CN113142214A

CN113142214A - 甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白的应用及分离纯化方法

Info

Publication number: CN113142214A
Application number: CN202110562809.3A
Authority: CN
Inventors: 姜威; 张淑梅; 孔祥辉; 张欣; 胡基华; 于冲; 闫更轩; 曲小军
Original assignee: Institute of Microbiology of Heilongjiang Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Microbiology of Heilongjiang Academy of Sciences
Priority date: 2021-05-24
Filing date: 2021-05-24
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2041-05-24
Also published as: CN113142214B

Abstract

本发明涉及甲基营养型芽孢杆菌wswGH‑10的抗菌蛋白的应用及分离纯化方法，属于抗菌药物技术领域。本发明提供了甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)wswGH‑10的抗菌蛋白在制备抑菌的药物中的应用，所述抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述抗菌蛋白在100℃以下环境下、中性和酸性环境中、紫外线照射环境下以及光照环境下均具有很好的抑菌活性，特别能抑制尖孢镰刀菌和/或立枯丝核菌的活性，能高效用于抑菌的药物的生产，有利于新型生物农药的开发。

Description

甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白的应用及分离纯化方法

技术领域

本发明涉及抗菌药物技术领域，具体涉及甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白的应用及分离纯化方法。

背景技术

高浓度的化学杀菌剂增加了农药残留的风险，不仅易对环境造成污染，而且会严重影响人们的健康，同时会诱导病菌产生抗药性而降低杀菌效果。目前生物防治正在逐步取代传统的化学防治。现有生物农药主要是活菌体制剂，而它们大多是以杀死或抑制病原菌为靶标，而忽视了调动植物自身免疫能力的筛选指标。在使用时常常有见效慢、防效不稳定现象，在储藏过程中有货架期短等不利现象。现在人们越来越多的把注意力投入到一类新型物质上，这就是抗菌蛋白或抗菌肽。抗菌蛋白或抗菌肽是许多生防微生物都能分泌的一类抗生物质，它具有抑制病菌的广谱性和高效性、对人畜无毒、对环境无污染的优良特性，并且它能通过诱导植物免疫，提高植物抗性的途径起到减轻病害发生，降低农药使用量，促进植物生长和提高产量的作用。同时能提高作物的品质，生产上可以减少或不使用化学农药，生产的产品可以达到绿色产品和有机食品的要求，特别是在有机蔬菜和果品生产中将发挥重要作用。而且避免了环境对活菌体作用而影响其防效的现象。因此，抗菌蛋白在开发新型生物农药中比活菌体制剂更具优势。

发明内容

本发明的目的在于提供甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白的应用及分离纯化方法。本发明所述抗菌蛋白在100℃以下环境下、中性和酸性环境中、紫外线照射环境下以及光照环境下均具有很好的抑菌活性，特别能抑制尖孢镰刀菌和/或立枯丝核菌的活性，能高效用于抑菌的药物的生产，有利于新型生物农药的开发。

本发明提供了甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)wswGH-10的抗菌蛋白在制备抑菌的药物中的应用，所述抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白在制备在100℃以下环境下能够抑菌的药物中的应用，所述抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白在制备在中性和酸性环境中能够抑菌的药物中的应用，所述抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白在制备在紫外线照射环境下能够抑菌的药物中的应用，所述抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白在制备在光照环境下能够抑菌的药物中的应用，所述抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的是，所述抑菌包括抑制尖孢镰刀菌和/或立枯丝核菌的活性。

本发明还提供了上述技术方案所述应用中的甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的培养方法，包括以下步骤：

将甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10接种于LB培养基中，30℃培养48h，得到甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的培养液。

本发明还提供了上述技术方案所述应用中的甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白的分离纯化方法，包括以下步骤：

将甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的培养液离心，得到上清液；

将所述上清液在50％的硫酸铵饱和度下进行静置，得到沉淀；

将所述沉淀进行透析除盐，得到粗蛋白；

将所述粗蛋白依次进行凝胶过滤层析，得到抗菌蛋白。

优选的是，所述凝胶过滤层析包括：将粗蛋白在100℃加热20min，离心，取上清液，上样于SephedexS-75分子筛层析柱，洗脱，收集有抑菌活性的蛋白峰。

优选的是，所述洗脱采用20～50mM pH值为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液进行，所述洗脱的流速为0.5～1.0mL/min。

本发明提供了甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白的应用。本发明所述抗菌蛋白从甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10菌株中分离纯化得到，为单一抗菌蛋白组分，抑菌活性明显，稳定性强，可以作为潜在的生防资源进行开发与应用。本发明所述抗菌蛋白在100℃以下环境下、中性和酸性环境中、紫外线照射环境下以及光照环境下均具有很好的抑菌活性，特别能抑制尖孢镰刀菌和/或立枯丝核菌的活性，能高效用于抑菌的药物的生产。

生物保藏说明

甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)wswGH-10，于2015年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，单位简称为CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.11541。

附图说明

图1为本发明提供的不同培养基中甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10抗菌蛋白粗提液抑菌活性的培养结果图；

图2为本发明提供的不同培养时间下甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10抗菌蛋白粗提液抑菌活性的培养结果图；

图3为本发明提供的不同培养温度下甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10抗菌蛋白粗提液抑菌活性的培养结果图；

图4为本发明提供的(NH)₄SO₄各饱和浓度下蛋白沉淀的抑制尖孢镰刀菌活性结果图；

图5为本发明提供的不同饱和浓度下的沉淀蛋白SDS-PAGE电泳结果图；

图6为本发明提供的(NH)₄SO₄各饱和浓度下蛋白沉淀的抑制立枯丝核菌活性结果图；

图7为本发明提供的抗菌蛋白经SephedexS-75分子筛层析纯化结果图；

图8为本发明提供的各吸收峰的抑菌效果图；

图9为本发明提供的抗菌蛋白的SDS-PAGE电泳图谱；

图10为本发明提供的温度对抗菌蛋白活性的影响结果图；

图11为本发明提供的pH对抗菌蛋白活性的影响结果图；

图12为本发明提供的紫外对抗菌蛋白活性的影响结果图；

图13为本发明提供的光照对抗菌蛋白活性的影响结果图。

具体实施方式

本发明提供了甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)wswGH-10的抗菌蛋白在制备抑菌的药物中的应用，所述抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：MRINHNIAALNTLNRLSSNNGASQKNMEKLSSGLRINRAGDDAAGLAISEKMRGQIRGLEMASKNSQDGISLIQTAEGALTETHAILQRVRELVVQAGNTGTQDKATDLQSIQDEISALTDEIDGISNRTEFNGKKLLDGTYKVDAATPANQKNLIFQIGANATQQISVNIEDMGADALGIKEADGSIAALHSVNDLDVTKFADNKADATDIGFDNQLKIVDEAINQVSSQRAKLGAVQNRLEHTINNLSASGENLTAAESRIRDVDMAKEMSEFTKNNILSQASQAMLAQANQQPQNVLQLLR。在本发明中，所述药物包括农药。在本发明中，所述抑菌优选包括抑制尖孢镰刀菌和/或立枯丝核菌的活性。本发明所述甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)wswGH-10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11541，保藏日期为2015年10月21日，保藏地址为北京市朝阳区北辰路1号院3号，公开于授权公告号为CN 105670958 B的专利中，在本发明实施例中，所述甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)wswGH-10也称为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)HG18，也可以科学命名为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis)HG18。本发明所述抗菌蛋白从甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10菌株中分离纯化得到，为单一抗菌蛋白组分，序列如SEQID NO.1所示，功能没有被报道过，本发明提供了所述抗菌蛋白的应用，所述抗菌蛋白抑菌活性明显，稳定性强，可以作为潜在的生防资源进行开发与应用。本发明所述抗菌蛋白在100℃以下环境下、中性和酸性环境中、紫外线照射环境下以及光照环境下均具有很好的抑菌活性，特别能抑制尖孢镰刀菌和/或立枯丝核菌的活性。

