CN106978457B

CN106978457B - 一种抗生素FusaricidinA的制备方法

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Publication number: CN106978457B
Application number: CN201710269057.5A
Authority: CN
Inventors: 韩瑨; 刘振民; 吴正钧; 花榜清; 冯华峰
Original assignee: Bright Dairy and Food Co Ltd
Current assignee: Bright Dairy and Food Co Ltd
Priority date: 2017-04-24
Filing date: 2017-04-24
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2037-04-24
Also published as: CN106978457A

Abstract

本发明公开了一种抗生素FusaricidinA的制备方法，包括以下步骤：(a)将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333接种于麸皮培养基中进行发酵，得到发酵液；(b)将发酵液离心取上清，灭活蛋白酶，待冷却后，萃取取正丁醇相，去除有机相，得到粗品1；(c)将粗品1分离，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到粗品2；(d)将粗品2纯化，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得抗生素FusaricidinA。本发明首次采用牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333进行发酵制得抗生素FusaricidinA，披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵麸皮培养基生成抗生素FusaricidinA的新用途。

Description

一种抗生素FusaricidinA的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗生素FusaricidinA的制备方法。

背景技术

抗生素(antibiotic)是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。抗生素的特点有：(1)直接作用于菌体细胞。抗生素能选择性地作用于菌体细胞DNA、RNA和蛋白质合成系统的特定环节，干扰细胞的代谢作用，妨碍生命活动或使停止生长，甚至死亡。(2)具有选择性抗生谱。不同抗生素对不同病原菌的作用不一样，对某种抗生素敏感的病原菌种类称为该抗生素的抗生谱(抗菌谱)，这一点不同于无选择性的普通消毒剂或杀菌剂。(3)有效作用浓度低。各种抗生素一般都在很低浓度下对病原菌就发生作用，这是抗生素区别于其他化学杀菌剂的又一主要特点。各种抗生素对不同微生物的有效浓度各异，通常以抑制微生物生长的最低浓度作为抗生素的抗菌强度，简称有效浓度。有效浓度越低，表明抗菌作用越强。

Fusaricidins类抗生素是由6个氨基酸残基和1个15-胍基-3-羟基十五烷酸(GHPD)组成的环状多肽类抗生素，分子量大都是900Da左右。自20世纪 90年代至今，从多粘类芽孢杆菌中分离出的fusaricidins类抗生素主要有 LI-F03、LI-F04、LI-F05、LI-F06、LI-F07、LI-F08以及fusaricidinsA、B、 C、D。各种fusaricidins类抗生素结构基本相同，具有相同的侧链，只是氨基酸残基有所不同。结构上的类似使得它们具有相同或相近的生物活性，即对革兰氏阳性菌和植物病原真菌有很好的抗菌效果。

中国专利申请CN103740618A公开了类芽孢杆菌属的一个新菌种(后被定名为牛类芽孢杆菌，Paenibacillus bovis)，并将其中的模式菌株BD3526于 2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该菌株的保藏编号为：CGMCCNo.8333，该菌株的菌落非常粘稠，表明该菌株具有高产胞外多糖的生理特性。此外，中国专利申请 CN104757544A和CN104762350A公开了该菌株具有代谢天然培养基产抑菌性物质的能力及其应用，但并未揭示代谢产物中发挥抑菌作用的明确组分。

纵览有关抗生素FusaricidinA的报道，发现其来源相对狭窄，无一例外地均产自多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，导致这类抗生素来源不足。其次，从培养基角度来看，前期的报道皆采用化学合成培养基，这将直接影响目标物FusaricidinA制备的成本和使用的安全性。上述这些都是本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

基于上述技术问题，本发明提供了一种抗生素FusaricidinA制备的新方法，以牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333为发酵菌株，以麸皮培养基作为培养介质，发酵制得抗生素FusaricidinA。

具体地，提供了一种抗生素FusaricidinA的制备方法，包括以下步骤：(a) 将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于麸皮培养基中进行发酵，得到发酵液；(b)将步骤(a)得到的发酵液离心取上清，置于高温水浴中灭活蛋白酶，待冷却后，加入正丁醇萃取，离心取正丁醇相，除去正丁醇，加水溶解，冷冻干燥，得到粗品1；(c)将步骤(b)得到的粗品1通过凝胶柱分离，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到粗品2；(d)将步骤(c)得到的粗品2通过HPLC纯化，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，即得抗生素FusaricidinA。

