CN115058363B - 一株教酒色链霉菌及其在提高甘蔗耐盐性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株教酒色链霉菌及其在提高甘蔗耐盐性中的应用。该教酒色链霉菌YS36保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名为Streptomyces chartreusis YS36，保藏日期为2022年2月21日，保藏编号为CCTCC NO:M 2022140。教酒色链霉菌YS36的气生菌丝为绿色，基质菌丝呈乳白色，不透明，表面有孢子形成，边缘规则，有晕环。在盐胁迫下接种教酒色链霉菌YS36能显著提高甘蔗叶片叶绿素含量，增强叶片保水性，显著促进甘蔗地上部和根部的生物量积累，有助于提高甘蔗对盐胁迫的耐受性。

Description

一株教酒色链霉菌及其在提高甘蔗耐盐性中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株教酒色链霉菌及其在提高甘蔗耐盐性中的应用。
背景技术
盐胁迫是植物生长在盐沼中或在其他过度盐分的条件下，施加在植物身上的渗透力。在大多数的盐胁迫中，氯化钠是主要成分，高浓度时会导致植物生长受阻。灌溉过程中排水不良是土壤盐化的一个重要原因。植物细胞中存在高浓度的内外盐离子是有毒的，而细胞中这些高浓度离子的存在实际上会抑制植物的生长。受盐渍影响的土壤含有大量的可溶性盐分，这些盐分存在于土壤的孔隙结构中。土壤盐分积聚的主要原因是灌溉水淋失和排水不足。灌溉用水中含有硫酸盐、碳酸氢盐、氯化物、镁、碳酸盐、钙、钾和钠等盐类离子。土壤主要受盐分影响，盐分对植物生长和产量有不利影响。就全球范围内的环境胁迫而言，盐分胁迫被认为是最严重的胁迫，不仅影响土壤的发育，而且影响生物的生长。
土壤盐化是限制作物产量的重要环境因素之一，有相当一部分盐碱地分布在沿海地区。甘蔗是主要的糖料作物之一，沿海地区作为甘蔗种植区，土壤盐化制约了当地甘蔗的生长生产。在盐胁迫下的植物首先出现的的症状是生长停滞，此外，植物叶片也表现出肉质化，新叶出苗较慢，老叶衰老较早。甘蔗属中度耐盐作物，一般在土壤含盐量0.3％以下才能生长正常。盐害会延迟甘蔗的萌芽，影响甘蔗的发芽率和生长，降低甘蔗生物量。盐胁迫是导致甘蔗产量和糖分下降的主要因素之一。
现今土壤盐化的治理主要通过合理排灌、施用CaCO3、淡水洗涤等方法改良盐渍土，但成本高，不易见效，且随着农药、化肥等大量化学物质的施入更加剧了土壤的次生盐渍化，严重影响了甘蔗产区的正常生产。
植物生长促进菌(PGPR)可以通过不同的方法极大地促进许多谷物和其他重要农作物的植物生长，例如直接和间接产生不同的植物激素，触发抗氧化系统、产生铁载体、增强植物的营养能力、促进有机质的矿化和分解，提高不同矿质养分(如铁和磷)的生物有效性。这些细菌与其他微生物一起构建了植物根系的微环境，在不同的环境胁迫条件下促进植物生长。PGPR是缓解不同生物和非生物胁迫的廉价且容易获得的资源。Wang Z等分离得到了甘蔗根际放线菌(Streptomyces chartreusis)WZS021菌株，并发现了其可以提高甘蔗的耐旱性能(Wang Z,Solanki M K,Yu Z X,et al.Draft genome analysis offersinsights into the mechanism by which Streptomyces chartreusis WZS021increases drought tolerance in sugarcane[J].Frontiers in microbiology,2019,9:3262.)。鉴于植物生长促进菌在逆境中的重要作用，利其在缓解盐胁迫和植物生长发育中的重要作用，开发可直接应用提高植物耐盐性的微生物菌剂具有较高的可行性。通过施用微生物菌剂提高甘蔗在盐胁迫下的耐受性，是利用盐碱地的一条经济而有效的途径，并且有环境友好、成本低的优势。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株耐盐促生菌菌株教酒色链霉菌(Streptomyceschartreusis)YS36，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉武汉大学)，分类命名为Streptomyces chartreusis YS36，保藏日期为2022年2月21日，保藏编号为CCTCC NO:M 2022140。
上述的教酒色链霉菌YS36在高氏一号培养基上的气生菌丝为绿色，基质菌丝呈乳白色，不透明，表面有孢子形成，边缘规则，有晕环。
