BRPI0514200B1 - Composição compreendendo esporos de paenibacillus, controlador de doença em plantas, e método de controlar doenças em plantas - Google Patents

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BRPI0514200B1
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Shinishiro Kochi
Tsukasa Fujimaki
Yoshinori Kanai
Katsuyuki Futamata
Yuzo Kioka
Katsunori Noguchi
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Kaken Pharma Co Ltd
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Description

“COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO ESPOROS DE PAENIBACILLUS, CONTROLADOR DE DOENÇA EM PLANTAS, E MÉTODO DE CONTROLAR DOENÇAS EM PLANTAS” CAMPO TÉCNICO A presente invenção se refere a novas cepas que pertencem ao gênero Paenibacillus e o controle de doenças em plantas utilizando essas cepas ou suas culturas. Mais particularmente, a presente invenção se refere a cepas que pertencem ao gênero Paenibacillus as quais podem exibir efeitos no controle de doenças em plantas exibindo uma atividade de induzir resistência à doença em plantas pela a produção de uma substância capaz de induzir resistência à doença em plantas, e mais especificamente, ela se refere a novas cepas que pertencem ao gênero Paenibacillus, tais como Paenibacillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. BS-0074, Paenibacillus polimyxa BS-0105, Paenibacillus sp. BS-0277, etc; o controle das doenças em plantas usando essas cepas que pertencem ao gênero Paenibacillus; e o controle de doenças em plantas utilizando a nova atividade de induzir resistência à doença em plantas de compostos obtidos de culturas dessas cepas que pertencem ao gênero Paenibacillus.
FUNDAMENTO DA TÉCNICA
No campo da agricultura, a ocorrência de cada doença em plantas provoca uma diminuição marcante nos campos das colheitas e então o controle das doenças em plantas é um meio indispensável para técnicas agrícolas. Como meio para controlar as doenças, existe, por exemplo, o controle do meio-ambiente para cultivo, o crescimento do cultivo resistente à doença, o controle das doenças pela aplicação de bactericidas ou fungicidas de horticultura e agrícolas, e o controle biológico das doenças pelo uso de materiais orgânicos ou o semelhante. Desses, o controle usando bactericidas ou fungicidas de horticultura e agrícola é direto e o mais eficaz. Entretanto, a grande dependência em um meio que compreende controle direto das doenças pela aplicação de uma grande quantidade dos fungicidas ou bactericidas é claramente indesejável por causa dos problemas tais como poluição ambiental e influências ern coisas vivas do meio-ambiente.
Em tal uma situação, bactericidas ou fungicidas de horticultura e agrícolas têm sido desenvolvidos os quais são especificamente eficazes contra bactérias e fungos patogênicos, respectivamente, e têm uma ação bacteriana ou fungicida muito boa do ponto de vista de toxicidade seletiva. Tais produtos químicos, entretanto, são desvantajosos em que des tendem a fazer com que o produto químico seja tolerante às bactérias ou fungos patogênicos. Quanto a medida de defesa contra esse problema, uma pluralidade de produtos químicos diferentes em ação são aplicados como uma mistura dos mesmos ou em rotação.
De modo a resolver o problema de dependência excessiva em tal uns agentes agroquímicos químicos, métodos para controlar várias doenças ern plantas de cultivo ou insetos-praga utilizando microorganismos ou inimigos naturais, os quais estão geral mente presentes no mundo natural, tem sido colocado em prática nos últimos anos e um sistema de controle tem sido melhorado. Por exemplo, documento de patente 1 tem proposto que células de um microorganismo tais como Bacillus subtílis FR-2, Bacillus polymyxa KT-8 ou o semelhante deveríam ser usadas como um controlador para infecção com fungos em plantas. A eficácia e tipo de tal um controlador não são ainda suficientes e um controlador biológico superior é necessário.
De modo a resolver o problema da aparência das bactérias e fungos resistentes ao produtos químicos, é considerado o mais eficaz utilizar uma substância ou um microorganismo, o qual pode induzir resistência à doença em plantas.
Embora um certo número de substâncias capazes de induzir resistência à doença em plantas, tal corno ácido salicílico tem sido sabido até agora, somente alguns deles, tais como S-metila, l,2,3-benzotiazol-7- carboxilato (nome comum: Acibenzolar-S-metila) (documento não patenteado 1 e documento não patenteado 2) e 3-(2-propilenóxi)-l,2-benzisotiazol-l,l-dióxido (nome comum: Probenazol) (documento não patenteado 3) são atualmente usados como produtos químicos para controlar doenças em plantas. Desse modo, tais substâncias não são satisfatórias.
Documento de patente 2 descreve a fornecimento de resistência à doenças para plantas pelo uso de bactérias capazes de induzir resistência à doença em plantas e um condicionador de solo orgânico. Esse método, entretanto, não é satisfatório.
Por outro lado, documento de patente 3 tem relatado que uma substância antimicrobialmente ativa KT-6291A (Fusaricidin A) produzida por Bacillus sp. KB-291 controla várias doenças em plantas. Entretanto, tem sido revelado que a substância antimicrobialmente ativa KT-6291A descrita no documento de patente 3 é inativa não somente contra manchas bacterianas do pepino, uma bactéria Gram-negativa mas também contra outras bactérias Gram-negativas Documento de patente 3 não descreve um método para controlar doenças em plantas provocadas por bactérias Gram-negativas. Além disso, tem sido revelado que a substância KT-629A não tem atividade antimicrobiana contra murcha do Fusarium de fungos do pepino, uma cepa que pertence ao gênero Fusarium. Documento de patente 3 descreve outras substâncias tendo atividade antimicrobiana contra vários microorganismos, mas não conferem qualquer informação com relação a atividade de induzir resistência à doença em plantas.
Semelhantemente, documento não patenteado 4 revela que uma substância antimicrobialmente ativa Fusaricidin A é produzida por Bacillus polymyxa KT-8, mas que essa substância é inativa contra bactérias Gram-negativas.
Além disso, documento não patenteado 5 revela que Fusaricidin B e o semelhante são produzidas juntas com Fusaricidin A por Bacíllus polymyxa KT-8, mas que essas substâncias são também inativas contra bactérias Gram-negativas.
Documento de patente 1: JP-A-ó-253827 Documento de patente 2: JP-T2003-529539 Documento de patente 3: JP-A-2-275898 Documento não patenteado l: Plant PhisioL 117, p. 1333-1339 (1998) Documento não patenteado 2: Brigliton crop protection conference - pest & diseases - 1996, 8A-4, CGA2455704.
Documento não patenteado 3: Annu, Rer. Phytopathol. 32, p. 439-59 (1994).
Documento não patenteado 4: The Journal of Antibiotícs vol.49, n° 2, p. 129 a 135 (1996).
Documento não patenteado 5: The Journal of Antibiotícs vol. 50 n°3, p. 220 a 228 (1997). REVELAÇÃO DA INVENÇÃO Problema a ser resolvido nela invenção Portanto, um problema para a presente invenção é fornecer uma cepa que pertence ao gênero Paenibaeillus a qual possa exibir uma atividade de induzir resistência à doença em plantas, e, além disso, forneça uma substância capaz de induzir resistência à doença em plantas.
Outro problema para a presente invenção é fornecer um controlador para doenças em plantas e um método para controlar doenças em plantas, o qual utilize a cepa ou substância acima mencionada.
Meios para resolver os problemas Em vista da situação descrita acima, os presentes inventores seriamente investigaram de modo a revelar um método superior para controlar doenças em plantas, e consequentemente revelaram que algumas bactérias, a quais pertencem ao gênero Bacillus quando identificadas por um teste morfológico e físico-caracterológico em cepas e pertencem ao gênero Paenibacillus quando identificadas pela análise da seqüência de nucleotídeo de 16 S rDNA, têm bom efeito no controle de doenças em plantas. Além disso, se tomou claro que compostos tendo uma atividade de induzir resistência à doença em plantas estão presentes em culturas de algumas bactérias acima mencionadas pertencentes ao gênero Bacillus ou Paenibacillus. Com base nessas revelações, a presente invenção têm sido efetuada.
Desse modo, a presente invenção se refere a novas cepas que pertencem ao gênero Paenibacillus as quais tem efeito no controle de doenças em plantas.
Além disso, a presente invenção se refere a cepas que pertencem ao gênero Paenibacillus as quais podem exibir efeito no controle de doenças em plantas exibindo uma atividade de induzir resistência à doença em plantas pela produção de uma substância capaz de induzir resistência à doença em plantas.
Além disso, a presente invenção se refere a uma composição contendo a cepa acima mencionada acima que pertence ao gênero Paenibacillus.