进一步地，上述步骤(a)中，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种量为1.6x10⁶～8x10⁶cfu/mL。

进一步地，上述步骤(a)中，麸皮培养基包括麸皮和水，麸皮占麸皮培养基的质量百分比为2～6％。

进一步地，上述步骤(a)中，发酵为振荡培养，振荡速度为100～300rpm。

进一步地，上述步骤(a)中，发酵的温度为25℃～35℃。

进一步地，上述步骤(a)中，发酵的时间为48～96h。

进一步地，上述步骤(b)中，离心的速度为6,000～10,000g，离心的时间为10～20分钟。

进一步地，上述步骤(b)中，高温水浴的温度为60～80℃，保温时间为 10～30分钟。

进一步地，上述步骤(b)中，正丁醇加入量为发酵液体积的0.5～2倍，萃取次数为3～5次，每次萃取静置的时间为8～16h。

进一步地，上述步骤(c)中，凝胶柱为LH20凝胶柱，规格为D 2.6cm ×30cm，分离条件包括：以体积比为3的甲醇-水溶液进行等度洗脱，洗脱速度为2mL/min，洗脱液的收集速度为2.5min/管。

进一步地，上述步骤(d)中，HPLC采用的色谱柱为C₁₈柱，规格为 Sunfire C₁₈柱，20mm×250mm，粒径5μm，分离条件包括：以含0.1％TFA 的水作为A相，含0.1％TFA的乙腈作为B相进行梯度洗脱，洗脱速度为4 mL/min，洗脱液的收集速度为1.5min/管。收集保留时间在21.2min的组分，即可得到抗生素FusaricidinA。

上述技术方案中的制备方法，首次采用牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333，以麸皮培养基作为培养介质进行发酵，并经过离心、萃取，凝胶柱分离、HPLC纯化、冷冻干燥，制备得到抗生素FusaricidinA，披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵麸皮培养基生成抗生素 FusaricidinA的新用途，拓宽了抗生素FusaricidinA的来源。同时，纯天然、廉价的麸皮培养基，避免使用化学合成培养基，令制得的抗生素FusaricidinA 具有更高的使用安全性、更低的制备成本。

生物材料保藏信息：

本发明提供的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)BD3526菌株，已于2013年 10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333。

附图说明

图1为本发明实施例1中粗品1在LH20凝胶柱上的分离效果。

图2为本发明实施例1中粗品1在LH20凝胶柱上分离后点种法检测抑菌活性的效果。

图3为本发明实施例1中粗品2在HPLC上的纯化效果。

图4为本发明实施例1中抑菌活性组分的ESI-MS图谱。

图5为本发明实施例1中抑菌活性组分的二级质谱图。

具体实施方式

为更清楚的对本发明技术方案予以阐述，下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步阐述：

在面临“如何拓宽抗生素FusaricidinA的来源，且避免使用化学合成培养基”这一技术问题时，发明人经过创造性劳动，提供一种抗生素 FusaricidinA的制备方法，包括以下步骤：(a)将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于麸皮培养基中进行发酵，得到发酵液；(b) 将步骤(a)得到的发酵液离心取上清，置于高温水浴中灭活蛋白酶，待冷却后，加入正丁醇萃取，离心取正丁醇相，除去正丁醇，加水溶解，冷冻干燥，得到粗品1；(c)将步骤(b)得到的粗品1通过凝胶柱分离，收集、检测、合并抑菌活性组分，冷冻干燥，得到粗品2；(d)将步骤(c)得到的粗品2通过HPLC纯化，收集、检测、合并抑菌活性组分，冷冻干燥，即得抗生素FusaricidinA。

上述技术方案中的制备方法，首次采用牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333，以麸皮培养基作为培养介质进行发酵，并经过离心、萃取，凝胶柱分离、HPLC纯化，冷冻干燥，制备得到抗生素FusaricidinA，披露了牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333具有发酵麸皮培养基生成抗生素 FusaricidinA的新用途，拓宽了抗生素FusaricidinA的来源。同时，纯天然、廉价的麸皮培养基，令制得的抗生素FusaricidinA具有更高的使用安全性、更低的制备成本。麸皮培养基来源广泛、成本低廉、天然安全，避免使用化学合成培养基；加上发酵菌种采用牛类芽孢杆菌这一种单一菌种，上述的原料、菌种的组合，有利于产品品质的标准化与工业大规模生产的成本控制。

