CN112608369A - 一种具有抑菌活性的细菌素及其生产方法及用途 - Google Patents

一种具有抑菌活性的细菌素及其生产方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有抑菌活性的细菌素，该细菌素由弯曲芽孢杆菌菌株(Bacillus flexus)经过发酵制备产生，所获得的分子量为6094Da，该细菌素在酸碱条件下稳定，能够耐受高温，对胰蛋白酶、胃蛋白酶等部分消化酶不敏感，对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、产气荚膜梭菌等革兰氏阳性致病菌具有很强的预防和拮抗作用，在医疗、食品、饲料、养殖、种植等领域具有广泛的应用前景。

Description

一种具有抑菌活性的细菌素及其生产方法及用途
技术领域
本发明涉及细菌素，涉及到微生物发酵领域，具体涉及一种深海来源的弯曲 芽孢杆菌R29-2产生的弯曲菌素，该细菌素能有效拮抗金黄色葡萄球菌、无乳链 球菌、粪肠球菌、产气荚膜梭菌等致病菌。
背景技术
自上世纪20年代末弗莱明发现了青霉素以来，抗生素彻底改变了医学领域， 它们每年挽救数百万患者的生命，并且在预防传染病和外科手术等领域发挥了关 键作用。然而近年来，对人和动物误用和滥用抗生素大大加速了微生物耐药性的 形成，新型抑菌类物质的研究备受关注。
细菌素是一类由核糖体合成，需经翻译后修饰活化并且经过特定转运系统运 输到胞外发挥作用的具有抑菌活性的肽类物质，细菌素以其有别于抗生素的抑菌 机制、不易产生耐药性和无毒副作用的特点，成为最有可能代替抗生素的物质之 一。传统抗生素通常是针对单一的酶来控制代谢途径(如脱氧核苷酸、蛋白质及 细胞壁的合成)，容易引起细菌耐药性；而细菌素作为微生物获得生存优势的常 用手段，可作用于目标菌株生物被膜、细胞壁、细胞膜和功能基因等多处靶点， 从而更难产生耐药性。此外，大部分细菌素抑菌谱比较窄，仅对与其亲缘关系较 近的菌株产生拮抗作用，很大程度上降低了环境中其他细菌产生耐药性的风险， 且细菌素通常能耐受高温，在卫生、食品、饲料等行业作为替代传统抗生素的添 加剂具有极大的应用前景。
细菌素的研究多集中于乳酸杆菌、芽孢杆菌等来自于陆生生物或陆地环境中 的菌种，关于海洋细菌产生的细菌素的报道较少。深海环境特有的高盐、高压、 低温、缺氧、少光等极端条件，赋予了海洋微生物不同于陆地微生物的代谢系统 和防御体系，产生了许多结构新颖且具有特异生物活性的代谢产物，在抑菌方面 具有独特效应。
弯曲芽孢杆菌是一种革兰氏阳性细菌，此前有文献报道其在降解有机氮、邻 苯二酚、促进沼气发酵以及产β-淀粉酶等方面具有良好的应用，但未见该菌有抑 菌活性的相关报道。本发明从深海中分离到一株弯曲芽孢杆菌，能产生抗革兰氏 阳性菌活性物质，该活性物质经证实为一种全新细菌素，命名为弯曲菌素 (flexusin)。
发明内容
基于当前抗生素耐药性日益严峻的现状，本发明提供了一种新的抑菌活性物 质，由分离自西太平洋卡罗琳海山水样中弯曲芽孢杆菌合成的弯曲菌素，能有效 拮抗金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌、产气荚膜梭菌等革兰氏阳性致病 菌，且相对较难引起细菌耐药性，在医疗、食品、饲料、养殖、种植等领域内作 为传统抗生素替代品具有极大的应用前景。
据此：本发明发现了一种具有抑菌活性的细菌素，所述细菌素的分子量为6094Da。
进一步的，所述的是由弯曲芽孢杆菌代谢合成产生的。
进一步的，所述弯曲芽孢杆菌分离自西太平洋卡罗琳海山海水。该菌株已于 2019年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏编号为CGMCCNo.18731。