Ainda, a presente invenção se refere a uma composição contendo uma ou uma combinação de duas ou mais das substâncias capazes de induzir resistência à doença em plantas as quais são obtidas de uma cultura da cepa acima mencionada que pertence ao gênero Paenibacillus.
Ainda, a presente invenção se refere a um controlador para doenças em plantas que compreende a composição acima mencionada.
Ainda, a presente invenção se refere a um controlador para doenças em plantas que contém pelo menos um composto selecionado de composto 1 (Fusaricidin A), composto 2 (Fusaricidin B), composto 3 e composto 4 os quais têm as estruturas a seguir: [Fórmula lj Composto 1 (Fusaricidiii A) [Fórmula 2] Composto 2 (Fusariddin B) [Fórmula 3] Composto 3 [Fórmula 4] Composto 4 Ainda, a presente invenção se refere a um método para controlar doenças em plantas caracterizado por proteger plantas de infecções com patógenos de plantas pela aplicação da cepa acima mencionada que pertence ao gênero Paenibacillus, composição ou controlador para doenças em plantas para as plantas.
Ainda, a presente invenção se refere a novos compostos 3 e 4 tendo as fórmulas estruturais acima.
No presente pedido, o termo “cepa que pertence ao gênero Paenibacillus” significa uma cepa que pertence ao gênero Bacillus quando identificada por um. teste morfológico e físieo-caracterológico na cepa e pertence ao gênero Paenibacillus quando identificada pela auãlise da sequência base de 16S rDNA.
Vantagens da Invenção As cepas que pertencem ao gênero Paenibacillus da presente podem controlar doenças em plantas provocadas por bactérias Gram-negativas (por exemplo, cepas que pertencem ao gênero Pseudomonas) e cepas que pertencem ao gênero Fusarium que exibem unia atividade de induzir resistência à doença em plantas.
Além disso, os novos microorganismos revelados na presente invenção, Paenibacillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. Bs-0074, Paenibacillus polymyxa BS-Ü105 e Paenibacillus sp. BS-0277 podem controlar as doenças em plantas que pertencem ao gênero Fusarium e além disso, podem controlar doenças em plantas provocadas por fungos patogênicos em plantas comuns, por exemplo, vários fungos patogênicos tais como cepas que pertencem ao gênero Colletotrichum e cepas que pertencem ao gênero Glomerella. Aqui, por exemplo, o termo “Paenibacillus sp, BS-0048” significa uma e a mesma cepa qual pode ser chamada de Bacillus sp. BS-0048 quando identificada por um teste morfológico e físico-caracterológico na cepa e pode ser chamado de Paenibacillus sp. BS-0048 quando identificada pela análise da seqíiência base de 16S rDNA. O termo “Paenibadllus polymyxa BS-0105” significa uma e a mesma cepa a qual pode ser chamada de Bacillus sp* BS-105 que pertence ao gênero Bacillus, quando identificada por um teste ntorfológico e físico-caracterológico na cepa e pode ser chamada Paenibadllus polymyxa BS-01Ü5 que pertence as espécies polymyxa do gênero Paenibacillus, quando identificadas pela análise da sequência base de 16 S rDNA, Além disso, composto I (Fusaricidin A), composto 2 (Fusaricidin B), composto 3 e composto 3 e composto 4, os quais são produzidos por cepas que pertencem ao gênero Paenibacillus, têm uma atividade de induzir resistência à doença em plantas e então têm uma capacidade de proteger plantas de infecções com patógenos de plantas, de forma que eles são eficazes em controlar as doenças em plantas.
BREVE DESCRICÂO DOS DESENHOS
Figura 1. Um espectro de ressonância magnética nuclear de próton (DMSO-d6) do novo composto 3 da presente invenção.
Figura 2, Um espectro de ressonância magnética nuclear de próton (DMSO-d6) do novo composto 4 da presente invenção.
MELHOR FORMA DE EXECUTAR A INVENÇÃO
Pela presente invenção, são fornecidas novas cepas do gênero Paenibacillus tendo efeito no controle de doenças em plantas, e são fornecidas cepas do gênero Paenibacillus as quais podem exibir efeito no controle de doenças em plantas que exibem uma atividade de induzir resistência à doença em plantas pela produção de uma substância capaz de induzir resistência à doença em plantas. Como a substância c capaz de induzir resistência à doença em plantas de acordo com a presente invenção, o composto 1 (Fusaricidin A), composto 2 (Fusaricidin B), composto 3 e composto 4 acima mencionados s ão e xempl i ficados. O termo “atividade de induzir resistência à doença em plantas” usado aqui significa uma atividade de fornecer “resistência à doença induzida” assim chamada contra a plantas. Cepas que pertencem ao gênero Paenibacillus e capazes de produzir uma substância tendo tal uma atividade, e substâncias capazes de induzir resistência à doenças em plantas, tais como composto 1 (Fusaricidin A), composto 2 (Fusaricidin B), composto 3, e composto 4, podem proteger plantas de infecções com patógenos da plantas. Portanto, eles protegem as plantas de infecções com os patógenos da plantas que exibem a atividade de induzir resistência à doença em plantas sem exibição de atividade antimicrobiana direta, de modo que eles podem controlar as doenças em plantas.
Exemplos específicos de tais cepas que pertencem ao gênero Paenibacillus são as novas cepas Paenibacillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. Bs-0074, Paenibacillus polymyxa BS-0105 e Paenibacillus sp. BS-0277 reveladas pela presente invenção e seus variantes. Como o variante, qualquer variante pode ser usado contanto que ele possa ser induzido, por exemplo, por mutação espontânea, uma causa física (por exemplo, raios ultra-violetas) ou um mutagênico químico (por exemplo, um composto base), e pode exibir um efeito no controle de doenças em plantas exibindo a função desejada pela presente invenção, isto é, uma atividade de induzir resistência à doença em plantas pela produção de uma substância capaz de induzir resistência à doença em plantas, por exemplo, pelo menos um composto selecionado do composto 1 (Fusaricidin A), composto 2 (Fusaricidin B), composto 3 e composto 4.
Como as cepas do gênero Paenibacillus usadas na presente invenção, podem ser usadas ainda cepas as quais são ditas pertencerem ao gênero Bacillus quando identificadas por um teste morfológico e físico-caracterológico nas cepas, contanto que elas pertençam ao gênero Paenibacillus quando identificadas pela análise da seqüência base de 16S rDNA.
As cepas que pertencem ao gênero Paenibacillus da presente invenção podem controlar doenças em plantas provocadas pelas bactérias Gram-negativas e cepas que pertencem ao gênero Fusarium, exibindo uma atividade de induzir resistência à doença em plantas pela a produção de uma substância capaz de induzir resistência à doença em plantas. Além disso, tal uma substância capaz de induzir resistência à doença em plantas, tais como os composto 1 (Fusaricidin A), composto 2 (Fusaricidin B), composto 3 e composto 4 acima mencionados podem também controlar nas mesmas as doenças em plantas provocadas pela bactérias Gram-negativas e cepas que pertencem ao gênero Fusarium, exibindo a atividade de induzir resistência à doença em plantas.
Como as doenças em plantas provocadas por bactérias Gram-negativas, doenças em plantas provocadas por cepas que pertencem ao gênero Pseudomonas são exemplificadas. Exemplos específicos das doenças em plantas são crestamento bacteriano de plantas da Cucurbitaceae, tais como crestamento bacteriano (Pseudomonas syringae pv. lachrymans) de melão e pepino, e podridão negra da bainha (Pseudomonas fuscovaginae) do arroz. Como as doenças em plantas provocadas pelas cepas que pertencem ao gênero Fusarium, são exemplificados escara (Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum) de cevada, trigo, aveia e centeio, murcha de Fusarium (Fusarium oxysporum f. sp. ucumerium) de pepino, murcha de Fusarium (Fusarium oxysporum f. sp. melonis) de melão, e murcha de Fusarium (Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici) do tomate.
Cepas que pertencem ao gênero Paenibacillus da presente invenção, tais como novas cepas Paenibacillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. Bs-0074, Paenibacillus polymyxa BS-0105 e Paenibacillus sp. BS-0277 podem controlar as doenças em plantas acima exemplificadas provocadas por bactérias Gram-negativas e cepas que pertencem ao gênero Fusarium, e além disso, elas podem controlar doenças em plantas provocadas por fungos patogênicos em plantas comuns, por exemplo, vários fungos patogênicos tais como cepas que pertencem ao gênero Colletotrichum e cepas que pertencem ao gênero Glomerella. As doenças em plantas provocadas pelas cepas que pertencem ao gênero Colletotrichum incluem, por exemplo, antracnose de plantas da Cucurbitaceae, tais como antracnose (Colletotrichum orbiculare) de pepino, e antracnose (Colletotrichum acutatum) do morango. As doenças em plantas provocadas pelas cepas que pertencem ao gênero Glomerella incluem, por exemplo, podridão madura (Glomerella cingulata) da uva e antracnose (Glomerela cingulata) do morango.