进一步地，步骤(a)中，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种量为 1.6x10⁶～8x10⁶cfu/mL；较佳地为3.2x10⁶～6.4x10⁶cfu/mL，更佳地为 4.8x10⁶cfu/mL。

进一步地，上述步骤(a)中，麸皮培养基包括麸皮和水，麸皮占麸皮培养基的质量百分比为2～6％。制备方法可以包括以下步骤：在蒸馏水中加入麸皮，混匀充分后，95～125℃灭菌5～20分钟，冷却即得。

进一步地，上述步骤(a)中，优选的发酵方式为振荡培养，振荡速度为100～300rpm；较佳地为150～250rpm；更佳地为200rpm。

进一步地，上述步骤(a)中，优选的发酵温度为25℃～35℃；较佳地为 28℃～32℃；更佳地为30℃。

进一步地，上述步骤(a)中，优选的发酵时间为48～96h；较佳地为60～84 小时；更佳地为72小时。

结合对比例1亦可知，在优选发酵参数的范围之外时，牛类芽孢杆菌 CGMCCNo.8333发酵麸皮培养基，再经过灭活蛋白酶、离心后得到的麸皮发酵液上清对金黄色葡萄球菌的抑菌效果明显下降了。而在优选范围之内，接种量、麸皮含量、振荡速度、发酵温度和时间相互配合，形成一个完整的优选方案，使得牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333发酵产生的抑菌活力更佳。

进一步地，上述步骤(b)中，优选的离心的速度为6,000～10,000g，较佳地为7,000～9,000g，更佳地为8,000g；优选的离心时间为10～20分钟，较佳地为13～17分钟，更佳地为15分钟。

进一步地，上述步骤(b)中，高温水浴的温度较佳地为60～80℃，更佳地为65～75℃，最优地为70℃；保温时间较佳地为10～30分钟，更佳地为 15～25分钟，最优地为20分钟。

进一步地，上述步骤(b)中，正丁醇加入量较佳地为发酵液体积的0.5～2 倍，更佳地为0.75～1.5倍，最佳地为1倍；萃取次数较佳地为3～5次，更佳地为4次；每次萃取静置的时间较佳地为8～16h，更佳地为10～14h，最佳地为12h。

进一步地，上述步骤(b)中，正丁醇的去除方法采用旋转蒸发技术或平行蒸发技术。

进一步地，上述步骤(b)中，上述的冷冻干燥为真空冷冻干燥，真空冷冻干燥条件较佳地为：板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度10～30Pa。

进一步地，上述步骤(c)中，凝胶柱为LH20凝胶柱，规格为D 2.6cm ×30cm，流动相较佳地为体积比为3：1的甲醇-水溶液；洗脱速度较佳地为 2mL/min，洗脱液的收集速度为2.5min/管。

进一步地，上述步骤(d)中，HPLC采用的色谱柱为C₁₈柱，规格为 Sunfire C₁₈柱(20mm×250mm，粒径5μm)，分离条件为：以含0.1％TFA 的水(A相)和含0.1％TFA的乙腈(B相)进行梯度洗脱，洗脱速度较佳地为4mL/min，洗脱液的收集速度为1.5min/管。

上述的步骤(a)(b)(c)(d)前后或步骤之间，在不影响本发明的核心思想的基础上本领域技术人员还可以增加其他合理的步骤，亦包括在本发明的保护范围之内。

下面通过实施例进一步说明上述具体实施方式，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集团。其他试验仪器、菌种，如未做特别说明，均可通过商业途径直接购得。

实施例1

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333(该菌株的来源请参见公开号为CN 103740618A的中国专利)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于TYC固体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，30℃好氧培养48h取出，用接种环挑取单菌落放入10mL TYC 液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30℃、180rpm振荡培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于TYC液体培养基(购买自OXOID Co.，英国)，30℃、180rpm振荡培养24h后，培养物15,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子，种子液的菌浓度为1.6x10⁸cfu/mL。