本发明还提供了甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白在制备在100℃以下环境下能够抑菌的药物中的应用，所述抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明中，所述100℃以下环境优选为40～100℃的环境。在此温度范围，本发明所述抗菌蛋白抗菌活性高。在本发明中，所述抑菌优选包括抑制尖孢镰刀菌和/或立枯丝核菌的活性。

本发明还提供了甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白在制备在中性和酸性环境中能够抑菌的药物中的应用，所述抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。在本发明中，所述中性和酸性环境优选为pH 3.0～10.0的环境，在此环境中，本发明所述抗菌蛋白抗菌活性高。在本发明中，所述抑菌优选包括抑制尖孢镰刀菌和/或立枯丝核菌的活性。

本发明还提供了甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白在制备在紫外线照射环境下能够抑菌的药物中的应用，所述抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述抗菌蛋白对紫外线照射不敏感，具有较强的抗紫外线照射能力。在本发明中，所述抑菌优选包括抑制尖孢镰刀菌和/或立枯丝核菌的活性。

本发明还提供了甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白在制备在光照环境下能够抑菌的药物中的应用，所述抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述抗菌蛋白对光照射不敏感，具有较强的抗光照能力。在本发明中，所述抑菌优选包括抑制尖孢镰刀菌和/或立枯丝核菌的活性。

将甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10接种于LB培养基中，30℃培养48h，得到甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的培养液。在此培养条件下，培养液中甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10产抗菌蛋白的抑菌活性最强。在本发明中，接种的量优选为2％。在本发明中，所述培养的转速优选为160r/min。

将甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的培养液离心，得到上清液；

将所述沉淀进行透析除盐，得到粗蛋白；

将所述粗蛋白依次进行凝胶过滤层析，得到抗菌蛋白。

本发明将甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的培养液离心，得到上清液。本发明所述甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的培养液的制备方法优选包括：将在LB固体培养基中活化好的甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10菌株接于LB液体培养基中，在30℃，160r/min，接种量2％体积的培养条件下振荡培养48h，即得。本发明所述离心的条件优选为在4℃、12000r/min条件下离心20min。

得到上清液后，本发明将所述上清液在50％的硫酸铵饱和度下进行静置，得到沉淀。在本发明中，所述静置的条件优选为4℃静置24h，静置后，优选进行离心，所述离心的条件优选为4℃、8000～10000r/min条件下离心10～20min，弃去上清液。

得到沉淀后，本发明将所述沉淀进行透析除盐，得到粗蛋白。本发明所述沉淀优选用0.02mM、pH值为8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解。在本发明中，所述透析除盐优选包括：使用0.01mM，pH值为7.0的磷酸盐缓冲液透析除盐24h，每隔4h换液一次。透析后，本发明优选进行冷冻干燥，得到粗蛋白固体，所述粗蛋白固体后续优选使用0.01mM磷酸盐缓冲液溶解。

得到粗蛋白后，本发明将所述粗蛋白依次进行凝胶过滤层析，得到抗菌蛋白。在本发明中，所述凝胶过滤层析优选包括：将粗蛋白在100℃加热20min，经高温处理过的粗蛋白可以去除杂蛋白的影响，离心，取上清液，上样于SephedexS-75分子筛层析柱，洗脱，收集有抑菌活性的蛋白峰。在本发明中，所述离心的条件优选为12000r/min离心5min。在本发明中，所述洗脱优选采用20～50mM pH值为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液进行，所述洗脱的流速为0.5～1.0mL/min。本发明优选在紫外光波长为280nm下检测吸光度值，离心管收集各洗脱峰组分，将收集到的峰组分透析浓缩冻干后进行抑菌活性检测。本发明抑菌活性的检测优选使用牛津杯法。

下面结合具体实施例对本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白的应用及分离纯化方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的培养