As cepas que pertencem ao gênero Paenibacillus da presente invenção são eficazes também contra doenças em plantas outras que doenças em plantas acima exemplificadas, tais como mofo cinzento (Botrytis cinerea) e podridão do caule (Sclerotinia sclerotiorum) de várias plantas de cultivo; mangra (Pyricularia oryzae), queima da bainha (Thanatephorus cucumeris) e mancha aerolada de Helminthosporium (Cochliobolus miyabeanus) de arroz; escara (Venturia inaequalis), mancha aerolada Alternaria (Alternaria mali) e cancro (Valsa ceratosperma) de maçã; mancha preta (Alternaria kikuchiana) e escara (Venturia nashicola) de pêra; melanose (Diaporthe citri), mofo azul (Penicillium italicum) e cancro (Xanthomonas campestris pv. citri) cítrico; podridão de Phomopsis (Phomopsis sp.) e podridão negra (Monilinia fructicola) de pêra; antracnose (Gloeosporium kaki) e mancha da folha angular (Cercospora kaki) de caqui japonês; míldio pulverulento (Erysiphe graminis), ferrugem (Puccinia garminis, P. striformis, P. recôndita), carvão (Ustilago nuda) e escara (Gibberella zeae, Monographella nivalis) de cevada, trigo, aveia e centeio; míldio pulverulento (Sphaerotheca cucurbitae), crestamento gomoso do caule (Didymella bryoniae) e míldio (Pseudiperonospora cubensis) de pepino; mofo de folha (Fulvia fulva) de tomate; murcha de Verticillium (Verticillium dahliae), podridão negra (Phytophthora capsici) e murcha bacteriana (Ralstonia solanacearum) da berinjela; mancha negra (Alternaria altemata) de tabaco; mancha da folha (Cercospora beticola) da beterraba, requeima (Phytophthora infestans) de batata; mancha púrpura (Cercospora kikuchii) de soja; míldio (Pemospora brassicae) do rabanete japonês; míldio (Pemospora spinaciae) de espinafre; crestamento bacteriano (Xanthomonas campestris pv. vitians) e podridão mole bacteriana (Erwinia carotovora subsp. carotovora) da alface; podridão negra ((Xanthomonas campestris pv. campestris) do repolho; raiz do clube (Plasmodiophora brassicae) de vegetais de cmcífera; queima foliar (Pythium sp) de várias plantas de colheita; podridão radicular violeta (Helicobasidium mompa) de árvores frutíferas; remendo largo (Rhizoctonia solani) e queima foliar Curvalaria (Curvalaria sp.) de grama do campo, etc.
Além disso, as cepas que pertencem ao gênero Paenibacillus da presente invenção e as substâncias capazes de induzir resistência à doença em plantas de acordo com a presente invenção, tais como composto 1 (Fusaricidin A), composto 2 (Fusaricidin B), composto e 3 composto 4 acima mencionados exibem nas mesmas uma atividade de induzir resistência à doença em plantas e então protegem plantas de infecções com patógenos da plantas, de modo que eles podem controlar as doenças em plantas. Como patógenos em plantas, não somente os vários fungos e bactérias exemplificados acima, mas também vírus podem ser exemplificados.
Como os fungos, são exemplificados fungos capazes de provocar as seguintes doenças em plantas: mofo cinza (Botrytis cienrea) e podridão do caule (Sclerotinia scletrotiorum) de várias plantas de cultivo; mangra (Pyricularia oryzae); queima da bainha (Thanatephorus cucumeris) e mancha da folha Helminthosporium (Cochiobolus miyabeanus) do arroz; escara (Venturia inaequalis); mancha da folha Alternaria (Alternaria mali) e cancro (Valsa ceratosperma) da maça; mancha preta (Alternaria kikuchiana) e escara (Venturia nashicola) da pêra; melanose (Diaporthe citri) e mofo azul (Penicillum italicum) de cítricos; podridão Phomposis (Phomposis sp.) e podridão negra (Monilinia fructicola) da pêra; antracnose (Gloresporium kaki) e mancha da folha angular (Cercospora kaki) de caqui japonês; podridão madura (Glomerella cingulata) da uva; míldio pulverizado (Erysiphe graminis), ferrugem (Puccinia graminis, P. striformis, P. recôndita), carvão (Ustilago nuda) e escara (Monographella nivalis) de cevada, trigo, aveias e centeio; míldio pulverizado (Sphaerotheca cucurbitae); crestamento gomoso do caule (Didymella bryniae), antracnose (Collectotrichum orbiculare) e míldio (Pseudoperonospora cubensis) de pepino; mofo da folha (Fulvia fulva) do tomate; murcha Certicillium (Certicillium dahliae) e podridão negra (Phytophthora capsici) da berinjela; antracnose (Collectorichum acutatum, Glomerella cingulata) do morango; mancha negra (Alternaria altemata) de tabaco; mancha da folha (Cercospora beticola) da beterraba; requeima (Phytophtora infestans) de batata; mancha púrpura (Cercospora kikuchii) da soja; míldio (Pemospora brassicae) do rabanete japonês; míldio (Pemospora spinaciae) do espinafre; raiz do clube (Plasmodiophora brassicae) de vegetais de crucifera; queima foliar (Pythium sp) de várias plantas de colheita; podridão de raiz violeta (Helicobasidium mompa) de arvores frutíferas; remendo largo (Rhizoctonia solani) e queima foliar Curvularia (Curvularia sp.) de gramado do campo, etc.
Além dos fungos exemplificados acima, como as bactérias, são exemplificadas bactérias capazes de provocar as seguintes doenças em plantas: cancro (Xantomononas campestris pv. citri) de cítrico; murcha bacteriana (Rasltonia solanacearum) da berinjela; crestamento bacteriano (Xanthomonas campestris pv. vitians) e podridão mole bacteriana (Erwinia carotovora subsp. carotovora) da alface; e podridão negra (Xanthomonas campestris pv. campestris) do repolho.
Como os vírus, são exemplificados vírus capazes de provocar as seguintes doenças em plantas: mosaicos do pepino (cucmovírus do mosaico do pepino, potivírus do mosaico 2 da melancia, potivírus do mosaico amarelo zucchini), doenças virais do tomate (necrovírus da necrose do tabaco), doenças virais do morango (citorhabdovírus do encrespamento do morango, vírus C latente do morango, luteovírus da soja nanica, vírus do mosqueado do morango, carlavírus da clorose marginal do morango, caulimovírus da faixa de nervuras do morango, tobamovírus do mosaicos do tabaco, necrovírus da necrose do tabaco), mosaico do repolho (caulimovírus do mosaico da couve-flor, cucumovírus do mosaico do pepino, porivírus do mosaico do nabo), doenças virais da soja (sobemovírus do mosaico do feijoreiro do sul, cucumovírus do nanismo do amendoim, porivírus do mosaico comum do feijoeiro, fabavírus da murcha do feijoeiro) e enrolamento da folha da batata (luteovírus de enrolamento da folha da batata).
Quando a cepa do gênero Paenibacillus da presente invenção é usada para controlar doenças em plantas, esporos, células vegetais, cultura total ou o semelhante da cepa do gênero Paenibacillus podem ser usualmente usadas. Elas podem ser preparadas de uma cultura obtida cultivando a cepa do gênero Paenibacillus por um método convencional. A cultura total obtida pode ser preparada em pó da cultura total, por exemplo, congelando a seco a cultura total como ela está. As células vegetativas podem ser preparadas como um precipitado da célula, por exemplo, centrifugando a cultura total após o cultivo para remover contaminantes, ainda centrifugando o sobrenadante resultante, e então lavando as células precipitadas. Além disso, os esporos podem ser preparados como pó do esporo congelado a seco, por exemplo, suspendendo o precipitado da célula obtido acima em água destilada e congelando a seco a suspensão resultante.
Embora a cepa do gênero Paenibacillus usada na presente invenção seja usualmente células viáveis, ela pode ser células mortas por tratamento térmico ou o semelhante. As células viáveis referidas aqui incluem, como descritas acima, células viáveis obtidas da cultura, células secas obtidas de células viáveis, células separadas da cultura por um método convencional tais como filtração, centrifugação ou o semelhante, e células secas após separação e coleta.