(b)麸皮培养基的制备：将质量百分比为4％的麸皮与蒸馏水充分混匀，在125℃下灭菌5min，冷却至室温，即得所需浓度的麸皮培养基。

(c)凝胶柱分离：将待分离样品(下述的粗品1)溶解于流动相(体积比为3：1的甲醇-水溶液)中配制成浓度为50mg/mL的溶液，取2mL上样于LH20凝胶柱(规格为D 2.6cm×30cm)，以2mL/min的流速进行等度洗脱，以2.5min/管的速度收集洗脱液，平行蒸发仪蒸干，向各管中加入200μL无菌水，以点种法测定各管的抑菌活性，合并抑菌活性组分，冷冻干燥。

(d)HPLC纯化：将待纯化样品(下述的粗品2)溶解于31％(V/V) 的乙腈溶液中配制成浓度为20mg/mL的溶液，取200μL上样于配备有C₁₈柱(Sunfire C₁₈柱：20mm×250mm，5μm)的半制备型HPLC，采用含0.1％TFA的水(A相)和含0.1％TFA的乙腈(B相)，以4mL/min的流速进行梯度洗脱(梯度洗脱步骤如下表1所示)，以1.5min/管的速度收集洗脱液，平行蒸发仪蒸干，向各管中加入200μL无菌水，以点种法测定各管的抑菌活性，合并抑菌活性组分，冷冻干燥。

表1梯度洗脱步骤

(e)样品抑菌活性的检测方法：点种法。待测样品溶解于无菌水中，吸取10μL滴于铺有金黄色葡萄球菌(CGMCC 1.879，购自CGMCC)作为指示菌的营养琼脂平板上，置于37℃培养24小时，观察抑菌圈的有无和大小。抑菌圈直径越大，抑菌效果越佳。

2、抗生素FusaricidinA的制备

将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量3％(v/v)无菌接种于 4％(w/w)麸皮培养基中，30℃、200rpm培养72小时得发酵液。

将发酵液8,000g离心15min取上清，置于70℃水浴保温20分钟灭活蛋白酶，待冷却后，加入1倍发酵液体积的正丁醇充分混匀，静置12小时后，8,000g离心15min取正丁醇相，重复上述萃取步骤3次，合并萃取后的正丁醇相用旋转蒸发仪除去正丁醇，加入少量蒸馏水溶解完全后，冷冻干燥得到粗品1。

将粗品1先进行LH20凝胶柱分离，分离效果如图1所示，点种检测抑菌活性的效果如图2所示，图2中培养皿的19～24标注的6块区域依次分别对应了LH20凝胶柱分离洗脱下来的管号19～24，不同管中的洗脱液被取出少量用于点种法滴在平板上进行抑菌活性检测。合并19～24管内的活性组分得到粗品2，再经HPLC纯化(纯化效果如图3所示)，发现保留时间在21.2 min的组分具有抑菌活性，收集该组分，即得抗生素FusaricidinA。

3、抗生素FusaricidinA结构的确定

将上述HPLC纯化后的抑菌活性组分进行ESI-MS分析，结果如图4所示，该活性组分的质荷比为883.5578，换算后，该组分的分子量为882Da，与抗生素FusaricidinA(LI-F04a)相同。

为进一步确认本专利中抑菌物质的结构，继续对该组分进行了二级质谱分析，结果如图5所示，活性组分有一个稳定的离子峰m/z 256.2715，与抗生素FusaricidinA(LI-F04a)特征结构GHPD的离子峰相同；此外，离子峰m/z 698-597-498-399-297分别代表Thr-Val-Val-Thr，m/z 72则是Ala氨基酸残基的离子峰，这些离子峰均与抗生素FusaricidinA(LI-F04a)高度一致。

综上所述，通过上述的制备方法所制得的抑菌活性物质是抗生素FusaricidinA。

实施例2

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。

(b)麸皮培养基的制备：将质量百分比为6％的麸皮与蒸馏水充分混匀，在95℃下灭菌20min，冷却至室温，即得所需浓度的麸皮培养基。

(c)凝胶柱分离、HPLC纯化及样品抑菌活性的检测方法：同实施例1。

2、抗生素FusaricidinA的制备

将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量1％(v/v)无菌接种于 6％(w/w)麸皮培养基中，35℃、100rpm培养96小时得发酵液。

将发酵液10,000g离心10min取上清，置于80℃水浴保温10分钟灭活蛋白酶，待冷却后，加入0.5倍发酵液体积的正丁醇充分混匀，静置16小时后，10,000g离心10min取正丁醇相，重复上述萃取步骤5次，合并萃取后的正丁醇相用旋转蒸发仪除去正丁醇，加入少量蒸馏水溶解完全后，冷冻干燥得到粗品1。

