CN111517863A - 一种含甲基营养型芽孢杆菌的生物有机肥及其制备 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种含甲基营养型芽孢杆菌的生物有机肥，包含甲基营养型芽孢杆菌TA‑1；其有效活菌数不小于3×108 CFU/g。本发明提供的有机肥中，TA‑1在室内对番茄枯萎病有较高的拮抗活性，具有制备生物有机肥的潜力；通过单因素和响应面法获得了TA‑1液体发酵条件，在优化的条件下，不但能够提高菌体生长能力，还能够刺激产生更多的抗菌次生代谢产物；TA‑1发酵液制成的生物有机肥，在温室条件下能够改善土壤理化性质、增加番茄的生长量；还能有效防治番茄枯萎病并且调节土壤微生物菌群以长期改善土壤和防治病害。

Description

一种含甲基营养型芽孢杆菌的生物有机肥及其制备
技术领域
本发明属于微生物应用技术及生物防治领域，具体涉及一株甲基营养型芽孢杆菌生物有机肥及其制备。
背景技术
我国是世界上番茄种植面积最大、产量最多的国家。近年来土传病害危害日趋严重，已成为限制番茄可持续生产的瓶颈。其中，番茄枯萎病（Fusarium wilt of tomato，FOL）是由尖孢镰刀菌番茄专化型（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）引起的一种土传病害，严重影响番茄产量和品质。
目前，我国对番茄土传病害的防治仍以化学药剂为主，杀菌剂的频繁且不合理使用，不仅易造成病原菌抗药性的爆发，也对生态环境和人类健康产生了严重的威胁。根际拮抗细菌对土壤环境适应力强，开发利用有益微生物作为生物拮抗制剂为土传病害的生物防治提供了丰富的资源和方法。在诸多生防细菌中，迄今为止研究较多的一类仍然是芽孢杆菌（Bacillus spp.），因其具有极强的抗逆能力和抗菌活性，是根际促生菌（plant growthpromoting rhizobacteria，PGPR）的重要成员，对促进植物生长和防治植物病害发挥重要作用。而且芽孢杆菌繁殖速度快，人工培养容易，已经作为生防菌剂广泛应用于生产实践。已经研究报道过的芽孢杆菌用于生物防治领域的主要有贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）、蜡状芽孢杆菌（B. cereus）、巨大芽孢杆菌（B. megaterium）、解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）和枯草芽孢杆菌（B. subtilis）等。目前，登记用于防治番茄枯萎病的仅有一种解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂，但是其载体或其他辅料少，对芽孢的保护作用有限，活性易受储藏条件和储存时间影响大。由此开发的生物有机肥成为防治番茄枯萎病的新选择。
生物有机肥包含特定功能微生物，与有机物质结合能够起到防病促生的作用，对农药减量控害及化肥减量增效具有重要意义。随着研究的不断深入，芽孢杆菌在农业生产上的应用也越来越广泛。由于芽孢杆菌具有一定的生理活性，对于保存条件有一定的要求，在加工、储存和运输过程中容易失活。优化发酵条件可增加生防菌的添加数量，而生物有机肥中有机物料的添加可以增加芽孢杆菌的定殖成功率。芽孢杆菌取得良好防治促生效果取决于多种因素，在植物根际成功定殖并保持较高种群数量至关重要。有机物料的添加能够改善土壤理化性质、提升土壤肥力，还能为刚进入土壤新环境的芽孢杆菌提供适宜生存和繁殖的条件，促进芽孢杆菌的繁殖及其在根际的定殖，而且制成的生物有机肥便于施用，储存时则有利于生防菌的保存。为了方便储存和运输，使芽孢杆菌更好的发挥功效，有必要对芽孢杆菌进行发酵工艺研究。
发明内容
针对目前缺乏番茄枯萎病生物有机肥和芽孢杆菌菌剂不耐储等问题，本发明提供一种含甲基营养型芽孢杆菌的生物有机肥，不但能够减少土壤中铵态氮含量，增加硝态氮含量，还能够促进番茄根际土中细菌和芽孢杆菌数量的增加，减少真菌和尖孢镰刀菌的数量。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
