CN110452857B - 一株产非蛋白类小分子抗菌代谢物的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

一株产非蛋白类小分子抗菌代谢物的植物乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了保藏编号为CGMCC No.17712的植物乳杆菌KZ0310,菌体及其代谢物具有广谱抗菌活性,对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌(包括致病菌和腐败菌)均展现出强抑菌能力,可用于制备抗菌或/和防腐产品,应用于医疗、食品等领域以控制细菌性病原菌或腐败菌。本发明的抗菌代谢物不同于乳酸菌细菌素或抗菌肽,为非蛋白类小分子物质,在使用时可以避免被人、动植物体内的蛋白酶降解失活,从而有利于抗菌活性的稳定发挥,具有良好的开发应用前景。

Description

一株产非蛋白类小分子抗菌代谢物的植物乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域,涉及一株产非蛋白类小分子抗菌代谢物的植物乳杆菌及其应用。
背景技术
包括抗生素在内的抗菌剂不仅拯救了无数人的性命,而且帮助人们延长了寿命和提高了生活质量。然而,不幸的是,过量使用和误用抗菌剂(包括非治疗目的在动物、食品、农业和水产业中的不当使用)导致了抗性微生物的出现和大量传播。抗菌剂抗性在所有微生物中被发现,不管是细菌、真菌、病毒还是寄生虫。随着全球贸易和旅游的快速发展,抗性微生物可以传播到全世界的任何一个角落。然而,目前的抗菌药物现状是:一方面,已有的药物不能满足治疗的需要;另一方面,没有足够新的抗菌药物被开发出来取代旧的或者逐渐失效的药物。结果,许多普通的感染逐渐变得危险或无法治疗,从而导致更长的治疗周期和更高的死亡率,如同回到没有抗生素的时代。抗菌剂抗性已经成为人类健康的重大威胁之一,因此,急需开发新的抗菌药物或抗菌手段以有效杀死致病菌。
乳酸菌是一类厌氧或者兼性厌氧革兰氏阳性杆菌或球菌、不形成芽孢、不运动、无细胞色素和过氧化氢酶活性、对葡萄糖发酵能产生50%以上乳酸的细菌的总称。乳酸菌被FDA认为是具有GRAS安全等级的微生物,广泛分布于自然界中,包括动植物体表、乳制品、发酵食品等中。乳酸菌能产生有利于食物保藏的代谢物,如CO2、双乙酰、过氧化氢、脂肪酸、乳酸、苯甲酸、细菌素、环二肽等,人们常利用乳酸菌代谢产物的特性来加工和处理某些食品,提高食品的适口性或延长储藏期。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株乳酸菌,菌体及其代谢物具有广谱抗菌活性;目的之二在于提供该乳酸菌的抗菌代谢物的制备方法;目的之三在于提供该乳酸菌及其抗菌代谢物的用途。
经研究,本发明提供如下技术方案:
1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KZ0310,保藏编号为CGMCC No.17712。
本发明的植物乳杆菌KZ0310是从家庭自制传统发酵的泡菜水中分离获得,于2019年5月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号),保藏编号为CGMCC No.17712,分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
2.植物乳杆菌KZ0310或其菌悬液或其发酵液或其代谢物在制备抗菌或/和防腐产品中的应用。
进一步,所述抗菌或/和防腐产品同时抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
进一步,所述抗菌或/和防腐产品抑制大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌(Salmonella)、阪崎克罗诺肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)中的任一种或多种。
其中,大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、阪崎克罗诺肠杆菌为革兰氏阴性菌,单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌为革兰氏阳性菌。
3.由植物乳杆菌KZ0310产生的抗菌代谢物。
进一步,所述抗菌代谢物为非蛋白类小分子物质,分子量低于500Da。
4.所述抗菌代谢物的制备方法,包括以下步骤:
(1)将植物乳杆菌KZ0310接种于MRS液体培养基中静置培养,所得发酵液用乙酸乙酯萃取,收集中间层,旋转蒸发除去乙酸乙酯,得到代谢物粗样;
(2)将步骤(1)得到的代谢物粗样先用非极性大孔吸附树脂进行脱色除杂,再进行色谱分离纯化,最后进行抗菌活性测定,即得到抗菌代谢物。
进一步,所述步骤(1)是以0.1wt%的接种量将植物乳杆菌KZ0310接种于MRS液体培养基中,30℃静置培养72h,所得发酵液用乙酸乙酯萃取,收集中间层,旋转蒸发除去乙酸乙酯,得到代谢物粗样。
进一步,所述步骤(2)是在步骤(1)得到的代谢物粗样中加入非极性大孔吸附树脂,4-16℃、200rpm过夜震荡以脱色除杂,再依次用凝胶过滤色谱、反相色谱和高效液相色谱进行分离纯化,收集分离液并进行抗菌活性测定,即得到抗菌代谢物。
5.所述抗菌代谢物在制备抗菌或/和防腐产品中的应用。
进一步,所述抗菌或/和防腐产品同时抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