进一步的LH20凝胶柱分离、HPLC纯化步骤与实施例1相同，制得抗生素FusaricidinA。

3、抗生素FusaricidinA结构的确定方法：同实施例1。

实施例3

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。

(b)麸皮培养基的制备：将质量百分比为2％的麸皮与蒸馏水充分混匀，在100℃下灭菌15min，冷却至室温，即得所需浓度的麸皮培养基。

2、抗生素FusaricidinA的制备

将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量5％(v/v)无菌接种于2％(w/w)麸皮培养基中，25℃、300rpm培养48小时得发酵液。

将发酵液6,000g离心20min取上清，置于60℃水浴保温30分钟灭活蛋白酶，待冷却后，加入2倍发酵液体积的正丁醇充分混匀，静置8小时后， 6,000g离心20min取正丁醇相，重复上述萃取步骤3次，合并萃取后的正丁醇相用旋转蒸发仪除去正丁醇，加入少量蒸馏水溶解完全后，冷冻干燥得到粗品1。

3、抗生素FusaricidinA结构的确定方法：同实施例1。

实施例4

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。

(b)麸皮培养基的制备：将质量百分比为5％的麸皮与蒸馏水充分混匀，在120℃下灭菌10min，冷却至室温，即得所需浓度的麸皮培养基。

2、抗生素FusaricidinA的制备

将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量2％(v/v)无菌接种于 5％(w/w)麸皮培养基中，32℃、150rpm培养84小时得发酵液。

将发酵液9,000g离心13min取上清，置于65℃水浴保温25分钟灭活蛋白酶，待冷却后，加入1.5倍发酵液体积的正丁醇充分混匀，静置14小时后，9,000g离心13min取正丁醇相，重复上述萃取步骤5次，合并萃取后的正丁醇相用旋转蒸发仪除去正丁醇，加入少量蒸馏水溶解完全后，冷冻干燥得到粗品1。

3、抗生素FusaricidinA结构的确定方法：同实施例1。

实施例

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。

(b)麸皮培养基的制备：将质量百分比为3％的麸皮与蒸馏水充分混匀，在110℃下灭菌12min，冷却至室温，即得所需浓度的麸皮培养基。

2、抗生素FusaricidinA的制备

将牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333种子以接种量4％(v/v)无菌接种于 3％(w/w)麸皮培养基中，28℃、250rpm培养60小时得发酵液。

将发酵液7,000g离心17min取上清，置于75℃水浴保温15分钟灭活蛋白酶，待冷却后，加入0.75倍发酵液体积的正丁醇充分混匀，静置10小时后，7,000g离心17min取正丁醇相，重复上述萃取步骤4次，合并萃取后的正丁醇相用旋转蒸发仪除去正丁醇，加入少量蒸馏水溶解完全后，冷冻干燥得到粗品1。

3、抗生素FusaricidinA结构的确定方法：同实施例1。

对比例1

将实施例1中的接种量，麸皮含量，发酵温度，发酵时间以及发酵振荡的速度逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的麸皮发酵液，将各组所得发酵液上清pH调节至7.0后，取100μL加入铺有金黄色葡萄球菌作为指示菌的营养琼脂平板上的牛津杯中，置于37℃培养24小时，观察抑菌圈大小，结果如表2所示。

表2不同方法制备所得麸皮发酵液上清对金黄色葡萄球菌的抑制效果

上述方法同样被用于测定实施例1～5所述方法制备的麸皮发酵液上清，其抑菌效果如表3所示。

表3实施例1～5制备的麸皮发酵液上清对金黄色葡萄球菌的抑制效果

参照表3所示的结果，在表2所示的结果中可以得出，将所述抗生素 FusaricidinA的制备方法中接种量，麸皮含量，培养温度，发酵时间以及发酵振荡的速度调整到优选范围之外的时候，牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333 依然可以发酵麸皮产生抗生素FusaricidinA，但是其产率明显下降。

对比例2

参考实施例1的方法，比较由牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333、干酪乳杆菌(L.casei)ATCC 393(购买自ATCC)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus) LB340(由丹尼斯科公司提供)、嗜热链球菌(S.thermophilus)ST-BODY-3(由科.汉森公司提供)制备的麸皮发酵液上清对金黄色葡萄球菌的抑制效果，具体操作如下：

