801819B
Application number: CN202111129757.7A
Authority: CN
Inventors: 尹敏; 周皓; 丁中涛; 任禛; 陈秀; 保红坤
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2021-09-26
Filing date: 2021-09-26
Publication date: 2023-06-09
Anticipated expiration: 2041-09-26
Also published as: CN113801819A

Abstract

本发明提供了一株产炭疽霉素的极暗黄链霉菌及生产方法，涉及抗生素生产技术领域。本发明所述极暗黄链霉菌YINM00001的保藏编号为GDMCC No.61693。利用所述极暗黄链霉菌YINM00001进行有氧发酵，发酵结束后，发酵液经高效液相色谱分析，发酵液中炭疽霉素浓度为5.67～6.13mg/L。用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液三次，真空浓缩得到粗提物，经高效液相色谱检测粗提物，其主要代谢产物含量可达粗提物的1.89～2.04％，经高效液相色谱分析其纯度可达96～98％，具有成本低，过程简单，环境友好，易于大量生产等特点。

Description

一株产炭疽霉素的环圈链霉菌及生产方法

技术领域

本发明属于抗生素生产技术领域，具体涉及一株产炭疽霉素的环圈链霉菌及生产方法。

背景技术

近年来，因为微生物具有代谢周期短、反应条件温和、副产物少、立体选择性强等特点，通过微生物发酵来制备目标活性化合物的方法越来越受到人们的重视。在实际生产中，已经有大量的应用实例通过微生物发酵来生产一些具有药用价值或经济价值的化合物。

炭疽霉素(anthracimycin)是2013年首次从海洋放线菌中分离发现的一种聚酮类化合物，它是炭疽杆菌的强效抑制剂，而且对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪链球菌等革兰氏阳性菌均具有显著的生长抑制作用。同时，炭疽霉素可作为雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂，能够有效抑制肝癌细胞的增殖。综上所述，炭疽霉素作为药物先导化合物具有较好的研究开发潜力。

目前炭疽霉素的获得主要通过微生物发酵代谢产物的分离纯化，而能够代谢产生炭疽霉素的菌株多为海洋或盐田来源放线菌，它们代谢炭疽霉素的产量约为1.24～1.91mg/L，过低的产量使得对炭疽霉素的开发利用受到制约。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株产炭疽霉素的环圈链霉菌及生产方法，产量高，具有成本低，过程简单，环境友好，易于大量生产等特点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株产炭疽霉素的环圈链霉菌(Streptomyces anulatus)YINM00001，所述环圈链霉菌YINM00001的保藏编号为GDMCC No.61693。

优选的，所述环圈链霉菌YINM00001的特征序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种利用上述环圈链霉菌YINM00001生产炭疽霉素的方法，包括以下步骤：

将所述环圈链霉菌YINM00001的种子液接种于发酵培养基上进行有氧发酵，得发酵液；所述发酵培养基包括以下质量体积百分含量的组分：2～8％可溶性淀粉、1～4％玉米浸膏、0.01～0.1％KH₂PO₄、0.01～0.05％MgSO₄、0.001～0.005％ZnSO₄·7H₂O、0.01～0.02％甲硫氨酸、0.01～0.02％维生素B12、0.1～0.5％CaCO₃和余量的水，pH值6.0～8.0；

利用乙酸乙酯萃取所述发酵液，浓缩后分离所述炭疽霉素。

优选的，所述种子液的接种体积与所述发酵培养基的体积比为5～10％。

优选的，所述有氧发酵伴随搅拌，所述有氧发酵的温度为28℃，时间为10～15d。

优选的，所述搅拌的转速为200rpm。

优选的，所述种子液的制备方法，包括：将所述环圈链霉菌YINM00001接种于活化培养基上，进行活化培养，得活化菌株；所述活化培养基包括以下质量体积百分含量的组分：0.2～0.8％酵母粉、0.2～0.8％葡萄糖、0.1～0.6％麦芽膏、0.1％生理盐水、1.5％琼脂和余量的水，所述活化培养基中还包括0.5～3mg/L复合维生素，pH值6.0～8.0；