一种含甲基营养型芽孢杆菌的生物有机肥，包含甲基营养型芽孢杆菌TA-1；所述甲基营养型芽孢杆菌TA-1（Bacillus methylotrophicus），保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No. M 2018362。
所述生物有机肥中，甲基营养型芽孢杆菌TA-1的有效活菌数不小于3×108 CFU/g。
所述生物有机肥中，有机质的含量为40-50%。
所述生物有机肥的施用对象为番茄；防治对象为番茄枯萎病。
所述生物有机肥中，还包括辅料。所述辅料包括但不限于载体、粘结剂、成型剂。
上述生物有机肥的制备方法，包括以下步骤：
（1）将甲基营养型芽孢杆菌TA-1接种于液体培养基中发酵获得含菌发酵液；
（2）将发酵液调节至所需浓度，然后吸附、造粒获得生物有机肥。
所述液体培养基含有碳源、氮源和无机盐；所述碳源选自葡萄糖、乳糖或蔗糖；所述氮源选自蛋白胨或牛肉膏；所述无机盐选自氯化钠、氯化钙或硫酸镁。优选的，所述液体培养基包含葡萄糖10-30 g/L，牛肉膏10-30 g/L，CaCl2 1-9 g/L。
所述发酵条件为发酵温度为30-42℃；发酵时间为48-72 h；转速为210-240 rpm。
所述接种条件为接种量为5-9%；装液量为容器容积的12-48%。
本发明具有以下优点：
本发明提供了一种含有甲基营养型芽孢杆菌TA-1的生物有机肥；其中TA-1在室内对番茄枯萎病有较高的拮抗活性，具有制备生物有机肥的潜力。本发明还通过单因素和响应面法优化获得了TA-1液体发酵条件，在优化的条件下，不但能够提高菌体生长能力，还能够刺激产生更多的抗菌次生代谢产物；提供的发酵条件为工业化生产奠定了基础。本发明制成的TA-1生物有机肥，在温室条件下能够改善土壤理化性质、增加番茄的生长量；还能有效防治番茄枯萎病并且调节土壤微生物菌群以长期改善土壤微生态和持续防治土传病害。
生物保藏信息
甲基营养型芽孢杆菌TA-1（Bacillus methylotrophicus），于2018年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为中国湖北省武汉市洪山区八一路武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC No. M 2018362。
附图说明
图1是TA-1菌体对番茄枯萎病菌的抑制效果，其中，A：接种TA-1后番茄枯萎病菌菌丝生长情况；B：对照组菌丝生长情况；
图2是TA-1无菌发酵液对番茄枯萎病菌的抑制效果，其中，右侧孔内为60 μL TA-1无菌发酵液，左侧孔内为60 μL无菌液体培养基；
图3是TA-1不同浓度抗菌提取物对番茄枯萎病菌的抑制效果，其中，抗菌提取物浓度分别为A：0 mg/L；B：20 mg/L；C：40 mg/L；D：80 mg/L；E：160 mg/L；
图4是TA-1生长曲线；
图5是不同发酵培养基成分对TA-1活菌数的影响；
图6是不同培养条件对TA-1活菌数的影响；
图7是TA-1生物有机肥等不同处理对番茄生物量的影响。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
实施例1 甲基营养型芽孢杆菌TA-1对番茄枯萎病的毒力
甲基营养型芽孢杆菌TA-1的首次公开于中国发明专利申请CN 108641989 A，公开日2018.10.12。
1. TA-1菌体对番茄枯萎病菌的拮抗活性
采用平板对峙法测定TA-1菌体对番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici）的抑菌活性。在无菌条件下，将番茄枯萎病菌进行活化，用直径5 mm的打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种于PDA平板（9 cm）中央，用牙签蘸取单个菌落的TA-1，并放置在距离病原菌菌饼2.5 cm处。以只接种病原菌的PDA平板作为对照，28℃恒温培养，当对照组病原菌菌丝长满培养皿时观察处理组菌丝生长状况。结果如图1所示：在接种TA-1的平板上，番茄枯萎病菌菌丝的生长受到明显的抑制；而在对照组中，菌丝生长旺盛，铺满整个平板；计算获得7天的抑菌圈为27.2 mm，抑制率为72.3%。