挑取HG18菌单菌落接于LB、NYD、淀粉液体培养基中活化，活化后菌液OD₆₀₀＝0.800，然后以2％的接种量转接到各自培养基配方的液体三角瓶中，160r/min、30℃培养48h，8000r/min离心10min，取上清液1.5mL，浓缩至40μL，除菌，与病原菌(尖孢镰刀菌)对峙培养。

不同培养基中甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的培养结果如图1所示，在LB培养基中培养的HG18菌产抗菌蛋白(抗菌蛋白粗提液)的抑菌活性最高，最优培养基为LB培养基。

挑取HG18菌单菌落接于LB液体培养基中活化，活化后菌液OD₆₀₀＝0.800，然后以2％的接种量转接到含LB液体培养基的三角瓶中，160r/min、30℃分别培养24h、48h和60h，8000r/min离心10min，取上清液1.5mL，浓缩至40μL，除菌，与病原菌(尖孢镰刀菌)对峙培养。

不同培养时间下甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10产抗菌蛋白(抗菌蛋白粗提液)抑菌活性的培养结果如图2所示(对照添加的是LB液体培养基)，培养48h的上清液对病原菌的抑菌效果最好，说明最佳培养时间为48h。

挑取HG18菌单菌落接于LB液体培养基中活化，活化后菌液OD₆₀₀＝0.800，然后以2％的接种量转接到含LB液体培养基的液体三角瓶中，160r/min、分别在10℃、20℃和30℃下培养48h，8000r/min离心10min，取上清液1.5mL，浓缩至40μL，除菌，与病原菌(尖孢镰刀菌)对峙培养。

不同培养温度下甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10产抗菌蛋白(抗菌蛋白粗提液)抑菌活性的培养结果如图3所示(对照添加的是LB液体培养基)，30℃培养的上清液对病原菌的抑菌效果最好，说明最佳培养温度为30℃。

实施例2

1材料与方法

1.1材料

供试菌株：甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)wswGH-10；尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)(常规市售)；立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)(常规市售)。

供试培养基：PDA培养基，LB液体培养基。

1.2生防甲基营养型芽孢杆菌Hg18抗菌蛋白的分离纯化

1.2.1抗菌粗蛋白的制备

将在LB固体培养基中活化好的HG18菌株接于LB液体培养基中，在30℃，160r/min，接种量2％体积的培养条件下振荡培养48h。将上述培养液至于低温高速离心机中，在4℃、12000r/min条件下离心20min，去除菌体沉淀，上清液保存备用。将上清液加(NH)₄SO₄至饱和度分别为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％。将混合液放置冰箱，4℃静置24h，将上清液的蛋白沉淀析出。再将不同饱和度下的混合溶液在4℃、10000r/min条件下离心20min，弃去上清液，分别用0.02mM(pH＝8.0)的PBS溶液将沉淀充分溶解，并用0.01mM的磷酸盐缓冲液(pH＝7.0)透析除盐24h，每隔4h换一次缓冲液。最后将不同饱和度的蛋白沉淀冷冻干燥，用0.01mM磷酸盐缓冲液溶解后确定各浓度下的抑菌活性(使用牛津杯法分别测定各浓度下对尖孢镰刀菌和立枯丝核菌的抑菌活性)，确定硫酸铵的最佳饱和度。

Hg18菌株无菌体发酵液中粗蛋白的提取与抑菌活性检测结果(用牛津杯法检测抑菌活性)：70％(NH)₄SO₄饱和浓度下没有蛋白沉淀；无菌发酵液抑制尖孢镰刀菌活性试验表明，经20％、40％、50％、60％、80％(NH)₄SO₄饱和浓度下的沉淀蛋白对病原真菌尖孢镰刀菌都有很强的抑菌作用(图4，(NH)₄SO₄各饱和浓度下蛋白沉淀的抑制尖孢镰刀菌活性)，其中30％(NH)₄SO₄饱和浓度没有抑菌活性，将具有抑菌活性的20％、40％、50％、60％、80％(NH)₄SO₄饱和浓度下的沉淀蛋白进行SDS-PAGE电泳，结果如图5所示；无菌发酵液抑制立枯丝核菌活性试验表明，经20％、30％，40％、50％、60％、80％(NH)₄SO₄饱和浓度下的沉淀蛋白对病原真菌立枯丝核菌都有很强的抑菌作用(图6，(NH)₄SO₄各饱和浓度下蛋白沉淀的抑制立枯丝核菌活性结果)，可见，(NH)₄SO₄饱和浓度为30％时提取得到的蛋白对尖孢镰刀菌没有抑菌活性，对立枯丝核菌抑菌活性。50％饱和浓度下对尖孢镰刀菌和立枯丝核菌的抑菌率均最高。