进一步,所述抗菌或/和防腐产品抑制大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌(Salmonella)、阪崎克罗诺肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)中的任一种或多种。
本发明的有益效果在于:本发明提供了一种植物乳杆菌KZ0310,菌体及其代谢物具有广谱抗菌活性,对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌(包括致病菌和腐败菌)均展现出强抑菌能力,可用于制备抗菌或/和防腐产品,应用于医疗、食品等领域以控制细菌性病原菌或腐败菌。本发明的抗菌代谢物不同于乳酸菌细菌素或抗菌肽,为非蛋白类小分子物质,在使用时可以避免被人、动植物体内的蛋白酶降解失活,从而有利于抗菌活性的稳定发挥,具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1为植物乳杆菌KZ0310菌体对致病菌的抑菌活性,其中S为金黄色葡萄球菌,E为大肠埃希氏菌。
图2为植物乳杆菌KZ0310菌体对7种致病菌的抑菌活性,其中标注不同英文字母(a、b、c)的数据之间存在显著差异(P<0.05)。
图3为代谢物粗样的树脂脱色除杂处理,其中A为脱色除杂前后样品的颜色,S为脱色除杂前后样品对金黄色葡萄球菌的抑菌活性,E为脱色除杂前后样品对大肠埃希氏菌的抑菌活性。
图4为凝胶过滤色谱分离,其中A为Superdex 30increase 10/30GL凝胶过滤柱分离曲线,曲线1为UV吸收曲线,曲线2为电导cond曲线;B为管5和管6组分(A中箭头所示峰)对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。
图5为反相色谱(RPC)分离,其中A为3mL反相柱分离曲线,曲线1为UV吸收曲线,曲线2为梯度洗脱曲线;B为管4、管5、管6和管7组分(A中箭头所示部分)对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。
图6为高效液相色谱(HPLC)分离,其中A为HPLC分离曲线,B为保留时间3.143min处的峰组分(A中箭头所示峰)对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。
图7为抗菌代谢物的蛋白酶稳定性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1:抗菌乳酸菌的筛选与鉴定
(1)微生物菌株的分离
用灭菌生理盐水以10倍的稀释梯度对泡菜水样品进行稀释。分别取100μL 10-2、10-3、10-4、10-5稀释度的泡菜水稀释液涂布到MRS固体培养基上,37℃恒温培养48h。挑取乳酸菌单菌落,进一步采用划线分离法对特征菌落进行反复地分离纯化,记录各菌落的形态特征并采用革兰氏染色镜检,观察。
所述MRS固体培养基按质量百分含量计由以下成分组成:葡萄糖2%、蛋白胨1%、牛肉膏1%、酵母膏0.5%、乙酸钠0.5%、吐温80 0.1%、柠檬酸氢二胺0.1%、硫酸镁0.02%、硫酸锰0.005%、琼脂粉1.5%、余量为蒸馏水。
KZ0310菌株菌落形态特征:在MRS琼脂平板上菌落形状为圆形、表面光滑且稍微凸起,菌落颜色为浅乳白色。
KZ0310菌株个体形态特征:革兰氏阳性(G+),短杆状,单个或成对,无芽孢,无鞭毛。
(2)抗菌乳酸菌的筛选
使用双层划线法进行抗菌乳酸菌的筛选。将乳酸菌接种到MRS液体培养基中培养至OD600nm=0.8,用接种环将菌悬液划线到MRS琼脂平板上(2条平行线,长度约2cm),37℃恒温培养12h。将10mL含有107CFU/mL指示菌(金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希氏菌ATCC25922)的LB琼脂培养基(0.7wt%琼脂)倾注到上述MRS培养基表面,37℃恒温培养24h,观察抑菌圈大小。
结果如图1所示,KZ0310菌株对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌均展现出强抑菌圈。
(3)微生物菌株的鉴定:
将KZ0310菌株接种于MRS液体培养基中,37℃培养12h。按
Figure BDA0002194386390000041
Genomic DNAMini Kit(Invitrogen,USA)试剂盒说明书方法提取乳酸菌基因组DNA。以乳酸菌基因组DNA为模板,27F(SEQ ID No.1)和1495R(SEQ ID No.2)为引物进行16s rDNA扩增,并对PCR扩增产物进行测序分析。
获得的KZ0310菌株的16s rDNA序列如SEQ ID No.3所示,在NCBI数据库中进行BLAST比对分析,结果显示,KZ0310菌株与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的Identity=99%(>97%)。因此,KZ0310菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),将其命名为KZ0310,于2019年5月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号),保藏号为CGMCC No.17712。
实施例2:植物乳杆菌KZ0310的抗菌活性
将粪肠球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、阪崎克罗诺肠杆菌和铜绿假单胞菌7种致病菌进行活化。将0.1mL过夜培养的各致病菌接种到100mL新鲜的LB琼脂培养基(0.7wt%琼脂)中,混匀,使用实施例1(2)中所述双层划线法测定植物乳杆菌KZ0310对这7种致病菌的抑菌圈直径(以垂直于菌线方向计算)。