1、材料与方法

(a)种子(发酵菌种)的制备：

干酪乳杆菌和保加利亚乳杆菌种子的制备：将干酪乳杆菌ATCC 393和保加利亚乳杆菌LB340的冻干粉分别用少量无菌蒸馏水溶解，各自用接种环取一环划线于MRS固体培养基(购买自Merck Co.德国)上，37℃厌氧培养 24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL MRS液体(购买自Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h 取出，以2％(v/v)接种量接种于50mLMRS液体，37℃培养24h后，培养物 9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到相应的发酵用的种子。

嗜热链球菌种子的制备：将嗜热链球菌ST-BODY-3的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于M17固体培养基(购买自Merck Co. 德国)上，40℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL M17液体(购买自Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，40℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mLM17液体，40℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。

(b)麸皮培养基的制备：同实施例1。

2、麸皮发酵液上清的制备

将各菌株以3％(v/v)接种量无菌接种于4％(w/w)麸皮培养基中，分别培养(保加利亚乳杆菌和干酪乳杆菌37℃厌氧培养，嗜热链球菌40℃厌氧培养，牛类芽孢杆菌30℃、200rpm振荡培养)72h，获得相应的麸皮发酵液。

将上述发酵液按照实施例1中所述方法进行灭活蛋白酶，离心，制备得到麸皮发酵液上清。

3、抑菌活性的测定

将不同菌株所得发酵液上清pH调节至7.0后，取100μL加入铺有金黄色葡萄球菌作为指示菌的营养琼脂平板上的牛津杯中，置于37℃培养24小时，观察抑菌圈大小，结果如表4示：

表4不同菌株制备的麸皮发酵液上清的抑菌效果

由表4可知，其他常规发酵菌株不具有发酵麸皮培养基产生抗生素的能力，而牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333可以发酵麸皮培养基，最后得到抗生素FusaricidinA，对金黄色葡萄球菌的抑制活性非常显著。

以上对本发明所提供的抗生素FusaricidinA的制备方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种抗生素FusaricidinA的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)将牛类芽孢杆菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接种于麸皮培养基中进行发酵，得到发酵液；

(b)将步骤(a)得到的发酵液离心取上清，置于高温水浴中灭活蛋白酶，待冷却后，加入正丁醇萃取，离心取正丁醇相，除去正丁醇，加水溶解，冷冻干燥，得到粗品1；其中所述高温水浴的温度为60～80℃，保温时间为10～30分钟；

(c)将步骤(b)得到的粗品1通过凝胶柱分离，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到粗品2；

(d)将步骤(c)得到的粗品2通过HPLC纯化，收集抑菌活性组分，冷冻干燥，得到抗生素FusaricidinA；

其中，在步骤(c)中所述的凝胶柱为LH20凝胶柱，规格为D 2.6cm×30cm；分离条件包括：以体积比为3：1的甲醇-水溶液进行等度洗脱，洗脱速度为2mL/min，洗脱液的收集速度为2.5min/管；

在步骤(d)中，所述的HPLC采用的色谱柱为C₁₈柱，规格为Sunfire C₁₈柱，20mm×250mm，粒径5μm；分离条件包括：以含0.1％TFA的水作为A相、含0.1％TFA的乙腈作为B相，进行梯度洗脱，洗脱速度为4mL/min，洗脱液的收集速度为1.5min/管；收集保留时间在21.2min的组分。

2.根据权利要求1所述的抗生素FusaricidinA的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述牛类芽孢杆菌CGMCC No.8333的接种量为1.6x10⁶～8x10⁶cfu/mL。

3.根据权利要求1所述的抗生素FusaricidinA的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述麸皮培养基包括麸皮和水，麸皮占麸皮培养基的质量百分比为2～6％。

4.根据权利要求1所述的抗生素FusaricidinA的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述发酵为振荡培养，振荡速度为100～300rpm；所述发酵的温度为25℃～35℃；所述发酵的时间为48～96h。

5.根据权利要求1所述的抗生素FusaricidinA的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，所述离心的速度为6,000～10,000g，离心的时间为10～20分钟。

6.根据权利要求1所述的抗生素FusaricidinA的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，正丁醇萃取时，正丁醇加入量为发酵液体积的0.5～2倍，萃取次数为3～5次，每次萃取静置的时间为8～16h。