进一步的，所述细菌素采用RP-C8检测时于220nm条件下获得特征峰或采 用C18柱检测时于280nm条件下得到特征峰。
另一方面，本发明发明了一种细菌素的生产方法，具体生产方法如下：
(1)发酵：将弯曲芽孢杆菌接种于培养基中，深层通气发酵24～36h，得到 含有细菌素的发酵液；
(2)分离：将含弯曲菌素发酵液经离心，收集上清液；上清液经酸沉和/ 或大孔树脂吸附洗脱，收集活性组分，真空浓缩；
(3)提取：用60-80％饱和度硫酸铵从活性组分中盐析提取细菌素粗提物；
(4)纯化，将细菌素通过物理手段进行纯化，获得细菌素。
进一步的，所述的细菌素的生产方法中所用的培养基为液体LBM培养基， 所述通气发酵周期为14-120小时。
进一步的，所述的分离方法中所用的大孔树脂为D4006型和D3520型大孔 树脂。
进一步的，所述的细菌素生产方法中，按照如下方法进行细菌素的分离：
(1)将上清液吸附到经过预处理的大孔树脂中，然后按照从低到高浓度的 乙醇进行洗脱，分别收集不同浓度的洗脱组分并在40-60℃下浓缩，获得浓缩液； 优选的，乙醇的洗脱浓度为40％～90％；
(2)将浓缩液用6M HCl酸化至pH 1.5-5.0，使活性成分在4℃沉淀，用 90％乙醇溶解沉淀物。
另一方面，本发明提供了该细菌素在在制备预防和/或治疗致病菌制剂中的 用途。
进一步的，所述细菌素能够抑制金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌、 产气荚膜梭菌等致病菌。
再一方面，本发明发现了适用于该细菌素产生菌培养的培养基，其特征在于， 所述培养基体积占比为酵母粉1-15g/L、氯化钠1-60g/L、胰蛋白胨1-30g/L、 葡萄糖1-50g/L、BG11 10-30g/L。
本发明的优点在于：
本发明首次提供了一种新型的细菌素。该细菌素对金黄色葡萄球菌、无乳链 球菌、粪肠球菌、产气荚膜梭菌等多种革兰氏阳性致病菌具有拮抗活性，该细菌 素性质稳定，在pH2-10的范围内，80℃以下其抑菌活性保持不变，能够广泛地 应用在卫生、食品、饲料、养殖、种植等领域。
附图说明
图1为发酵过程中生物量、pH及DO变化曲线；
图2为大孔树脂的筛选；
图3为电泳前样品的抑菌活性，H1、H2、H3为不同浓度额弯曲菌素粗提 物，F、F1、F2为大孔树脂洗脱样，H(乙)为酸沉后样品，阴为阴性对照。其中， H1、H2、F分别对应图5中2、3、4泳道样品；
图4为弯曲菌素粗提物抗金黄色葡萄球菌活性；
图5为弯曲菌素HPLC纯化结果；
图6为SDS-PAGE结果，Lane 1：Marker；Lane 2：6μl粗提物；Lane 3： 15μl粗提物；Lane 4：HPLC纯化峰；
图7为HPLC-Q-TOF结果；
图8、图9分别为不同温度、pH条件下，细菌素的抑菌活性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，所述实施例用于说明本发明，但不 用来限制本发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明均可 从商业途径得到。
具体的，实施例中所述的弯曲菌素即文中所述的全新发现的细菌素。
实施例1弯曲菌素发酵液的制备
(1)基础培养基LBM：酵母粉1-15g/L、氯化钠1-60g/L、胰蛋白胨1-30g/L、 葡萄糖1-50g/L、BG11 10-30g/L。
(2)种子液制备：从试管斜面挑取R29-2单菌落至一级种子培养基，培养16-20 h后转接至二级种子培养基，32℃、120rpm培养16～20h至对数生长期。
(3)液体深层发酵：按照(1)配制20L LBM培养基于50L发酵罐中，接种 量为1％，发酵过程中每2h取样监测发酵液OD600、pH、溶氧(DO)及抑菌活 性变化情况(见图1)，待OD600值趋于稳定，即停止发酵下罐得到细菌素发酵 液。