其中，所述高氏一号培养基配方：可溶性淀粉20.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硝酸钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L、氯化钠0.5g/L、琼脂15.0g/L，pH 7.0～7.5，可通过商业途径获得。
所述教酒色链霉菌YS36适宜生长的温度为18～37℃，pH为5～8，盐浓度为200～1500mmol/L。
本发明目的之二在于提供一种含有所述教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂，所述微生物菌剂中教酒色链霉菌YS36的活菌数量不低于108cfu/mL。
所述微生物菌剂中添加以延长菌株活性时间为目的的辅料，或其他微生物菌剂可接受的辅料之后，所得到的微生物菌剂产品，也属于本发明的保护范围。
上述含有所述教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
将教酒色链霉菌YS36接种到LB液体培养基中，在温度为35℃、转速180rpm条件下培养3天，获得发酵液。之后8000rpm离心后用无菌水清洗2～3次，使用无菌水调节菌液浓度为108～109cfu/mL，获得本发明的微生物菌剂。
所述LB液体培养基配方：胰蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、氯化钠10.0g/L，pH7.0～7.2，可通过商业途径获得。
本发明目的之三在于提供上述教酒色链霉菌YS36在提高甘蔗对盐胁迫耐受性中的应用。具体的，将教酒色链霉菌YS36菌悬液接入到盐胁迫下的甘蔗幼苗根际土壤中，互作20～30天，结果发现教酒色链霉菌YS36可以减缓盐害现象，提高了甘蔗的耐盐性。所述教酒色链霉菌YS36菌悬液是菌液浓度为108～109cfu/mL的教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一株耐盐促生菌菌株教酒色链霉菌YS36，接种该菌株能显著提高盐胁迫下甘蔗的耐盐能力，将该菌株制成微生物菌剂，然后用浇灌方式注入甘蔗幼苗根围土壤中，能明显增加甘蔗的生物量，显著促进甘蔗幼苗的干物质积累，减缓了盐害现象，从而促进甘蔗的生长，有助于提高甘蔗的耐盐性，减少化学肥料的使用。另外，该耐盐促生菌菌株性能稳定，适应能力强，微生物菌剂制备方法简单，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是教酒色链霉菌YS36在高氏一号培养基上的菌落形态。
图2是基于教酒色链霉菌YS36的16S rRNA基因所构建的系统发育进化树。图中Y36表示教酒色链霉菌YS36。
图3是盐胁迫下接种教酒色链霉菌YS36的甘蔗叶片SPAD值的变化(*表示有显著性差异)。图中Y36表示教酒色链霉菌YS36。
图4是盐胁迫下接种教酒色链霉菌YS36的甘蔗叶片24h、48h失水率的变化(*表示有显著性差异，**表示有极显著性差异)。图中Y36表示教酒色链霉菌YS36。
图5是盐胁迫下接种教酒色链霉菌YS36的甘蔗鲜重的变化(*表示有显著性差异，**表示有极显著性差异)。图中Y36表示教酒色链霉菌YS36。
图6是盐胁迫下接种教酒色链霉菌YS36的甘蔗干重的变化(*表示有显著性差异，**表示有极显著性差异)。图中Y36表示教酒色链霉菌YS36。
保藏信息
教酒色链霉菌YS36：
保藏时间：2022年2月21日；
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；
保藏编号：CCTCC NO:M2022140；
保藏单位地址：中国武汉武汉大学；
分类命名：Streptomyces chartreusis YS36。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。
实施例1：促生菌株教酒色链霉菌YS36的分离及形态特征
从广西大学农学院甘蔗实验基地取健康甘蔗植株根际土壤1g，用无菌水稀释10、100、1000、10000倍，涂布于含有50mg/L放线菌酮的高氏一号培养基，35℃培养3d后挑取单菌落，再次接种至含有50g/L氯化钠的高氏一号培养基，35℃培养3d后获得目的菌株，将得到的菌株接种至LB液体培养基中35℃振荡培养3d后，将菌液保存于含有30％甘油的冻存管中。
所述高氏一号培养基成分为：可溶性淀粉20.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硝酸钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸亚铁0.01g/L、氯化钠0.5g/L、琼脂15.0g/L，pH 7.0～7.5，可通过商业途径获得。
所述LB液体培养基配方成分：胰蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、氯化钠10.0g/L，pH 7.0～7.2g/L，可通过商业途径获得。