结果如图2所示,植物乳杆菌KZ0310对7种致病菌都显示出了良好的抑菌活性,抑菌能力强弱顺序依次为:单核细胞增生李斯特菌>大肠埃希氏菌>铜绿假单胞菌>沙门氏菌>阪崎克罗诺肠杆菌>金黄色葡萄球菌>粪肠球菌。由此可见,植物乳杆菌KZ0310具有广谱抗菌活性,能够抑制多种致病菌,可用于制备抗菌药物,用于治疗由下述任一种或多种细菌引起的感染性疾病:单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、阪崎克罗诺肠杆菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌;也可以将植物乳杆菌KZ0310活性菌体或其菌悬液用于制备防腐剂,加入食品、药品等中,抑制微生物的生长和繁殖,防止保护对象腐败变质。
实施例3:抗菌代谢物的提取、部分纯化及抗菌活性
(1)抗菌代谢物的提取
挑取植物乳杆菌KZ0310单菌落接种于10mL MRS液体培养基中,37℃、150rpm过夜培养,作为种子菌。以0.1wt%的接种量将种子菌接种到1L MRS液体培养基中,30℃静置培养72h,离心(8000rpm、15min、4℃),上清液用乙酸乙酯萃取,收集中间层乳白液,旋转蒸发除去乙酸乙酯,获得植物乳杆菌KZ0310代谢物粗样。
使用牛津杯法测定粗样对粪肠球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌、阪崎克罗诺肠杆菌和铜绿假单胞菌7种致病菌的抑菌活性。结果显示,植物乳杆菌KZ0310的代谢物粗样对7种致病菌均具有抑菌活性,抑菌圈直径大小在17.7-25.1mm之间。
(2)抗菌代谢物的部分纯化
在植物乳杆菌KZ0310代谢物粗样中加入20g非极性大孔吸附树脂,16℃、200rpm过夜震荡,以吸附色素及部分蛋白类物质。脱色除杂前后样品的颜色及样品对指示菌(金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希氏菌ATCC25922)的抑菌活性如图3所示。经树脂处理后,样品的颜色由深棕黑色变为浅黄色。
脱色除杂后的样品使用Superdex 30increase 10/30GL凝胶过滤柱进行分离,按1mL/管收集分离液,对各管收集液进行抗菌活性测定(以金黄色葡萄球菌ATCC25923为指示菌)。如图4所示,经Superdex 30increase 10/30GL凝胶过滤柱分离,得到了7个较明显的分离峰,其中保留体积在23-25mL区间的峰(图中箭头所示峰)组分具有抑菌活性。该分离柱的柱体积为24mL,抗菌活性峰出峰的时间在盐峰(根据cond值)的主峰后出现,由此可以判断,该抗菌活性峰的组分为小分子物质,分子量低于500Da。
将Superdex 30increase 10/30GL凝胶过滤柱分离得到的抗菌活性峰组分进行合并,真空冷冻浓缩后,接着使用RPC 3mL反相柱进行分离,按0.5mL/管收集分离液,对各管收集液进行抗菌活性测定(以金黄色葡萄球菌ATCC25923为指示菌)。如图5所示,经RPC 3mL反相柱分离,得到了8个较明显的分离峰,其中保留体积在4-5mL区间的峰(图中箭头所示峰)组分具有抑菌活性。
最后,将RPC 3mL反相柱分离得到的抗菌活性峰组分进行合并,真空冷冻浓缩后,使用HPLC ZORBAX 300Extend-C18柱进行分离,按出峰进行收集,对各峰收集液进行抗菌活性测定(以金黄色葡萄球菌ATCC25923为指示菌)。如图6所示,经HPLC分离,得到了5个较明显的分离峰,其中保留时间在3.143min处的峰(图中箭头所示峰)组分具有抑菌活性。
(3)蛋白酶处理
将HPLC纯化收集的抗菌活性样品,使用蛋白酶K(proteinase K)处理4h,100℃水浴加热酶失活处理后,牛津杯法测定样品的剩余抗菌活性(以大肠埃希氏菌ATCC25922为指示菌),以等体积缓冲液代替蛋白酶K进行相同处理作为对照(control)。结果如图7所示,经蛋白酶处理后的样品,抗菌活性没有任何损失,说明具有抗菌活性的小分子物质为非蛋白类物质。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
序列表
<110> 西南大学
<120> 一株产非蛋白类小分子抗菌代谢物的植物乳杆菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<210> 2
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tcggggacat ggatacaggt ggtgcatg 1048

Claims (2)

1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KZ0310,保藏编号为CGMCC No. 17712。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌KZ0310或其菌悬液或其发酵液在制备抗菌或/和防腐产品中的应用;所述抗菌或/和防腐针对的病原菌是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌(Salmonella)、阪崎克罗诺肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis)中的任一种或多种。
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