以下述公式进行抑菌率的计算，计算50％饱和浓度系下，沉淀蛋白对尖孢镰刀菌和立枯丝核菌的抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照菌丝直径－处理菌丝直径)/对照菌丝直径×100％；

其中，对照菌丝直径指的是加LB液体培养基，处理菌丝直径指的是50％饱和浓度系下的沉淀蛋白加入后菌丝的直径。

表1 50％饱和浓度系下，沉淀蛋白对尖孢镰刀菌的抑菌率

表2 50％饱和浓度系下，沉淀蛋白对立枯丝核菌的抑菌率

1.2.2抗菌蛋白的分离纯化

1.2.2.1抗菌蛋白的凝胶过滤层析

以最适饱和度50％的(NH)₄SO₄沉淀后的蛋白粗提液在100℃水浴中加热20min，在高速离心机上以12000r/min离心5min后保留上清液进行活性检测，然后将热处理后的上清液上样于SephedexS-75分子筛层析柱。用50mM的PBS(pH＝7.0～7.4)缓冲溶液洗脱，流速为0.5～1.0mL/min。蛋白分离纯化检测系统在紫外光波长为280nm下检测吸光度值，离心管收集各洗脱峰组分，将收集到的峰组分透析浓缩后冻干后进行抑菌活性检测，检测有抑菌活性的蛋白峰用于SDS-PAGE电泳检测。

1.2.2.2抗菌蛋白的变性聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)

将1.2.2.1中纯化得到的活性峰组分用超滤管过滤浓缩后进行SDS-PAGE电泳检测。用12％的分离胶和5％的浓缩胶，采用考马斯亮蓝G250染色1h后用脱色液在摇床上轻摇脱色，直至条带清晰，背景干净为止。

Hg18菌株抗菌蛋白的分离纯化及活性峰的SDS-PAGE检测结果：

Hg18菌株发酵液经50％饱和硫酸铵沉淀透析除盐后的粗蛋白经过SephedexS-75分子筛层析，共得到2个主要峰(图7，抗菌蛋白经SephedexS-75分子筛层析纯化结果)。把两个吸收峰的洗脱液冻干浓缩后做抑菌活性试验，结果表峰1有抑菌活性，峰2没有抑菌活性(图8，各吸收峰的抑菌效果图)，经测量，峰1的洗脱液浓缩后的蛋白浓度为0.679mg/mL，峰2的洗脱液浓缩后的蛋白浓度为0.668mg/mL。经SDS-PAGE凝胶电泳检测，峰1组分在电泳上显示单一条带(图9，抗菌蛋白的SDS-PAGE电泳图谱)，表观分子量大小约为25kD，说明抗菌蛋白获得了有效分离。

将蛋白送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果如SEQ IDNO.1所示。

实施例3

Hg18菌株抗菌蛋白的稳定性

生防甲基营养型芽孢杆菌抗菌蛋白的特性研究

1温度对抗菌蛋白抑病原真菌活性的影响

将抗菌蛋白纯化物溶于0.2moL/LpH7.0的PBS缓冲液中，分别以40℃、60℃、80℃、100℃条件下加热处理60min，121℃条件下处理30min，用未加热处理的蛋白样品最为空白对照，采用牛津杯法，将100μL病原菌菌液涂布于PDA固体平板上，牛津杯放置在平板上，向杯内加入50μL抗菌蛋白复容物，置于30℃恒温培养箱内培养24h后观察抑菌效果。