As cepas que pertencem ao gênero Paenibacillus, tais como Paenibacillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. Bs-0074, Paenibacillus polymyxa BS-0105 e Paenibacillus sp. BS-0277, etc, são cultivadas por um método de cultivo convencional para bactérias comuns. Elas podem ser cultivadas em qualquer método imaginável tais como cultura sólida ou cultura líquida (por exemplo, cultura com agitação em tubo de teste, cultura com agitação recíproca, cultura com agitação rotativa, cultura com fermentação ou cultura em tanque). Como um meio de cultura, uma combinação própria de várias fontes de carbono, fontes de nitrogênio, sais orgânicos e sais inorgânicos pode ser usada. Em geral, as fontes de carbono incluem, por exemplo, glicose, amido, glicerol, dextrina, sacarose, e óleos animais e vegetais. As fontes de nitrogênio orgânico incluem, por exemplo, extrato de levedura, farinha de soja, água de maceração do milho, germe de trigo, extrato de carne e peptona. As fontes de nitrogênio inorgânico incluem, por exemplo, nitrato de sódio, nitrato de amônio, sulfato de amônio e acetato de amônio. Os sais orgânicos e sais inorgânicos incluem, por exemplo, acetatos tais como acetato de sódio, etc; carbonatos tais como carbonato de cálcio, carbonato de sódio, etc; cloretos tais como cloreto de sódio, cloreto de potássio, etc., fosfatos tais como di-hidrogeno fosfato de potássio, hidrogeno fosfato de dissódio, etc.; e sulfatos tais como sulfato ferroso, sulfato de zinco, sulfato de cobre, etc. Embora a temperatura de cultivo possa ser propriamente variada contanto que os microorganismos possam crescer, ela preferivelmente está na faixa de 20°C a 40°C. Usualmente, o cultivo é realizado sob condições aeróbicas. Particularmente quando realizada em um fermentador ou um tanque de cultura, o cultivo é realizado enquanto que introduz ar estéril. Um método e condições para o cultivo não são particularmente limitados contanto que o microorganismo possa crescer.
Composto 1 (Fusaricidin A) e composto 2 (Fusaricidin B), os quais são usados na presente invenção como uma substância capaz de induzir resistência à doença em plantas, podem ser obtidos de uma cultura da nova cepa do gênero Paenibacillus (por exemplo, Paenibacillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. Bs-0074, Paenibacillus polymyxa BS-0105 e Paenibacillus sp. BS-0277) reveladas pela presente invenção, ou uma cepa do gênero Bacillus, tais como Bacillus sp. KB-291 (JP-A-2-275898) ou Bacillus polymyxa KT-8 (The Journal of Antibiotic vol. 49, n° 2, p. 129-135 (1996); The Journal of Antibiotics vol. 50, n° 3, p. 220-228 (1997) os quais são conhecidos por produzir os compostos acima mencionados. Composto 3 e composto 4 podem ser obtidos de uma cultura da nova cepa acima mencionada do gênero Paenibacillus revelada pela presente invenção. Especificamente, tal uma cepa é cultivada por um método convencional e o composto acima mencionado pode ser obtido do caldo da cultura resultante pelo método descrito nas referências acima mencionadas ou uma combinação dos métodos de purificação convencionais. O composto acima mencionado pode ser obtido, por exemplo, extraindo o caldo da cultura com butanol, acetato de etila ou o semelhante e submetendo a solução de extrato à cromatografia líquida de alto desempenho.
As cepas do gênero Paenibacillus ou as substâncias capazes de induzir resistência à doenças em plantas, tais como composto 1 (Fusaricidin A), composto 2 (Fusaricidin B), composto 3, e composto 4, os quais são usados para controlar as doenças em plantas na presente invenção, podem ser usados contanto que eles estejam sem adicionar qualquer outro componente. Se necessário, pode ser usada uma composição preparada misturando a cepa ou substância acima mencionada com qualquer dos vários veículos tais como veículos sólidos ou veículos líquidos, ou uma formulação obtida preparando a cepa ou substância em um pó umedecido, um concentrado solúvel, uma suspensão, grânulos, um pó, microcápsulas, uma pasta ou o semelhante pela adição de adjuvantes para formulação, tais como aditivos.
Tal uma formulação contém a cepa do gênero Paenibacillus da presente invenção usualmente em uma quantidade de aproximadamente 0,1% a 99% em peso (o peso da bactéria é peso úmido). A formulação preferivelmente contém a cepa do gênero Paenibacillus da presente invenção em uma quantidade de cerca de 103 a cerca de 1011 de unidades que formam a colônia (daqui em diante abreviado como CFU) por g da formulação. Quando esporos, células vegetais ou cultura total da cepa do gênero Paenibacillus é usado, a formulação preferivelmente contém os esporos, células vegetativas ou cultura total em uma quantidade de aproximadamente 103 a 1011 CFU por g da formulação, ou em uma quantidade de usualmente aproximadamente 0,1% a 99% em peso (peso úmido). No caso das substâncias capazes de induzir resistência à doença em plantas, a formulação preferivelmente contém pelo menos um composto selecionado do composto 1 (Fusaricidin A), composto 2 (Fusaricidin B), composto 3, e composto 4 em uma quantidade 0,01% a 99%.
Os veículos sólidos usados na formulação incluem, por exemplo, pós minerais (por exemplo, argila caulim, bentonita, terra diatomácea, óxido de silício hidratado sintético, talco, quartzo, vermiculita e perlita), sais inorgânicos (por exemplo, sulfato de amônio, fosfato de amônio, nitrato de amônio, uréia e cloreto de amônio), pós orgânicos (farinha de trigo, farinha de soja, farelo de trigo, quitina, farelo de arroz, pó do leite desnatado e pó do leite integral), carbono ativado e carbonato de cálcio. Os veículos líquidos incluem, por exemplo, água, glicerol, óleos vegetais (por exemplo, óleo de soja e óleo de semente de linhaça), óleos de animal líquidos (por exemplo, óleo de peixe), etileno glicol, polietileno glicóis, propileno glicol e polipropileno glicóis.
Os adjuvantes para formulação incluem, por exemplo, agentes anticongelantes tais como caseína, gelatina, polissacarídeos (por exemplo, pó de amido, goma arábica, derivados de celulose, bentonita, açúcares, óleos vegetais, óleos minerais, polímeros solúveis em água sintéticos (por exemplo, álcoois polivinüicos, ácidos poliacrüicos, propileno glicol, etileno glicol, etc; agentes anti-espumantes tais como compostos do tipo silicone; e agentes de espessamento tais como polissacarídeos naturais (por exemplo, goma xantana), substâncias inorgânicas (por exemplo, alumínio e bentonita), polímeros solúveis em água sintéticos (por exemplo, ácidos poliacrílicos). A formulação pode ser usada em mistura com inseticidas, nematicídios, acaricidas, fungicidas, bactericidas, herbicidas, reguladores de crescimento da plantas, espalhadores, fertilizantes, materiais microbianos, incorporadores no solo e o semelhante, ou pode ser usada junto com eles sem mistura com os mesmos.
No controle das doenças em plantas de acordo com a presente invenção, a dosagem de aplicação (dosagem úmida) do ingrediente ativo da cepa do gênero Paenibacillus usado é usualmente cerca de 0,1 g a cerca de 10000 g, preferivelmente cerca de 10 g a cerca de 1000 g, por 10 ares. Quando o pó umedecido, suspensão, microcápsulas ou o semelhante é usado após ser diluído com água, a concentração de célula no momento da aplicação é usualmente cerca de 103 CFU/ml a cerca de 1011 CFU/ml, preferivelmente cerca de 105 CFU/ml a cerca de 109 CFU/ml. Os grânulos, pó, pasta e o semelhante podem ser aplicados conforme eles estejam na forma de tal uma formulação sem diluição.
Quando esporos, células vegetativas ou cultura total da cepa do gênero Paenibacillus é usado, a sua dosagem de aplicação é preferivelmente cerca de 0,1 g a cerca de 10000 g (peso úmido) por 10 ares. Quando os esporos ou células vegetativas são usados após ser diluído com água, a sua concentração no momento da aplicação é preferivelmente cerca de 103 CFU/ml a cerca de 1010 CFU/ml. A dosagem de aplicação da substância capaz de induzir resistência à doença em plantas é preferivelmente aproximadamente 0,001 a 10000 g por 10 ares. Quando pelo menos um composto selecionado do composto 1 (Fusaricidin A), composto 2 (Fusaricidin B), composto 3, e composto 4 é usado após ser diluído com água, a sua concentração no momento da aplicação é preferivelmente 0,1 a 1000 pg/ml.