实施例2弯曲菌素的提取纯化
(1)大孔树脂的筛选：选择10种吸附效果不同的大孔树脂，分别采用了 D3520、XR925、D101、XR901、XR926M、XR925CSB、AB-8、XR929C、XAD-1、 D4006，预处理后加入等量的无菌发酵上清液，静态吸附2h。除去未吸附的发 酵液上清，加入等量的乙醇溶液洗脱。收集乙醇洗脱液并检测抑菌活性，据此筛 选获得有效吸附树脂为：D4006大孔树脂、D3520大孔树脂，优选的，最佳吸附 树脂为D4006型大孔树脂(见图2)。
(2)细菌素的粗提：下罐后得到含细菌素发酵液经10000rpm离心后收集 上清液，选取D4006型大孔树脂，对弯曲芽孢杆菌R29-2产生的细菌素进行初 步分离，用不同浓度的乙醇进行洗脱，并检测各组分的抑菌活性(见图3)，其 中F为洗脱后的样品有抑菌活性，F1为吸附后余下的发酵液上清无活性，F2为 水洗后的样品无活性。对收集到的有活性的组分在40-60℃下进行旋转蒸发浓缩， 并采用二倍稀释法检测活性(见图4)。发酵上清液也可用HCl调pH至酸性条 件，令活性成分在4℃条件下过夜酸沉，后经过滤或离心收集沉淀(见图3，H (乙))。
(3)细菌素粗提物通过HPLC分离纯化细菌素：细菌素粗提物采用RP-C8 柱进行分离纯化，纯化条件为：洗脱液为含0.1％质量的三氟乙酸的水和乙腈溶 液，梯度洗脱；时间50min，流速为1ml/min；检测波长为220nm；细菌素HPLC 洗脱保留时间为26min(见图5a、5b，其中5a为细菌素HPLC液相图、5b为细 菌素抑菌图)。流动相洗脱梯度见表1。
表1流动相洗脱梯度
Figure BDA0002871682950000051
(4)纯化细菌素对革兰氏阳性致病菌的抑制：取10μl纯化后的弯曲菌素(保 留时间为26min)，用overlay法测定对革兰氏阳性致病菌的抑制活性，所用病原 菌包括但不限于金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌、产气荚膜梭菌等多种 革兰氏阳性致病菌见图5b)。
所述弯曲芽孢杆菌R29-2的保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学 院微生物研究所；保藏日期：2019年10月24日；弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus 的保藏编号为：CGMCC No.18731。
实施例3弯曲菌素的鉴定方法
(1)通过对粗提物进行Tricine-SDS-PAGE以及抑菌实验，用tricine缓冲液 按1∶1(V/V)稀释样品，在40℃条件下加热30-60min。加样后在30V恒压下电 泳1h，接着在150V恒压下电泳2h，采用低分子量蛋白标准品作为对照。电泳 结束后经考马斯亮蓝染色、脱色后，对应标品5.8-7.8kDa之间，在细菌素样品 的泳道上有一条蓝色条带，也确证了弯曲菌素的蛋白质属性(见图6)。
(2)将经过分离纯化后的弯曲菌素利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质 谱测定其分子量和鉴定其结构，其中，质谱分析采用HPLC-Q TOF分析，确定 该细菌素分子量为6094Da(见图7)，质谱型号：Bruker impact II UHR-TOF；离 子源：ESI源。
实施例4弯曲菌素的稳定性
(1)热稳定性
将抑菌物质粗提物分别放于30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃， 100℃条件下水浴加热30min，后冷却至室温，以未处理的样品作为对照，分别 测定其抑菌活性，记录抑菌活性的变化。