热稳定性试验结果如图10所示，图10为温度对抗菌蛋白活性的影响结果图。

由图10可知，试验从40℃～121℃共5个温度处理。在100℃以下随着温度的升高，抗菌蛋白抗菌活性变化不明显。在121℃处理30min后抑菌活性下降了24.4％，与对照相比形成显著性差异。表明该抗菌蛋白对100℃以上的温度比较敏感。

2pH对抗菌蛋白抑病原真菌活性的影响

将10份抗菌蛋白纯化物溶于0.2moL/LpH7.0的PBS缓冲液中，每份8mL，然后用1moL/L HCl和1moL/L NaOH将pH分别调至3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，最终体积保持为10mL，以等体积的自然pH蛋白复容物作为空白对照，37℃水浴加热4h后将pH调至中性，平皿打孔法检测活性，每个处理设置3次重复。

酸碱稳定性试验结果如图11所示，图11为pH对抗菌蛋白活性的影响结果图。

由图11可知，抗菌蛋白经过10个不同的pH处理后，稳定性试验结果表明，在pH 3.0～10.0范围内抑菌活性差异不显著。经过pH11.0和pH12.0处理后，抑菌活性分别下降了18.6％和19.4％。表明该抗菌蛋白在中性和酸性环境中稳定，对强碱比较敏感。

3紫外线对抗菌蛋白抑病原真菌活性的影响

将抗菌蛋白纯化物溶于0.2moL/LpH7.0的PBS缓冲液中，放置于超净工作台中，紫外灯分别照射3h，6h，12h，24h，以未经处理的抗菌蛋白复容物作为对照，平皿打孔法检测对病原真菌的拮抗作用，测量抑菌圈直径，每个处理设置3次重复。

紫外线稳定性试验结果如图12所示，图12为紫外对抗菌蛋白活性的影响结果图。

由图12可知，Hg18抗菌蛋白经过24h的紫外线连续照射，抗菌活性为76.1％～79.2％，无显著性变化，表明该抗菌蛋白对紫外线照射不敏感，具有较强的抗紫外线照射能力。

4抗菌蛋白光照稳定性测定

将装有2mL复溶后抗菌蛋白溶液的培养皿置于40W日光灯(距光源40cm)下，分别照射3h、6h、9h，12h、16h，20h，24h，以未经照射的蛋白样品为对照，平皿打孔法检测对病原真菌的拮抗作用，测量抑菌圈直径，每个处理设置3次重复。

光稳定性试验结果如图13所示，图13为光照对抗菌蛋白活性的影响结果图，

由图13可知，Hg18抗菌蛋白经过24h的连续光照，与未经处理的蛋白样品相比，菌落直径无显著变化，抑菌活性为77.3％～79.6％。表明该抗菌蛋白对光照射不敏感，具有较强的抗光照能力。

结论

甲基营养型芽孢杆菌作为芽孢杆菌属中新的种属，具有广阔的应用前景。并且随着分子生物学研究的不断深入，以甲基营养型芽孢杆菌所产生的抗菌蛋白基因为目的基因转移到植物中构建抗病基因工程植株或生防工程菌株，进行生物农药的开发与应用，将成为今后的研究热点。生防芽孢杆菌中代谢的一些低分子量多肽类抗生素和抗菌蛋白类物质已作为微生物源农药进行工业化生产。本发明从Hg18菌株中分离纯化得到有活性作用的单一抗菌蛋白组分，抑菌活性明显，稳定性强，可以作为潜在的生防资源进行开发与应用。后续也可基于鉴定到抗菌活性物质的代谢角度和基因层面进行深入系统研究，明确其作用机制。本发明所述抗菌蛋白在100℃以下环境下、中性和酸性环境中、紫外线照射环境下以及光照环境下均具有很好的抑菌活性，特别能抑制尖孢镰刀菌和/或立枯丝核菌的活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 黑龙江省科学院微生物研究所

<120> 甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白的应用及分离纯化方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 304

<212> PRT

<213> 甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10(Bacillus methylotrophicus wswGH-10)