将活化菌株接种于种子培养基中进行种子培养，得种子液；所述种子培养基包括以下质量体积百分含量的组分：0.2～0.8％酵母粉、0.2～0.8％葡萄糖、0.1～0.6％麦芽膏、0.1％生理盐水和余量的水，所述活化培养基中还包括0.5～3mg/L复合维生素，pH值6.0～8.0。

优选的，所述活化培养为恒温培养，所述恒温培养的温度为28℃，时间为3d。

优选的，所述种子培养伴随搅拌，搅拌速率为200rpm；所述种子培养的温度为28℃，时间为3d。

优选的，所述分离的方法包括柱层析法。

有益效果：本发明提供了一株产炭疽霉素的环圈链霉菌YINM00001，自云南昆明石蝉草中分离得到的一种内生放线菌。利用所述环圈链霉菌YINM00001进行有氧发酵，发酵结束后，发酵液经高效液相色谱分析，发酵液中炭疽霉素浓度为5.67～6.13mg/L。用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液三次，真空浓缩得到粗提物，经高效液相色谱检测粗提物，其主要代谢产物含量可达粗提物的1.89～2.04％，经高效液相色谱分析其纯度可达96～98％，具有成本低，过程简单，环境友好，易于大量生产等特点。

生物保藏信息

环圈链霉菌(Streptomyces anulatus)YINM00001，于2021年8月2日保藏于广东省微生物菌株保藏中心(简称GDMCC)，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号GDMCC No.61693。

具体实施方式

本发明所述YINM00001菌株筛选分离自云南昆明石蝉草，为内生放线菌，革兰氏阳性，菌落形态为圆形，周围有不规则丝状凸起，菌落颜色为白色，中间有浅灰色。

本发明所述环圈链霉菌YINM00001的16S rRNA序列优选如SEQ ID No.1所示：ACGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCTTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACTCTGTCCCGCATGGGACGGGGTTAAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATG CGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATGCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTTT。

将所述环圈链霉菌YINM00001的种子液接种于发酵培养基上进行有氧发酵，得发酵液；所述发酵培养基以水为溶剂，包括以下质量体积百分含量的组分：2～8％可溶性淀粉、1～4％玉米浸膏、0.01～0.1％KH₂PO₄、0.01～0.05％MgSO₄、0.001～0.005％ZnSO₄·7H₂O、0.01～0.02％甲硫氨酸、0.01～0.02％维生素B12、0.1～0.5％CaCO₃，pH值6.0～8.0；

利用乙酸乙酯萃取所述发酵液，浓缩后分离所述炭疽霉素。

本发明所述种子液的接种体积与所述发酵培养基的体积比优选为5～10％。本发明在所述种子液接种后进行有氧发酵，所述有氧发酵优选伴随搅拌，所述有氧发酵的温度优选为28℃，时间优选为10～15d。本发明所述搅拌的速度优选为200rpm。

在本发明中，所述种子液的制备方法，优选包括：将所述环圈链霉菌YINM00001接种于活化培养基上，进行活化培养，得活化菌株；所述活化培养基以水为溶剂，包括以下质量体积百分含量的组分：0.2～0.8％酵母粉、0.2～0.8％葡萄糖、0.1～0.6％麦芽膏、0.1％生理盐水、1.5％琼脂和余量的水，所述活化培养基中还包括0.5～3mg/L复合维生素，pH值6.0～8.0；

本发明所述活化培养优选为恒温培养，所述恒温培养的温度优选为28℃，时间优选为3d。在本发明实施例中，所述活化培养优选为将所述菌株接种于经消毒的斜面培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养3d。

本发明所述种子培养优选伴随搅拌，搅拌速率优选为200rpm；所述种子培养的温度优选为28℃，时间优选为3d。

本发明经所述有氧发酵后，利用乙酸乙酯萃取所述发酵液，浓缩后分离所述炭疽霉素优选的，所述分离的方法包括柱层析法。本发明所述萃取时优选利用与所述发酵液等体积的乙酸乙酯进行三次萃取，而后经真空浓缩得粗提取；而后经过反相硅胶柱层析分离(甲醇-水梯度洗脱)，得到代谢产物炭疽霉素。在本发明实施例中，通过NMR以及HR-ESI-MS鉴定确定代谢产物炭疽霉素的结构，证实均如下所示：