2. TA-1无菌发酵液及提取物对番茄枯萎病菌的拮抗活性
TA-1无菌发酵液的获得：挑取TA-1单菌落至LB液体培养基中，装液量为100 mL/250mL，30℃，180 rpm培养12 h得到种子液。以5%的接种量将种子液接种至LB液体培养基中，装液量为100 mL/250 mL，30℃，180 rpm培养48 h，获得TA-1发酵液。将TA-1发酵液于10000rpm离心10 min后取上清过0.22 μm无菌滤膜得到TA-1无菌发酵液备用。
利用琼脂扩散法测定TA-1无菌发酵液对番茄枯萎病菌的抑菌活性：将灭菌的外径为8 mm的牛津杯放置在距离平板中央两侧2.5 cm处，将灭菌PDA培养基倒板，凝固后，用镊子将牛津杯夹出，形成直径8 mm的孔洞，一个孔内加入60 μL TA-1无菌发酵液，另一个孔内加入60 μL无菌LB液体培养基作为对照。用直径5 mm的打孔器打取番茄枯萎病菌菌饼，接种于PDA平板中央。28℃恒温培养3 d，观察菌丝生长变化。结果如图2所示：番茄枯萎病菌培养3 d后，TA-1无菌发酵液能够抑制番茄枯萎病菌菌丝的生长，而LB液体培养基对菌丝生长无影响。
采用菌丝生长速率法测定抗菌粗提物对番茄枯萎病菌的抑菌活性：将TA-1无菌发酵液置于无菌三角瓶中，用浓度为7 mol/L的HCl调其pH至2.0，4℃沉淀过夜12 h；摇匀后于10000 rpm离心10 min，取沉淀，用0.5 mL甲醇溶液对沉淀进行抽提8 h，重复操作3次，将所得抽提物合并，并将其减压浓缩后过0.22 μm滤膜，冷冻干燥后得到抗菌粗提物。然后用无菌水配置成粗提物母液，并将该母液加入融化的PDA培养基中制成粗提物浓度为160、80、40、20、10、5 mg/L的含药平板，以加等量无菌水的PDA平板为对照。在平板中央接种直径为5mm的番茄枯萎病菌块，每处理重复3次，28℃恒温培养，当对照组病原菌菌丝长满培养皿时，采用十字交叉法测量各处理菌落直径，计算抑制率。相对抑制率（%）=[（对照菌落直径-脂肽粗提物处理菌落直径）/对照菌落直径]×100%。根据浓度对数（x）与菌落生长相对抑制率的概率值（y），利用SPSS软件求取抗菌粗提物对番茄枯萎病菌丝生长的毒力回归方程y=a+bx和相关系数（r），并计算抑制菌落生长的有效中浓度EC50。如图3所示，不同浓度TA-1抗菌粗提物均能抑制番茄枯萎病菌菌丝的生长。在处理5 d后，160、80、40和20 mg/L脂肽粗提物对菌丝的抑制率分别为61.31、39.90、31.87和21.65%，EC50为106.14 mg/L。这说明，本发明中的TA-1菌株对番茄枯萎病菌有较好的抑制活性，具有进一步开发的潜力。
实施例2 甲基营养型芽孢杆菌TA-1发酵条件的筛选
2.1 TA-1生长曲线测定及接种种龄的测定
挑取TA-1单菌落至LB液体培养基中，装液量为100 mL/250 mL，30℃，180 rpm培养，每隔2 h取不同时段的发酵液。以未接菌的LB液体培养基作为对照，用分光光度计测定发酵液的OD600。以培养时间为横坐标，发酵液OD值为纵坐标作图，绘制TA-1的生长曲线，确定TA-1发酵接种种龄。
菌株TA-1的生长曲线如图4所示。培养0-6 h，OD值上升平缓，且处于较低水平，表明菌株处于生长延迟期，菌株繁殖速度较慢；6 h-12 h，OD值急剧上升，表明菌株处于对数生长期，菌株繁殖迅速；12 h-24 h OD值变化不大，表明菌株生长进入稳定期。结果表明培养进行到12 h时，菌株处于对数生长期末，此时的菌株种龄为最适发酵接种种龄。
2.2 单因素变量测定TA-1液体发酵条件
种子液获得：挑取TA-1单菌落接入100 mL新鲜灭菌的LB液体培养基中，37 ℃，150 rpm振荡培养48 h，获得TA-1发酵液，用无菌水调节发酵液中菌体浓度为109 CFU/mL；