No controle de doenças em plantas de acordo com a presente invenção, a cepa do gênero Paenibacillus ou substância capaz de induzir resistência à doença em plantas da presente invenção é preferivelmente aplicada a caules ou folhas, zona de enraizamento e/ou sementes de uma plantas. Para de fato aplicar a cepa ou substância, existem, por exemplo, métodos convencionais tais como um método de aplicar um líquido diluído ou um líquido não diluído para um pé da planta ou solo e um método de aplicar um líquido diluído ou um líquido não diluído a um pé da planta ou solo. Além desses métodos, pode ser adotado, por exemplo, o mesmo método de pulverização como um método para controlar doenças na parte acima do solo; um método de revestir sementes de plantas com, ou imergindo-as em, uma mistura ou cada da cepa do gênero Paenibacillus ou substância capaz de induzir resistência à doença em plantas da presente invenção, um veículo sólido, um agente adesivo chamado aglutinante, e o semelhante; um método de aplicar a cepa ou substância em mistura com um fertilizante, uma incorporação no solo, composto e o semelhante ou aplicando a cepa ou substância junto com os mesmos sem se misturar com os mesmos; e um método usando um material microbiano obtido adsorvendo a cepa do gênero Paenibacillus ou substância capaz de induzir resistência à doença em plantas da presente invenção em um veículo sólido e/ou sem adicionar ao mesmo nutrientes orgânicos (por exemplo, farelo de arroz, extrato de malte e aminoácidos), componentes do fertilizante, etc.
Ambos aplicando dosagem e aplicando concentração de tais formulações são variadas dependendo das condições tais como o tipo da formulação, um tempo de aplicação, um sítio de aplicação, um método de aplicação, um método de cultivo, o tipo de uma planta de colheita, o tipo de uma doença em planta, o grau de dano, etc., e pode ser aumentada ou diminuída sem restrição das faixas acima mencionadas. O controle de doenças em plantas de acordo com a presente invenção é explicado abaixo em outros detalhes com exemplos da separação das bactérias, exemplos de produção, exemplos de formulação, exemplos de teste, exemplos de cultivo, exemplos de extração, exemplos de purificação, exemplos de preparação e exemplos de avaliação, mas a presente invenção não é limitada a esses exemplos de trabalho.
Exemplo I - Separação das bactérias Separação e identificação de novas cepas Paenibacillus (por exemplo, Paenibacillus sp. bs-0048, Paenibacillus sp, BS-0074, PaenibaciUus polvmvxa BS-0105 e Paenibacillus sp. BS-0277 (1) Separação das cepas As raízes e solos da zona de enraizamento do tomate, berinjela, pimenta verde, pepino, melão, espinafre, morango, rabanete Japonês, inhame Chinês e o semelhante foram coletados dos campos de cultivo em vários lugares de todo o Japão, Em uma garrafa de vidro tampada contendo 90 ml de água esterilizada foram colocados 10 g do solo ou a raiz da zona de enraizamento, e submetido a tratamento com ultra-sonicação ou agitação. A suspensão resultante foi propriamente diluída e 1 ml da diluição foi misturado e diluído com meio de agar com albumina (0,25 g de albumina do ovo, 0,2 g de sulfato de magnésio, traço de sulfato de ferro III, 1 1 de agua destilada, pH 6,8 a 7,0), seguido pelo cultivo a 30°C por 5 a 10 dias. As colônias desse modo formadas foram separadas. (2) Identificação das cepas nor um teste ntorfológico e físico-caracterológico As cepas exemplificadas aqui são microorganismos separados do solo de cultivo do tomate, solo de cultivo de inhame chinês e solo de aplicação sucessiva e foram chamadas de cepa BS-0048, cepa BS-0074, cepa BS-0105 e cepa BS-0277 como códigos da cepa. A tabela 1 a seguir mostra os resultados de um teste morfológico e físico-caracterológico na cepa BS-0048, cepa BS-0074, cepa BS-0105 e cepa BS-0277. λ Q* 4>
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O Ό s 8 ^ Γ-Λ £; —■ ^ Λ 9 m ví H 00 Embora a cepa BS-0048 e cepa BS-0277 tenham a semelhança maior ao B.polymyxa, cada uma delas foi avaliada como nova cepa porque elas eram diferentes de B. polymyxa em reatividade V-P. Embora a cepa BS-0105 fosse semelhante a B. polymyxa ou B. macerans, ela era diferente dessas cepas em reatividade V-P e utilização da caserna. O resultado da identificação com um aparelho de identificação BiOLOG indicou que a cepa BS-0105 correspondeu ao B.macerans e B.polymyxa, mas a cepa BS-0105 foi avaliada como uma nova cepa porque ela era uma cepa diferente tendo uma pequena semelhança com B.macerans e B.polymyxa. Embora a cepa BS-0074 tivesse uma semelhança levemente maior com B. halodurans, ela foi avaliada como uma nova cepa porque havia várias diferenças entre cepa BS-0074 e B. halodurans com relação a utilização.
Como consequência do teste morfológico e físico-caracierológico acima mencionados, todas cepas BS-0048, cepa BS-0074. cepa BS-0105 e cepa BS-0277 separadas do solo de cultivo do tomate, solo de cultivo do ínhame chinês ou solo de cultivo de aplicação sucessiva foram identificadas como Bacillus sp. e depositadas como se segue no Patented Organism Deposition C enter (IPOD), Industrial Technology General Research Institute (Sociedade Administrativa Independente): cepa BS-0048 foi depositada como Bacillus sp. BS-0048 (data de recebimento: 18 de junho de 2004; número do recebimento: FERM P20085), cepa BS-0074 foi depositada como Bacillus sp. BS-0074 (data de recebimento: 18 de junho de 2004; número de recebimento: FERM P-20086), cepa BS-0105 foi depositada como Bacillus sp. BS-0105 (data de recebimento: 18 de junho de 2004; número de recebimento: FERM P-20087), e cepa BS-0277 foi depositada como Bacillus sp. BS-0277 (data de recebimento: 18 de junho de 2004; número de recebimento: FERM P-20088).
(3) Identificação pela análise da sequência base 16S rDNA
A sequência base (cerca de 1500 bp) 16S rDNA (gene lóS rDNA) da cepa de bacillus sp. BS-0105 foi determinada e a homologia da seqüência base determinada foi observada no banco de dados da cepa do tipo bacteriana e GenBanck/DDBJ/EMBL. Como conseqüência, a seqüência base 16S rDNA da cepa Bacillus sp. BS-0105 tinha a mais alta homologia com 16S rDNA de Paenibacillus polymyxa em uma percentagem de homologia de 98,7%. Análise da filogenia molecular foi realizada preparando uma árvore filogênica molecular e como conseqüência, foi considerado que cepa BS-0105 é muito provável de ser quase associada a P. polymyxa. Além disso, cepa BS-0105 e uma cepa tipo de P. polymyxa foram comparadas com relação aos valores de DNA-DNA empregando hidridização, para revelar que cepa BS-0105 tinha uma percentagem de homologia com a cepa tipo de 70% ou mais.
Com base nos fatos acima, cepa Bacillus sp. BS-0105 foi identificada como Paenibacillus polymyxa embora somente uma baixa homologia foi mostrada como conseqüência da identificação com um aparelho de identificação BioLOG. Portanto, cepa Bacillus sp. BS-0105 foi chamada de Paenibacillus polymyxa BS-0105. A seqüência base parcial (cerca de 500 bp) de 16S rDNA (gene 16S rDNA) de cada cepa Bacillus sp. BS-0048, cepa BS-0074 e cepa BS-0277 foi determinada e a homologia da seqüência base determinada foi observada no banco de dados de cepa do tipo bacteriana e GenBanck/DDBJ/EMBL. Como conseqüência, a seqüência base 16S rDNA de cada cepa Bacillus sp. BS-0048 e BS-0277 tinha a homologia mais alta com 16S rDNA de Paenibacillus polymyxa em percentagens de homologia de 98,5% e 97,5%, respectivamente. A seqüência base 16S rDNA da cepa Bacillus sp. BS-0074 tinha a homologia mais alta com 16S rDNA de Paenibacillus eligii em uma percentagem de homologia de 98,4%. Qualquer que seja o banco de dados usado para obter a homologia, 16S rDNAS de 30 cepas de classificação superior tendo uma homologia mais alta com cada das cepa Bacillus sp. BS-0048, cepa BS-0074 e cepa BS-0277 eram aqueles derivados de Paenibacillus. Análise da filogenia molecular foi realizada preparando uma árvore filogênica molecular para revelar que cepa Bacillus sp. BS-0048 e cepa BS-0277 foram incluídas em um grupo incluindo P. polymyxa como a figura central e que cepa Bacillus sp. BS-0048 mostrou a mesma ramificação filogenética como aquela de P. eligii.
Com base nos fatos acima, cepa Bacillus sp. BS-0048, cepa Bacillus sp. BS-0074 e cepa Bacillus sp. BS-0277 foram identificadas como cepas do gênero Paenibacillus. Portanto, elas foram chamadas de Paenibacillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. BS-0074 e Paenibacillus sp. BS-0277, respectivamente.