利用本发明所述环圈链霉菌YINM00001发酵代谢制备炭疽霉素，发酵液中的炭疽霉素浓度可达5.67～6.13mg/L，提取分离后纯度可达到96～98％。

下面结合实施例对本发明提供的一株产炭疽霉素的环圈链霉菌及生产方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

从云南昆明石蝉草中获得的内生放线菌环圈链霉菌YINM00001。下面一段描述的就是分离过程。

将采自云南昆明的石蝉草通过次氯酸钠溶液(有效氯浓度5.0％)、75％乙醇浸泡和无菌水洗涤工艺进行表面灭菌，然后把处理成小块的植物组织放置在经121℃灭菌的活化培养基(质量体积百分比计：0.4％酵母粉、0.4％葡萄糖、0.3％麦芽膏、0.1％生理盐水、1mg/L复合维生素、1.5％琼脂、pH 7.0)表面，28℃培养7天，使用121℃灭菌的所述活化培养基连续纯化5代得到多株内生菌，通过菌落形态鉴定和测定16S rRNA序列(SEQ ID NO.1)，判断为环圈链霉菌Streptomyces anulatus，菌株命名为YINM00001。

实施例2

菌体活化：将环圈链霉菌YINM00001接种到经过121℃高温灭菌30min的活化培养基斜面，置于28℃恒温培养箱中培养3d。

菌种制备：将活化的菌体接入121℃高温灭菌30min的种子培养基(质量体积百分比计：0.4％酵母粉、0.4％葡萄糖、0.3％麦芽膏、0.1％生理盐水、1mg/L复合维生素、pH7.0)中，28℃，200rpm下进行发酵3d。

发酵过程：将制备好的菌种按照体积分数5％加入121℃高温灭菌30min的发酵培养基中(4％可溶性淀粉、1％玉米浸膏、0.05％KH₂PO₄、0.025％MgSO₄、0.004％ZnSO₄·7H₂O、0.01％甲硫氨酸、0.01％维生素B12、0.5％CaCO₃、pH 7.0)，28℃，200rpm下进行发酵10d。

发酵结束后，发酵液经高效液相色谱分析，发酵液中炭疽霉素浓度为5.67mg/L。

用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液三次，真空浓缩得到粗提物，经高效液相色谱检测粗提物，其主要代谢产物含量达粗提物的1.92％。经过反相硅胶柱层析分离(甲醇-水梯度洗脱)，得到代谢产物炭疽霉素的纯度为96％。

实施例3

除发酵培养时接种量为10％外，其余参数均与实施例2相同。

发酵结束后，发酵液经高效液相色谱分析，发酵液中炭疽霉素浓度为5.93mg/L。

用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液三次，真空浓缩得到粗提物，经高效液相色谱检测粗提物，其主要代谢产物含量达粗提物的1.89％。经过反相硅胶柱层析分离(甲醇-水梯度洗脱)，得到代谢产物炭疽霉素的纯度为96％。

实施例4

除发酵培养时接种10％和发酵15d外，其余参数均与实施例2相同。

发酵结束后，发酵液经高效液相色谱分析，发酵液中炭疽霉素浓度为6.13mg/L。

用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液三次，真空浓缩得到粗提物，经高效液相色谱检测粗提物，其主要代谢产物含量达粗提物的2.04％。经过反相硅胶柱层析分离(甲醇-水梯度洗脱)，得到代谢产物炭疽霉素的纯度为98％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 云南大学

<120> 一株产炭疽霉素的极暗黄链霉菌及生产方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1523

<212> DNA

<213> 极暗黄链霉菌(Streptomyces fulvissimus)