基础发酵培养基成分（g/L）：葡萄糖10.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0；
基础培养条件：5%接种量将种子液接种至培养基中，装液量为40%容器容积量（250mL）、30℃、180 rpm培养48 h。
（1）在基础培养基和基础培养条件的基础上，分别确定最佳碳源、氮源和无机盐：分别用葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖和蔗糖替代基础发酵培养基中的碳源；分别用酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、尿素和硫酸铵替代基础发酵培养基中的氮源；分别用氯化钠、氯化钙、硫酸铜、硫酸锌和硫酸镁替代基础发酵培养基中的无机盐；以上培养基优化每个处理3次重复，以活菌数为指标进行筛选。
结果如图5（A-C）所示：碳源中，葡萄糖效果最好，活菌数为2.49×108 CFU/mL，且与其他处理差异显著；以葡萄糖为培养基的碳源，不同氮源中，牛肉膏效果最好，活菌数为3.81×108 CFU/mL，且与其他处理差异显著；以葡萄糖为培养基的碳源，以牛肉膏为培养基的氮源，不同无机盐中，氯化钙效果最好，活菌数为5.90×108 CFU/mL，且与其他处理差异显著。因此，确定最优发酵培养基成分为葡萄糖、牛肉膏、氯化钙。
（2）以（1）中确定的最佳组分制备培养基，在基础培养条件上分别确定最佳碳源、氮源、无机盐浓度：分别按10、20、30、40、50 g/L调整碳源浓度；分别按10、20、30、40、50 g/L调整氮源浓度；分别按1、3、5、7、9 g/L调整无机盐浓度；以上条件优化每个处理3次重复，以活菌数为指标进行筛选。
结果如图5（D-F）所示：如图5-D所示当碳源浓度增加时，活菌数先增加后减少，当碳源浓度为30 g/L时，活菌数最高，为7.63×108 CFU/mL；图5-E显示选择不同氮源浓度培养菌株TA-1其活菌数呈现差异，当氮源浓度为20 g/L时，活菌数最大，为6.33×108 CFU/mL；由图5-F可知，随着无机盐浓度增加，活菌数先增加后减小，当无机盐浓度为5 g/L时，活菌数最大，达到8.07×108 CFU/mL；
（3）以（2）中确定的最佳组分和含量制备培养基，在基础培养条件上分别确定溶氧量、发酵温度、发酵时间、装液量和接种量：分别调整摇床转速为120、150、180、210、240 rpm；发酵温度分别调整为20、25、30、37、42℃；发酵时间分别设定为24、36、48、60、72 h，；装液量分别设定为容器容积的12%、24%、36%、48%、60%；分别以1、3、5、7、9%的接种量将种子液接种至培养基中；以上条件优化每个处理3次重复，以活菌数为指标进行筛选。
结果如图6所示：如图6-A所示，随着转速的增加，活菌数先增加后减少，转速为210rpm时活菌数达到最大值，为7.67×108 CFU/mL；如图6-B所示，随着温度的升高，活菌数先增加后减少，当培养温度为30℃时，活菌数达到最大值为5.50×108 CFU/mL；如图6-C所示，当发酵时间为48 h时，活菌数达到最大值，为6.50×108 CFU/mL；如图6-D所示，随着装液量的增加，活菌数先增加后减少，当装液量为36%时，活菌数最大，为6.37×108 CFU/mL；如图6-E所示，随着接种量增加，活菌数先增加后减少，接种量为5%时，活菌数最大，为6.87×108CFU/mL。
2.3 响应面法确定TA-1液体发酵最佳条件