结果显示，细菌素粗提物在30-70℃下处理30min，其对金黄色葡萄球菌的 抑制活性没有明显变化(见图8)；80℃下处理30min，活性降低50％；100℃ 下处理30min，对金黄色葡萄球菌没有抑制作用，该抑菌物质可耐受一定的高温。
(2)pH耐受性
分别将其pH调至2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，室温下保持2h，再 将各管的pH调至中性，以未处理的样品作为对照，进行抑菌实验，观察其抑菌 活性变化。
粗提物在pH 2-11下处理2h后，抑菌性能基本维持稳定，在pH 11条件下， 活性略有降低，该抑菌物质可以耐受大范围的pH变化，而不丧失活性(见图9)， 其pH稳定性良好。
(3)酶处理的影响
取两份粗提物溶液900μL，分别加入100μL浓度为10mg/mL胰蛋白酶、 木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K，使酶的终浓度为1mg/mL，在适宜的pH条 件下37℃处理2h，调反应液pH为7.0，以未添加酶的样品和纯酶液作为对照， 进行抑菌实验，记录抑菌能力的变化，结果如表4所示。
表4酶处理后细菌素抑菌活性
Figure BDA0002871682950000061
“-”表示无活性

Claims (11)

1.一种具有抑菌活性的细菌素，其特征在于，所述细菌素的分子量为6094Da。
2.根据权利要求1所述的细菌素，其特征在于，所述的细菌素由弯曲芽孢杆菌代谢合成产生。
3.根据权利要求1所述的细菌素，其特征在于，所述弯曲芽孢杆菌来源于西太平洋卡罗琳海山。
4.根据权利要求1所述的细菌素，其特征在于，所述细菌素采用RP-C8检测时于220nm条件下获得特征峰或采用C18柱检测时于280nm条件下得到特征峰。
5.权利要求1所述的细菌素的生产方法，其特征在于，
(1)发酵：将弯曲芽孢杆菌接种于培养基中，得到含有细菌素的发酵液；
(2)分离：将含细菌素发酵液经离心，收集上清液；上清液经酸沉和/或大孔树脂吸附洗脱，收集活性组分，真空浓缩；
(3)提取：用60-80％饱和度硫酸铵从活性组分中盐析提取细菌素粗提物；
(4)纯化，采用物理手段对细菌素粗提物进行纯化，获得细菌素。
6.根据权利要求5所述的细菌素的生产方法，其特征在于，所述培养基为LBM培养基，所述通气发酵周期为14-120小时。
7.根据权利要求5所述的细菌素的生产方法，其特征在于，所述大孔树脂为D4006型、D3520型大孔树脂。
8.根据权利要求4所述的细菌素的生产方法，其特征在于，所述分离方法为：
(1)将上清液吸附到经过预处理的大孔树脂中，然后按照从低到高浓度的乙醇进行洗脱，分别收集不同浓度的洗脱组分并在40-60℃下浓缩，获得浓缩液；优选的，乙醇的洗脱浓度为40％～90％；
(2)将浓缩液用6M HCl酸化至pH 1.5-5.0，使活性成分在4℃沉淀，用90％乙醇溶解沉淀物。
9.权利要求1所述的细菌素在制备预防和/或治疗致病菌制剂中的用途。
10.根据权利要求9所述的细菌素在制备预防和/或治疗致病菌制剂中的用途，其特征在于，所述细菌素能够抑制金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、粪肠球菌、产气荚膜梭菌。
11.一种用于培养权利要求1或权利要求5所述的细菌素的产生菌的培养基，其特征在于，所述培养基体积占比为酵母粉1-15g/L、氯化钠1-60g/L、胰蛋白胨1-30g/L、葡萄糖1-50g/L、BG11 10-30g/L。
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