<400> 1

acggagagtt tgatcctggc tcaggacgaa cgctggcggc gtgcttaaca catgcaagtc 60

gaacgatgaa gcctttcggg gtggattagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgggcaatc 120

tgcccttcac tctgggacaa gccctggaaa cggggtctaa taccggataa cactctgtcc 180

cgcatgggac ggggttaaaa gctccggcgg tgaaggatga gcccgcggcc tatcagcttg 240

ttggtggggt aatggcctac caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc 300

cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca 360

caatgggcga aagcctgatg cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa 420

acctctttca gcagggaaga agcgaaagtg acggtacctg cagaagaagc gccggctaac 480

tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg gcgcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt 540

aaagagctcg taggcggctt gtcacgtcgg atgtgaaagc ccggggctta accccgggtc 600

tgcattcgat acgggctagc tagagtgtgg taggggagat cggaattcct ggtgtagcgg 660

tgaaatgcgc agatatcagg aggaacaccg gtggcgaagg cggatctctg ggccattact 720

gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780

gtaaacgttg ggaactaggt gttggcgaca ttccacgtcg tcggtgccgc agctaacgca 840

ttaagttccc cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900

cccgcacaag cagcggagca tgtggcttaa ttcgacgcaa cgcgaagaac cttaccaagg 960

cttgacatat accggaaagc atcagagatg gtgcccccct tgtggtcggt atacaggtgg 1020

tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080

cccttgttct gtgttgccag catgcccttc ggggtgatgg ggactcacag gagactgccg 1140

gggtcaactc ggaggaaggt ggggacgacg tcaagtcatc atgcccctta tgtcttgggc 1200

tgcacacgtg ctacaatggc cggtacaatg agctgcgatg ccgcgaggcg gagcgaatct 1260

caaaaagccg gtctcagttc ggattggggt ctgcaactcg accccatgaa gtcggagttg 1320

ctagtaatcg cagatcagca ttgctgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc 1380

ccgtcacgtc acgaaagtcg gtaacacccg aagccggtgg cccaacccct tgtgggaggg 1440

agctgtcgaa ggtgggactg gcgattggga cgaagtcgta acaaggtagc cgtaccggaa 1500

ggtgcggctg gatcacctcc ttt 1523

Claims

1.一株环圈链霉菌（Streptomyces anulatus）YINM00001，其特征在于，所述环圈链霉菌YINM00001的保藏编号为GDMCC No.61693。

2.一种利用权利要求1所述环圈链霉菌YINM00001生产炭疽霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所述环圈链霉菌YINM00001的种子液接种于发酵培养基上进行有氧发酵，得发酵液；所述发酵培养基包括以下质量体积百分含量的组分：2~8%可溶性淀粉、1~4%玉米浸膏、0.01~0.1% KH₂PO₄、0.01~0.05% MgSO₄、0.001~0.005% ZnSO₄·7H₂O、0.01~0.02%甲硫氨酸、0.01~0.02%维生素B12、0.1~0.5% CaCO₃和余量的水，pH值6.0~8.0；

利用乙酸乙酯萃取所述发酵液，浓缩后分离所述炭疽霉素；所述炭疽霉素的结构如式I所示：

式I。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述种子液的接种体积与所述发酵培养基的体积比为5~10%。

4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述有氧发酵伴随搅拌，所述有氧发酵的温度为25-30℃，时间为10~15d。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述搅拌的转速为200rpm。

6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述种子液的制备方法，包括：将所述环圈链霉菌YINM00001接种于活化培养基上，进行活化培养，得活化菌株；所述活化培养基包括以下质量体积百分含量的组分：0.2~0.8%酵母粉、0.2~0.8%葡萄糖、0.1~0.6%麦芽膏、0.1%生理盐水、1.5%琼脂和余量的水，所述活化培养基中还包括0.5~3mg/L复合维生素，pH 值6.0~8.0；

将活化菌株接种于种子培养基中进行种子培养，得种子液；所述种子培养基包括以下质量体积百分含量的组分：0.2~0.8%酵母粉、0.2~0.8%葡萄糖、0.1~0.6%麦芽膏、0.1%生理盐水和余量的水，所述活化培养基中还包括0.5~3mg/L复合维生素，pH 值6.0~8.0。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述活化培养为恒温培养，所述恒温培养的温度为28℃，时间为3d。

8.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述种子培养伴随搅拌，搅拌速率为200rpm；所述种子培养的温度为28℃，时间为3d。

9.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述分离的方法包括柱层析法。