根据单因素的优化结果，通过Design Export 8.0软件进行Plackett-Burman设计（N=12）。试验设计碳源浓度（A）、氮源浓度（B）、无机盐浓度（C）、转速（D）、温度（E）、发酵时间（F）、装液量（G）、接种量（H）、虚拟项（I）、虚拟项（J）、虚拟项（K）等11个因素，全部因素均取高（+1）、低（-1）两个水平，每组处理重复3次。试验结果利用Design Export 8.0软件分析，确定影响TA-1活菌数的主要影响因素。根据Plackett-Burman试验得出的一次拟合方程，确定主要影响因素；再根据拟合方程中各变量的系数确定主要因素的爬坡方向和变化步长。在主要影响因素中，正效应因子设置各水平值时在原始基础上依次增加，负效应因子条件值在原始基础上依次降低，其他非主要影响因素根据效应因子的正负，选择相应的高或低值保持不变，以此设置最陡爬坡试验。根据最陡爬坡试验结果，确定主要影响因子的响应中心点。以TA-1发酵液中活菌数为响应值，采用Box-Behnken设计法进行因素优化试验，建立最佳发酵条件，并验证响应面法获得预测值。
表1 Plackett-Burman试验设计因素、水平和方差分析
Figure DEST_PATH_IMAGE001
表2 Plackett-Burman试验设计与响应值表
Figure 126217DEST_PATH_IMAGE002
通过Box-Behnken设计法分析，TA-1液体发酵活菌数预测值最大时液体发酵条件为：葡萄糖30 g/L，牛肉膏20 g/L，CaCl2 5 g/L，转速211.55 rpm，温度30.54℃，发酵时间48 h，装液量36%，接种量5.03%，预测TA-1液体发酵活菌数为9.13×108 CFU/mL。在最优培养条件下，进行发酵获得TA-1发酵液，平板菌落计数法测得活菌数为9.80×108 CFU/mL，未优化前，采用基础培养基和基础培养条件，TA-1发酵液活菌数为2.49×108 CFU/mL。
以实施例1中的方法获得抗菌粗提物，采用同批接种液，优化前后抗菌粗提物的产量分别为709.89 mg/L和3162.75 mg/L，优化前后的产量提高近4.5倍。这说明，TA-1菌种有良好的生长势，适于深层发酵，通过发酵液成分和发酵条件的优化，使得TA-1的生物量和抗菌物质的产量都得到了较大的提高，具有作为工业化菌种的潜力。
实施例3 含甲基营养型芽孢杆菌TA-1生物有机肥的制备
TA-1生物有机肥：将TA-1按照实施例2中最优化培养基和最优化培养条件获得含TA-1菌体的发酵液，调节成活菌量不低于3×108 CFU/mL的发酵液1 L；加入700 g腐植酸吸附发酵液，然后加入300 g黄黏土混合均匀后造粒，50℃烘干，重复制备5批次，平板菌落计数法测定活菌数：各批次生物有机肥中，TA-1活菌数均在3×108 CFU/g以上。
按照相同的配方和比例，以无菌水代替发酵液，制备对照有机肥的颗粒。
实施例4 含TA-1生物有机肥的对番茄生物量的影响及对番茄枯萎病的防效
试验在山东农业大学温室内进行，共设置4个处理：1）对照（CK）；2）对照有机肥处理（OF），每盆穴施12 g对照有机肥；3）TA-1生物有机肥处理（BOF），每盆穴施12 g TA-1生物有机肥；4）解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂处理（总有效成分含量1.2亿芽孢/克，购自江苏省苏科农化有限责任公司，B1619），每盆穴施12 g解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂。选取长势一致的5叶期番茄幼苗，采用浸根法接种番茄枯萎病菌，用无菌水冲去根部土粒，然后用无菌剪子将主根根基部0.2 cm处切断，在已配好的番茄枯萎病菌孢子悬浮液（106 CFU/mL）中浸泡20 min后，转移到花盆中定植，每个花盆装土量为1.2 kg，置于25-30℃的温室中培养，每个处理10株，试验重复3次。番茄移栽第28 d，测量番茄植株株高、茎粗、地上部鲜重和地上部干重。株高：测定植株基部到主茎生长点的自然高度。茎粗：测定距离培养土表面3cm处的横茎。地上部鲜重：将根与茎分离，称量茎与叶片的重量。地上部干重：将称完鲜重后的茎与叶于105℃下杀青15 min后，70℃下烘干至恒重，称重。调查番茄枯萎病病情，根据病级标准，记录发病情况，计算病情指数和防治效果。
番茄苗期枯萎病病情分级标准：0级：无症状；1级：1片或2片子叶明显变黄，以致脱落；2级：1片或2片真叶变黄，叶片萎焉下垂；3级：3片或4片真叶变黄或真叶萎焉下垂；4级：全株严重萎焉，以致枯死；