<400> 1

Met Arg Ile Asn His Asn Ile Ala Ala Leu Asn Thr Leu Asn Arg Leu

1 5 10 15

Ser Ser Asn Asn Gly Ala Ser Gln Lys Asn Met Glu Lys Leu Ser Ser

20 25 30

Gly Leu Arg Ile Asn Arg Ala Gly Asp Asp Ala Ala Gly Leu Ala Ile

35 40 45

Ser Glu Lys Met Arg Gly Gln Ile Arg Gly Leu Glu Met Ala Ser Lys

50 55 60

Asn Ser Gln Asp Gly Ile Ser Leu Ile Gln Thr Ala Glu Gly Ala Leu

65 70 75 80

Thr Glu Thr His Ala Ile Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Val Val Gln

85 90 95

Ala Gly Asn Thr Gly Thr Gln Asp Lys Ala Thr Asp Leu Gln Ser Ile

100 105 110

Gln Asp Glu Ile Ser Ala Leu Thr Asp Glu Ile Asp Gly Ile Ser Asn

115 120 125

Arg Thr Glu Phe Asn Gly Lys Lys Leu Leu Asp Gly Thr Tyr Lys Val

130 135 140

Asp Ala Ala Thr Pro Ala Asn Gln Lys Asn Leu Ile Phe Gln Ile Gly

145 150 155 160

Ala Asn Ala Thr Gln Gln Ile Ser Val Asn Ile Glu Asp Met Gly Ala

165 170 175

Asp Ala Leu Gly Ile Lys Glu Ala Asp Gly Ser Ile Ala Ala Leu His

180 185 190

Ser Val Asn Asp Leu Asp Val Thr Lys Phe Ala Asp Asn Lys Ala Asp

195 200 205

Ala Thr Asp Ile Gly Phe Asp Asn Gln Leu Lys Ile Val Asp Glu Ala

210 215 220

Ile Asn Gln Val Ser Ser Gln Arg Ala Lys Leu Gly Ala Val Gln Asn

225 230 235 240

Arg Leu Glu His Thr Ile Asn Asn Leu Ser Ala Ser Gly Glu Asn Leu

245 250 255

Thr Ala Ala Glu Ser Arg Ile Arg Asp Val Asp Met Ala Lys Glu Met

260 265 270

Ser Glu Phe Thr Lys Asn Asn Ile Leu Ser Gln Ala Ser Gln Ala Met

275 280 285

Leu Ala Gln Ala Asn Gln Gln Pro Gln Asn Val Leu Gln Leu Leu Arg

290 295 300

Claims

1.甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)wswGH-10的抗菌蛋白在制备抑菌的药物中的应用，所述抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白在制备在100℃以下环境下能够抑菌的药物中的应用，所述抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白在制备在中性和酸性环境中能够抑菌的药物中的应用，所述抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白在制备在紫外线照射环境下能够抑菌的药物中的应用，所述抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白在制备在光照环境下能够抑菌的药物中的应用，所述抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于，所述抑菌包括抑制尖孢镰刀菌和/或立枯丝核菌的活性。

7.权利要求1～6任一项所述应用中的甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的培养方法，包括以下步骤：

8.权利要求1～6任一项所述应用中的甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的抗菌蛋白的分离纯化方法，包括以下步骤：

将甲基营养型芽孢杆菌wswGH-10的培养液离心，得到上清液；

将所述沉淀进行透析除盐，得到粗蛋白；

将所述粗蛋白进行凝胶过滤层析，得到抗菌蛋白。

9.根据权利要求8所述的分离纯化方法，其特征在于，所述凝胶过滤层析包括：将粗蛋白在100℃加热20min，离心，取上清液，上样于SephedexS-75分子筛层析柱，洗脱，收集有抑菌活性的蛋白峰。

10.根据权利要求9所述的分离纯化方法，其特征在于，所述洗脱采用20～50mMpH值为7.0～7.4的磷酸盐缓冲液进行，所述洗脱的流速为0.5～1.0mL/min。