De acordo com os novos nomes acima, os nomes das cepas depositadas no Patented Organism Deposition Center (IPOD), IPOD (Sociedade Administrativa Independente), Industrial Technology General Research Institute, Chuo-dairoku, Higashi 1-1-1, Cidade de Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Japão 305-8566 foram mudados para novos nomes, e a deposição interna dessas cepas foi mudada para deposição internacional baseada no Tratado de Budapeste. Como conseqüência, cepa BS-0048, cepa BS-0074, cepa BS-0105 e cepa BS-0277 foram depositadas como se segue no Patented Organism Deposition Center (IPOD), IPOD (Sociedade Administrativa Independente), Industrial Technology General Research Institute, Chuo-dairoku, Higashi 1-1-1, Cidade de Tsukuba, Ibaraki Prefecture, Japão 305-8566: cepa BS-0048 foi depositada como Paenibacillus sp. BS-0048 (data de transferência do controle: 22 de julho de 2005 (22.07.2005); número de recebimento: IPOD FERM BP-10377), cepa BS-0074 foi depositada como Paenibacillus sp. BS-0074 (data de transferência do controle: 22 de julho de 2005 (22.07.2005); número de recebimento: IPOD FERM BP-10378); cepa BS-0105 foi depositada como Paenibacillus polymyxa. BS-0105 (data de transferência do controle: 22 de julho de 2005 (22.07.2005); número de recebimento: IPOD FERM BP-10379), e cepa BS-0277 foi depositada como Paenibacíllus sp. BS-0277 (data de transferência do controle: 22 de julho de 2005 (22.07.2005); número de recebimento: IPOD FERM BP-10380). Exemplo I - Produção Cultivo de Paenibacíllus sp. BS-0048. Paenibacíllus sp. BS-0074. Paenibacíllus polymyxa BS-0105 e Paenibacíllus sp. BS-0277 Um anel de células armazenadas de cada das cepas BS-0048, BS-0074» BS-105 e BS-0277 da presente invenção foi inoculado em um tubo de teste de 50 ml contendo 10 ml de meio TPMG (10 g de D-glicose» 1 g de extrato de carne, 3 g de extrato de levedura» 5 g de peptona, 1 l de água destilada, pH 7,0) e então cultivada por 3 dias no escuro a 25°C e um número de agitações de 100 agitações/min. Um frasco Erlenmeyer de 100 ml contendo 10 ml de um meio (20 g de D-glicose, 10 g de amido solúvel, 10 g de peptona, 10 g de extrato de levedura, 10 g de extrato de malte, 15 g de farinha de soja, I 1 de água destilada) foi inoculado com 0,1 ml da cultura de cada das cepas, BS-0048, BS-0105 e BS-0277 obtida pelo pré-cultivo descrito acima. Por outro lado, um frasco Erlenmeyer de 100 ml contendo 10 ml de meio YPMC foi inoculado com 0,1 ml da cultura da cepa BS-0074, Então, todas as cultura acima mencionadas foram incubadas por 4 dias sob condições de um número de revoluções de 200 rpm e 25°C.
Processo 2 de Produção Cultivo de Paenibacíllus polvmvxa BS-0105 Um anel de células armazenadas de cepa BS-0105 da presente invenção foi inoculado em um frasco Erlenmeyer de 100 ml de meio YPMG, e então cultivada por 7 dias no escuro a 30°C e um número de agitações de 100 agitações/min.
Exemplo 3 de Produção Preparação da cultura de Paenibacíllus polvmvxa BS-0105 Cerca de 1 litro da cultura da cepa BS-0105 obtido de acordo com exemplo 1 de produção foi centrifugado a 1500 rpm por 5 minutos para remover contaminantes derivados do meio, e então o sobrenadante foi centrifugado a 8000 rpm por 20 minutos para precipitar células. O precipitado foi lavado com salina fisiológica a 0,8% e re-centrifugado a 8000 rpm por 20 minutos. O procedimento acima foi repetido duas vezes para obter um precipitado da célula.
Exemplo 4 de Produção Preparação de pó da célula congelada a seco (esporo) de Paenibacillus polymyxa BS-0105 Um precipitado de célula lavada obtido de 300 ml da mesma cultura como descrita acima tio exemplo 3 de produção foi suspenso em 50 ml de água destilada e a suspensão resultante foi carregada em, uma máquina de congelamento a seco para obter 2,13 g de pó de célula congelada a seco (esporo) contendo células em uma quantidade de 8,8 x 109 CFU/g.
Exemplo 5 de Produção Preparação de pó da célula congelada a seco (esporo) dc Paenibacillus polymyxa BS-0105 Um precipitado de célula lavada obtido de 300 ml da mesma cultura como descrita acima no exemplo 3 de produção foi suspensa em 50 ml de 20% de leite desnatado e a suspensão resultante foi carregada em uma máquina de congelamento a seco para obter 11,08 g de pó de célula congelada a seco (esporo) contendo células em uma quantidade de 3,5 x I09 CFU/g. Exemplo 6 de Produção Preparação de pó de célula congelada a seco (esporo) de Paenibacillus polvmvxa BS-0105 Um precipitado de célula lavada obtido de 300 ml da mesma cultura como descrita acima no exemplo 3 de produção foi suspensa em 50 ml de solução de sulfato de amônio a 5% e a suspensão resultante foi carregada em uma máquina de congelamento a seco para obter 14,67 g de pó da célula congelada a seco (esporo) contendo células em uma quantidade de 34,3 x 109 CFU/g.
Exemplo 7 de Produção Preparação de pó da cultura de Paenibacülus polymyxa BS-0105 Congelando a seco 100 ml da cultura obtida de acordo com exemplo 2 de produção, 3,56 g do pó da cultura contendo células em uma quantidade de 4,1 x 1 ü9 CFU/g foram obtidos.
Exemplos de formulação são dados abaixo. O termo “partes” são em peso.
Exemplo 1 de Formulação Preparação de um pó umedecido Cerca de 60 partes (peso seco) das bactérias da presente invenção obtidas de acordo com cada dos exemplos 4, 5, 6 e 7 de produção foram misturadas com 20 partes de farinha de soja, 10 partes de peptona e 10 partes de D-glicose para obter um pó umedecido contendo células.
Exemplo 2 de Formulação Preparação de um pó umedecido Cerca de 80 partes (peso seco) das bactérias da presente invenção obtidas para cada dos exemplos 4 e 5 de produção foram misturadas com 20 partes de farinha de soja para obter um pó umedecido contendo células.
Exemplo 3 de Formulação Preparação de um material de cultura Um anel de células armazenadas de cepa BS-0105 da presente invenção foi inoculado em um frasco de Erlenmeyer contendo 50 ml de meio YPMG, e então cultivadas por 6 dias a 30°C e um número de agitações de 100 agitações/min. Subsequentemente, zeólilo e farinha de soja foram misturados na relação de 9:1 c 200 g da mistura foram colocadas em uma garrafa da maionese, seguida pela adição a mesma de 50 ml de água, e a mistura resultante foi esterilizada a 121°C por 30 minutos. Para o material dessa forma obtida foi adicionado 1 ml da cultura obtida pelo pré-cultivo descrito acima, e incubado a 30°C por 10 dias para obter um material de cultura contendo células da cepa BS-0105 em uma quantidade de IO9 €FU/g O fato que o método para controlar doenças em plantas da presente invenção tem efeito no controle de doenças em plantas é demonstrado abaixo com exemplos de teste.
Exemplo 1 de teste Teste para o efeito no controle de uma cultura de cada cepa em antracnose de pepino Cada de recipientes plásticos foi preenchido com composto de horticultura e semeado com pepino (cultivar: Suyo), seguido pelo crescimento em uma estufa por 20 dias. O cotilédone da muda de pepino jovem tendo uma primeira folha real desenvolvida foi revestido com 0,1 ml de cultura de cada das cepas BS-0048, BS-0074, BS-0105 e BS-0277 preparadas pelo métodos descritos no exemplo 1 de produção. Após os recipientes ter sido mantidos em uma estufa a 25°C por 3 dias» as plantas foram inoculadas com uma suspensão da antracnose de pepino causada pelo fungos conidia em água destilada (Colletrotrichum orbiculare, 1 x 106 esporos/ml) pulverizando. Os recipientes foram mantidos em uma câmara úmida escura a 25°C por 24 horas e então em uma estufa a 25°C por 7 dias para provocar a doença. Lesões na primeira folha real de cada muda foram contadas e o valor de proteção foi calculado do número de lesões pela seguinte equação para fazer uma comparação com relação ao efeito no controle. Os resultados são mostrados na Tabela 2.