病情指数=（病级值×该级病叶数）/（调查总叶片数×最高级病级值）×100%；
防治效果=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%。
TA-1生物有机肥对番茄生物量的影响如图7所示：TA-1生物有机肥处理的株高、茎粗、地上部鲜重和地上部干重均高于其他处理，其中株高较其他处理显著增加，茎粗较腐殖酸载体处理显著增加，地上部鲜重和地上部干重较对照处理和腐植酸处理显著增加。
TA-1生物有机肥等不同处理对番茄枯萎病菌防效如表3所示：与对照处理相比，腐植酸处理、TA-1生物有机肥处理和解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂处理均降低了番茄枯萎病的病情指数，其中TA-1生物有机肥处理和解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂处理分别降低了30%和26.67%，表现出良好的防治效果，防效分别为66.67%和59.26%，而腐植物酸载体处理较对照处理病情指数降低不显著。
表3 TA-1生物有机肥等不同处理对番茄枯萎病菌防效
Figure DEST_PATH_IMAGE003
实施例5 含TA-1生物有机肥的对土壤理化性质影响
试验在山东农业大学温室内进行，共设置4个处理：1）对照（CK）；2）对照有机肥处理（OF），每盆穴施12 g对照有机肥；3）TA-1生物有机肥处理（BOF），每盆穴施12 g TA-1生物有机肥；4）解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂处理（总有效成分含量1.2亿芽孢/克，购自江苏省苏科农化有限责任公司，B1619），每盆穴施12 g解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂。选取长势一致的5叶期番茄幼苗，采用浸根法接种番茄枯萎病菌，用无菌水冲去根部土粒，然后用无菌剪子将主根根基部0.2 cm处切断，在已配好的番茄枯萎病菌孢子悬浮液（106 CFU/mL）中浸泡20 min后，转移到花盆中定植，每个花盆装土量为1.2 kg，置于25-30℃的温室中培养，每个处理10株，试验重复3次。番茄移栽第28 d，每个处理随机选择3株番茄连根拔起，混匀组合作为1份土壤样品，每个处理获得3份土壤样品。轻轻抖动根部，抖下来的土壤为土体土壤，粘在根部的土壤为根际土。土体土壤用于用于土壤理化性质和土壤酶活性的测定；根际土用于可培养微生物数量的测定。
土壤理化性质测定均参照《土壤农化分析》（鲍士旦，2010）。土壤铵态氮和硝态氮利用CaCl2溶液浸提新鲜土壤悬液，釆用连续流动分析仪测定；土壤速效磷采用NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定；土壤速效钾采用NH4OAC浸提火焰光度法测定。
表4 TA-1生物有机肥对土壤理化性质的影响
Figure 354942DEST_PATH_IMAGE004
如表4所示，TA-1生物有机肥等不同处理对土壤铵态氮、硝态氮、速效磷和速效钾存在显著影响。TA-1生物有机肥处理显著降低了土壤铵态氮含量，较对照处理和对照有机肥处理显著增加了硝态氮的含量，解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂处理硝态氮含量最高；对照有机肥处理、TA-1生物有机肥处理和解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂处理之间速效磷含量没有显著差异；对照处理和对照有机肥处理中速效钾显著高于TA-1生物有机肥处理和解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂处理。