将分离得到的菌株在高氏一号培养基上划线培养，5d后观察菌落形态，其特征为气生菌丝为绿色，基质菌丝呈乳白色，不透明，表面有孢子形成，边缘规则，有晕环，如图1所示，将其标记为Y36。
实施例2：促生菌株教酒色链霉菌YS36的分子鉴定
提取菌株YS36的基因组DNA作为模板，使用16S rRNA通用引物对27F(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-ACGGATACCTTGTTACGACTT-3’)扩增菌株YS36的16S rRNA序列。PCR扩增体系为：2×PCR MasterMix 25微升，上游引物2微升，下游引物2微升，DNA模板1微升，ddH2O 20微升。PCR程序条件：预变性：94℃，2min；变性94℃，30s，退火55，30s，延伸，72℃，1.5min(共35个循环)；延伸72℃，7min；4℃保存。
使用凝胶成像系统观察到单一的、约为1.5kb的PCR产物条带，将其送至上海生工生物工程有限公司测序，测序显示该条带为1421bp，序列如SEQ ID NO:1所示。将测序结果在NCBI中进行Blast比对，结果如图2所示，确定该菌株为教酒色链霉菌(Streptomyceschartreusis)，命名为教酒色链霉菌YS36。
将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉武汉大学)，分类命名为Streptomyces chartreusis YS36，保藏日期为2022年2月21日，保藏编号为CCTCC NO:M2022140。
实施例3：教酒色链霉菌YS36微生物菌株的制备
将教酒色链霉菌YS36接种到LB液体培养基中，在温度为35℃，转速180rpm条件下培养3天，获得培养液。培养液8000rpm离心后用无菌水清洗2～3次，使用无菌水调节菌液浓度为107、108、109cfu/mL，获得微生物菌剂。将得到的微生物菌剂放入冰箱4℃保存，2d内可使用，使用前应重新摇晃容器使活菌重新悬浮。
实施例4：盐胁迫下微生物菌剂的施用方法
选取新台糖22号甘蔗的健康种茎，砍成双芽段，在56℃水中浸泡0.5h后转移到沙床中育苗。15d后将长势一致的甘蔗苗移栽至直径40cm、高35cm的塑料盆中，每盆为3株甘蔗苗。30d后用0.3mol/L浓度的NaCl溶液对甘蔗进行处理，每隔5d浇1次NaCl溶液，此为对照。取实施例3中制备的3个浓度(107、108、109cfu/mL)的教酒色链霉菌YS36菌悬液100mL接入对照的盆栽中，此为处理一、二、三；对照、处理一、处理二和处理三每个处理种植10盆。
实施例5：盐胁迫下接种教酒色链霉菌YS36后甘蔗生理指标的变化30d后对实施例4的对照、处理一、处理二和处理三取样，测定甘蔗的生理指标：叶片SPAD值，失水率，地上部、根部干鲜重。结果详见表1：
表1盐胁迫下不同浓度菌液对比实验情况
SPAD值可以反映植物叶片中叶绿素的相对含量，SPAD值越大叶绿素含量越高。由表1可知盐胁迫下接种含有108、109cfu/mL教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂处理后的甘蔗叶片SPAD值显著高于对照CK，说明在盐胁迫下接种含有教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂有利于提高甘蔗叶片叶绿素含量。其中，含有108cfu/mL教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂处理后的甘蔗叶片SPAD值比对照CK高13.2％，如图3所示。含有109cfu/mL教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂处理后的甘蔗叶片SPAD值也比对照CK高13.2％。
保水力(失水率)测定方法：取叶片称其鲜重，在恒温20℃条件下，经24、48h后再对叶片称重，用2次重量之差与第1次重量之比(即失水量)表示。从表1可以看出，对照CK的甘蔗叶片在20℃恒温下的失水很快，24h失水率达49.8％，48h失水率更是达到了70.8％。盐胁迫下接种含有107、108、109cfu/mL教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂处理后的甘蔗叶片，24h和48h失水率均显著下降，说明在盐胁迫下，给甘蔗植株接种含有教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂能降低叶片失水率，提高植株保水能力。其中，含有107cfu/mL教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂处理后的甘蔗叶片，24h和48h失水率分别下降了1.7％和2.7％。含有108cfu/mL教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂处理后的甘蔗叶片，24h和48h失水率分别下降了5％和6.9％，如图4所示。含有109cfu/mL教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂处理后的甘蔗叶片，24h和48h失水率分别下降了4.6％和6.5％。