Valor de proteção = {1 - (número de lesões na plantas tratada/número de lesões na plantas não tratada)} x 100 Tabela 2: Teste para efeito no controle de uma cultura de cada cepa em antracnose de pepino Como é observado dos resultados mostrados na Tabela 2, quando o cotilédon foi tratado com a cultura de cada bactéria da presente invenção, a cultura nitidamente controlou a infecção da primeira folha real como Âcibenzolar-S-medla, um controlador bem conhecido.
Exemplo 2 de Teste Teste para efeito no controle de esporos purificados em antracnose de pepino Cada de recipientes plásticos foi preenchido com composto de horticultura c semeado com pepino (cultivar: Suyo), seguido pelo crescimento em uma estufa por 20 dias. A muda do pepino novo tendo uma segunda folha real desenvolvida foi submetida ao tratamento com aplicação na folhagem com uma amostra da preparação de esporo da cepa BS-0105 formulando a bactéria da presente invenção produzida pelo método descrito em cada dos exemplos 4, 5, 6 e 7 de produção, pelo método descrito no exemplo 1 de formulação, de modo que a proporção de células deve ser 2 x 107 CFU/ml, Após os recipientes ter sido mantidos em uma câmara úmida escura a 25°C por 24 horas e então em uma estufa a 25°C por 4 dias, as plantas foram inoeuladas com uma suspensão de antracnose de pepino provocada pelo fungo conidia em água destilada (Colletrotrichum orbículare, I x 10ò esporos/ml) pulverizando. Os recipientes foram mantidos em uma câmara úmida escura a 25°C por 24 horas e então em uma estufa a 25°C por 7 dias para provocar a doença. Lesões na primeira folha real de cada muda foram contadas e o valor de proteção foi calculado do número de lesões pela seguinte equação para fazer uma comparação com relação ao efeito de controle. Os resultados são mostrados na Tabela 3.
Valor de proteção = {I - (número de lesões na plantas tratada/número de lesões na plantas não tratada)} x 100. ín ο ο Λ '1 ‘3 I 5 6 s> ο 1 u «Π I ίΛ {J* ο = Ξ ϋ 5 ώ ο -5 •8 | 4) Λ 1 1 g c b <u C 3 «* σ’ H E <υ « ^ -H Ο Ό — .E i i g <2 4> ?3 O •s ^ _4> ¢3 g _g! I s £ ε Ο {Λ G <U P £ I s Bl ro JS * Já £ 2 9t í3 Η Z
Como é observado dos resultados mostrados na Tabela 3, todas as formulações compostas principalmente das bactérias da presente invenção exibiram um efeito no controle igual ou superior àquele de uma impressão do pó umedecido e Acibenzolar-S-metila os quais são controladores bem conhecidos.
Exemplo 3 de Teste Teste para o efeito no controle de esporos purificados em crestamento bacteriano em pepino Cada dos recipientes plásticos foi preenchido com composto de horticultura e semeado com pepino (cultivar: Suyo), seguindo pelo crescimento em uma estufa por 20 dias. A muda do pepino novo tendo uma segunda folha real desenvolvida foi submetida ao tratamento com aplicação na folhagem com uma amostra da preparação de esporo da cepa BS-0103 formulando a bactéria da presente invenção produzida pelo método descrito no exemplo 5 de produção, pelo método descrito no exemplo 1 de formulação, de modo que a proporção de células deve ser 2 x 107 CFU/ml. Após os recipientes ter sido mantidos em uma câmara úmida escura a 25°C por 24 horas e então em uma estufa a 25°C por 4 dias, as plantas foram inoculadas com uma suspensão (1 x l(f CFU/ml) de crestamento bacteriano de pepino (Pseudomonas syringae pv. lachrymans) em água destilada pulverizando. Os recipientes foram mantidos em uma câmara úmida escura a 25°C por 24 horas e então em uma estufa a 25°C por 7 dias para provocar a doença. Lesões na segunda folha real de cada muda foram contadas e o valor de proteção foi calculado do número de lesões pela seguinte equação para fazer uma comparação com relação ao efeito no controle. Os resultados são mostrados na Tabela 4.
Valor de proteção = {1 - (número de lesões na plantas tratada/número de lesões na plantas não tratada)} x 100.
Tabela 4: Efeito no controle da cepa BS-0105 em crestamento bacteriano em pepino Na tabela 4, as mesmas letras do alfabeto indicam que não havia diferença significante (nível de significância: 0,05).
Como é observado dos resultados mostrados na Tabela 4, as formulações compostas principalmente das bactérias da presente invenção exibiram um efeito no controle igual ou superior àquele de urna impressão do pó umedecido e Acibenzolar-S-metila os quais são controladores bem conhecidos.
Exemplo 4 de teste Teste paia o efeito no controle de esporos purificados em antracnose do morango Mudas de morango (cultivar: Akihime) cultivadas em recipientes plásticos e tendo cerca de 10 folhinhas desenvolvidas foram submetidas ao tratamento com aplicação na folhagem com uma amostra de preparação de esporo da cepa BS-0105 obtida formulando a bactéria da presente invenção produzida pelo método descrito no exemplo 5 de produção, pelo método descrito no exemplo 2 de formulação, de modo que a proporção de células deve ser 2 x 107 CFU/ml. Após os recipientes ter sido mantidos em uma câmara úmida escura a 25°C por 24 horas e então em uma estufa a 25°C por 3 dias (ou 1 dia no caso de Amister 20 escoável), as plantas foram inoculadas com urna suspensão do fungo conidia da antracnose de morango em água destilada (Colletrotrichum orbieulare, 2 x 10fi esporos/ml) pulverizando. Os recipientes foram mantidos em uma câmara úmida escura a 25°C por 24 horas e então em uma estufa a 25°C por 14 dias para provocar a doença. A gravidade da doença foi calculada pela seguinte equação e o valor de proteção foi calculado dos valores de gravidade da doença pela seguinte equação para fazer uma comparação com relação ao efeito no controle. Os resultados são mostrados na Tabela 5.
Gravidade da doença = (Σ do índice da gravidade da doença x número de mudas pertinentes/ 4 x número de mudas inspecionadas) x 100. índice de gravidade da doença 0: nenhuma infecção; índice de gravidade da doença 1: algumas pequenas manchas foram observadas em uma folhinha; índice de gravidade da doença 2: um grande número de pequenas manchas foram observadas em caules e folhas; índice de gravidade da doença 3: grandes manchas evidentes estavam presentes em caules e folhas; índice de gravidade da doença 4: murcha e seca até morte.
Valores de proteção - {l - (gravidade da doença em plantas tratadas/ gravidade da doença em plantas não tratadas)} x 100.
Tabela 5: Efeito no controle da cepa BS-0I05 em antracnosc de morango Na tabela 5, as mesmas letras do alfabeto indicam que não havia diferença significame (nível de significância: 0,05), Como é observado dos resultados mostrados na Tabela 5, a formulação composta principal mente da bactéria da presente invenção mostrou uma menor gravidade da doença e um maior efeito no controle do que Âmister 20 escoãvel e Aeibenzolar-S-melila os quais são controladores bem conhecidos.
Exemplo 5 de Teste Teste para o efeito no controle de um caldo de cultura em crestamenio bacteriano em melão Cada das bandejas foi preenchida com Ai sai n° 1 (mdf. por Katakura Chikkarin Co., Ltda) e uma muda de melão (cultivar: Aries) foi cultivada em cada bandeja. Nesse caso, uma planta com tratamento de semente foi preparada imergindo sementes de melão em uma placa petri contendo 10 ml (108 esporos/ml) do caldo de cultura da cepa BS-0105 preparada no exemplo 2 de produção, seguida pela bacterização a 30°C por 2 horas. Após o desenvolvimento de um cotilédon, a muda foi colocada em uma vaso de polietileno de 12 cm preenchido com Aisai n° 1. Quando as três folhas reais foram completamente desenvolvidas, as plantas a seguir foram preparadas: plantas no qual tratamento de imersão ou pulverização da folha, respectivamente com 1 ml (108 esporos/ml) do caldo de cultura de cepa BS-0105 preparado no exemplo 2 de produção foi realizado, e uma planta na qual pulverização da folha de 2ml de uma solução de 2 ppm de Acibenzolar-S-metila foi realizada. Como para a inoculação da bactéria patogênica (Pseundomonas syringae pv. lachrymans), 5 dias após o tratamento, um líquido contendo a bactéria do crestamento bacteriano previamente cultivada em um meio semi-sintético da batata (um decocto consistindo de 300 g de batata e 1 1 de água destilada, 0,5 g de nitrato de cálcio tetraidratado, 5 g de peptona, 20 g de sacarose, 15 g de agar pulverizado) foi inoculado no total de cada folha pulverizando de modo que o lado contrário da folha possa ser principalmente tratado. Inspeção de infecção foi realizada contando lesões em cada das folhas da segunda a quarta folhas 8 dias após inoculação com a bactéria patogênica. O valor de proteção foi calculado do número das lesões pela seguinte equação para fazer uma comparação com relação ao efeito no controle. Os resultados são mostrados na Tabela 6.