土壤可培养微生物数量的测定采用平板菌落计数法，取10 g根际土加到盛有90mL无菌水的锥形瓶中，封口并将其放在摇床振荡10 min，待土壤充分散开混匀后，静止20-30 s，即为10倍稀释液，用移液枪吸取1 mL稀释液至盛有9 mL无菌水的试管中，振荡摇匀，即为100倍稀释液，依次类推，每次更换枪头连续稀释，制成土壤稀释液。吸取合适的浓度梯度土壤稀释液100 μL涂布于相应平板。细菌采用NA培养基；真菌采用马丁氏培养基；放线菌采用改良高氏1号培养基；芽孢杆菌采用LB培养基，涂布前将稀释液于80℃水浴15 min；尖孢镰刀菌采用采用Komada培养基。适宜温度培养，待菌株生长后统计菌落数量，每个处理3次重复。
表5 TA-1生物有机肥等不同处理对土壤中微生物量的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE005
由表5可知，TA-1生物有机肥处理较对照处理、对照有机肥处理和解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂处理显著增加了番茄根际土中细菌数量，对照、对照有机肥和解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂处理之间无显著差异。TA-1生物有机肥处理真菌数量最少，较对照处理显著降低，与对照有机肥处理和解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂处理无显著差异。解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂处理番茄根际土中放线菌数量显著减少。芽孢杆菌数量由大到小依次为TA-1生物有机肥、解淀粉芽孢杆菌B1619水分散粒剂、对照有机肥和对照处理，差异显著；尖孢镰刀菌数量趋势与芽孢杆菌数量趋势相反。这说明与商品化的防治番茄枯萎病的生防菌相比，含TA-1的有机肥，在防治病害方面有更好的效果；而且能够更好的在土壤中定殖和繁殖；对土壤中的有益微生物，如放线菌，没有不利影响；同时，施用TA-1生物有机肥能显著增加土壤中硝态氮的含量，降低铵态氮的含量，减少铵态氮毒害作用，增加植物可利用的硝态氮含量。

Claims (8)

1.一种含甲基营养型芽孢杆菌的生物有机肥，其特征在于，包含甲基营养型芽孢杆菌TA-1（Bacillus methylotrophicus）；所述甲基营养型芽孢杆菌TA-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No. M 2018362。
2. 根据权利要求1所述的生物有机肥，其特征在于，所述甲基营养型芽孢杆菌TA-1的有效活菌数不小于3×108 CFU/g。
3.根据权利要求1所述的生物有机肥，其特征在于，所述生物有机肥的施用对象为番茄；防治对象为番茄枯萎病。
4.一种如权利要求1所述的生物有机肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将甲基营养型芽孢杆菌TA-1接种于液体培养基中发酵获得含菌发酵液；
（2）将发酵液调节至所需浓度，然后吸附、造粒获得生物有机肥。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述液体培养基含有碳源、氮源和无机盐；所述碳源选自葡萄糖、乳糖或蔗糖；所述氮源选自蛋白胨或牛肉膏；所述无机盐选自氯化钠、氯化钙或硫酸镁。
6. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述液体培养基包含葡萄糖10-30g/L，牛肉膏10-30 g/L，CaCl2 1-9 g/L。
7. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述发酵条件为发酵温度为30-42℃；发酵时间为48-72 h；转速为210-240 rpm。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述接种条件为接种量为5-9%；装液量为容器容积的12-48%。
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