从表1可以看出，接种含有108、109cfu/mL教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂的甘蔗植株，相比于对照CK，地上部和根部的鲜重、干重均显著增加，说明在盐胁迫下，接种含有教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂有利于植株生物量的积累。其中，接种含有108cfu/mL教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂的甘蔗植株，相比于对照CK，地上部和根部的鲜重分别增加了40.3％和35.8％，而地上部和根部干重分别增加了41.3％和40％，如图5和图6所示。接种含有109cfu/mL教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂的甘蔗植株，相比于对照CK，地上部和根部的鲜重分别增加了39.8％和34.9％，而地上部和根部干重分别增加了42.9％和40％
由以上结果可知，含有教酒色链霉菌YS36的微生物菌剂减缓了甘蔗盐害现象，从而促进甘蔗的生长，提高了甘蔗的耐盐性。综合不同浓度微生物菌剂的实验结果可以得出，微生物菌剂中教酒色链霉菌YS36的活菌数量不低于108cfu/mL时，该微生物菌剂可以显著减缓甘蔗盐害现象。
以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 玉林师范学院
<120> 一株教酒色链霉菌及其在提高甘蔗耐盐性中的应用
<130> 无
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1421
<212> DNA
<213> Streptomyces chartreusis
<400> 1
cgaatcactt cgacgctccc tcccacaagg ggttgggcca ccggcttcgg gtgttaccga 60
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ttaacccccg tccaggagga caggagtgtt atccggtatt agaccccgtt tccagggctt 1320
gtcccagagt gaagggcaga ttgcccacgt gttactcacc cgttcgccac taatccccac 1380
cgaagtggtt catcgttcga ctgcatggta gacgcggact c 1421

Claims (8)

1.一株教酒色链霉菌，其特征在于，其分类命名为Streptomyces chartreusis YS36，保藏编号为CCTCC NO: M 2022140。
2.含有权利要求1所述的教酒色链霉菌的微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中教酒色链霉菌的活菌数量不低于108cfu/mL。
4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中还添加有延长菌株活性时间的辅料，或其他微生物菌剂可接受的辅料。
5.权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1所述的教酒色链霉菌接种到LB液体培养基，在温度为35℃、转速180rpm条件下培养3天，获得发酵液；离心后用无菌水清洗，使用无菌水调节菌液浓度，即得微生物菌剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述微生物菌剂的菌液浓度为108～109cfu/mL。
7.权利要求1所述的教酒色链霉菌或权利要求2～4任一项所述的微生物菌剂在提高甘蔗对盐胁迫耐受性中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将教酒色链霉菌菌悬液接入到盐胁迫下的甘蔗幼苗根际土壤中，互作20～30天。
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