Valores de proteção = {1 - (gravidade da doença em plantas tratadas/ gravidade da doença em plantas não tratadas)} x 100.
Tabela 6: Efeito no controle da cepa BS-0105 em crestamento bacteríano em melão Como é observado dos resultados mostrados na Tabela 6. a cultura da bactéria da presente invenção exibiu um efeito no controle igual ou superior aquele do Ac i ben zol ar-S - met i 1 a, um controlador bem conhecido, quando qualquer da semente, pulverização da folha e tratamentos com imersão com a cultura acima dita foi realizada.
Exemplo 6 de Teste Teste do efeito no controle de um caldo de cultura em murcha de fusarium do melão Cada das bandejas foi preenchida com Aisai n° 1 e uma muda de melão (cultivar: Prince) foi cultivada em cada bandeja. Nesse caso, sementes do melão tinham sido imersas em uma placa petri contendo 10 ml (lü8 esporos/ml) do caldo de cultura da cepa BS-0105 preparada no exemplo 2 de produção, seguida pela bacterização a 30°C por 2 horas. Após o desenvolvimento de um codlédon, a muda foi colocada em uma vaso de polietíleno de 10,5 cm preenchido com solo infectado tendo murcha dc Fusarium (Fusarium oxysporum f. sp. melonis), seguida pela imersão com o caldo de cultura do Bacillus sp. BS-0105 preparado no exemplo 2 de produção, em uma proporção de 1 ml/recipiente (10 esporos/ml). No caso de pó umedecido Benlate, tratamento com imersão com 2 ml de uma diluição de 1000 vezes (concentração: 500 ppm) do pó umedecido foi realizado. A gravidade da doença foi calculada pela seguinte equação e o valor de proteção pela seguinte equação para fazer uma comparação com relação ao efeito no controle. Os resultados são mostrados na Tabela 7.
Gravidade da doença = (Σ do índice da gravidade da doença x número de mudas / 4 x número de mudas) x 100, índice de gravidade da doença: avaliada na seguinte escala de zero a quatro; 0 (saudável), l (leve), 2 (moderada), 3 (séria), e 4 (secura até morrer).
Valores de proteção = {1 - (gravidade da doença em plantas tratadas/ gravidade da doença em plantas não tratadas)) x 100.
Tabela 7: Efeito no controle de cepa BS-Ü105 em murcha de Fusarium do melão Como é observado dos resultados mostrados na Tabela 7, a cultura da bactéria da presente invenção exibiu um efeito no controle igual àquele do pó utnedecido Benlate, um controlador bem conhecido, quando usado para tratamentos com imersão e de semente.
Os exemplos a seguir são dados como métodos para obter composto 1 (Fusaricidin A) e composto 2 (Fusaricidin B) de uma cultura de Paenibacillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. BS-0074, Paeníbaeillus polymyxa BS-Ü1Ü5 ou Paenibacillus sp. BS-0277.
Exemplo 1 de Cultivo Cultivo de paenibacillus polymyxa BS-0105 Um anel de células armazenadas de cepa BS-0105 da presente invenção foi inoculada em um frasco Erlenmeyer contendo 10 ml de meio YPMG (10 g de D-glicose, 1 g de extrato de carne, 3 g de extrato de levedura, 5 g de peptona, 1 I de água destilada, pH 7,0) e então cultivada por 3 dias no escuro a 25°C e um número de revoluções de 200 rpm. Um frasco Erlenmeyer de 100 ml contendo 10 ml de um meio de produção (20 g de D-glicose, 10 g de farinha de soja, 5 g de água de maceração de milho, 2,5 g de glicerol, 2,5 g de amido de milho, 1 g de extrato de levedura, 1 g de NaCl, 1 g de CaC03, 1 1 de água destilada, pH 7,0) foi inoculado com 0,5 ml da cultura obtida pelo pré-cultivo descrito acima, seguido pela agitação da cultura por 4 dias a 25°C e um número de revoluções de 200 rpm.
Exemplo 1 de Extração Extração de um caldo de cultura de Paenibacillus polvmvxa BS-0105 Após 300 ml do caldo de cultura ter sido extraído durante a noite agitando com um volume igual de butanol, a solução do extrato de butanol resultante foi concentrada em um evaporador rotatório, O extrato foi extraído com acetato de etíla/ãgua destilada e então a camada aquosa foi extraída com butanol/água destilada. A camada de butanol foi recuperada e então concentrada para secar.
Exemplo 1 de Purificação Purificação de uma mistura de composto 1 (Fusaricidin A) e composto 2 (Fusaricidin B) O extrato bruto foi dissolvido em 4 ml de sulfóxido de dimetila e purificado por HPLC. As condições de HLPC eram como se segue. Isto é, usando acetonitrila-0,1 % de TFA (35:65) (v/v) como uma fase móvel e um Senshu Pak PEGASIL ODS2 20 X 250 mm como uma coluna, separação por HPLC foi realizada sob as seguintes condições: injetando volume por uma porção de 0,1 ml, temperatura da coluna de 40°C e vazão de 9 ml/niin. Um componente em um tempo de retenção de 23 minutos foi recuperado e então concentrado para secar para obter 60,7 mg de uma mistura contendo composto 1 e composto 2 na relação de 3:2.
Identificação de composto 1 (Fusaricidin A) e composto 2 (Fusaricidin B) A mistura contendo composto 1 e composto 2 na relação de 3:2 foi dissolvida em DMSO-D&, seguida pela medição com l3C-NMR. Como conseqiiência, foi revelado que os valores medidos por nC-NMR assim obtidos concordaram com aqueles para Fusaricidin  e Fusaricidin B descritos nos documentos não patenteados 4 e 5. Tabela 8 mostra dados de mudança química para composto 1 (Fusaricidin A) e composto 2 (Fusaricidin B).
Tabela 8: Dados de mudança química para composto 1 (Fusaricidin A) e composto 2 (Fusaricidin B) GHPD: ácido 15 -gu anid i no- 3 - h idrox i pen tadeca nóic o Exemplo 2 de Purificação Produção de composto 1 (Fusaricidin A) e composto 2 (Fusaricidin B) de Faenibacillus sp. Bs-0048, Paenibacillus sp. Bs-0074 e Paenibacillus sp. BS- 0277 Cepas BS-0048, BS-0074, BS-105 e BS-0277 foram cultivadas de acordo com exemplo 1 de cultura acima mencionado. Após 10 ml do caldo de cultura desse modo obtido de cada cepa ter sido extraído durante a noite agitando com um volume igual de butanol, a solução de extrato de butanol resultante foi concentrada em um evaporador rotatório. O extrato foi dissolvido em 1 ml de sulfóxido de dimetila, seguido pela análise LC/MS (analisadores MS e LC são NANOSPACE SI-2 (Shiseido) e P1NÍGAN LCQduo (Thermo Quest)). Corno para a análise das condições de HPLC, usando uma solução de acetonitrila a 27% contendo 0,1%· de TFA (acido irifluoroacético) como uma fase móvel e PACELL PAK Cik UG120 3 μιη 2,0 x 100 mm (Shiseido) como uma coluna, separação foi realizada em um volume de injeção para uma porção de 3 μΐ, uma temperatura da coluna de 40°C e uma vazão de 0,2 ml/min., e então medição do peso molecular foi realizada sob as seguintes condições. Isto é, a medição foi realizada sob condições de uma temperatura de capilaridade de 245°C, uma voltagem de capilaridade de 10 V, uma vazão de gás de impulsão de 95 arb, uma vazão de gás auxiliar de 10 arb, uma voltagem de pulverização de 5 kV e uma voltagem multiplicadora de elétron de 700 V. Como consequência, um pico de íon molecular correspondendo a um peso molecular de 883 (M +H)+ foi detectado em um tempo de retenção de 18,5 minutos e um pico de íon molecular correspondendo a um peso molecular de 897 (M+H)+ em um tempo de retenção de 17,8 minutos no caso do extrato de cultura de qualquer das cepas BS-0048, BS-0074, BS-0105 e BS-0277. Também no caso da mistura do composto l e composto 2 descri ta no exemplo 1 de purificação, os mesmos picos de íon molecular como acima foram detectados nos mesmos tempos de retenção, respectivamente, como acima. Por esses resultados e o resultado da medição nC-NMR acima mencionada, foi confirmado que a substância detectada em um tempo de retenção de 18,5 minutos era Fusaricidin A e a substância detectada em um tempo de retenção de 17,8 minutos era Fusaricidin B.
Exemplo 1 de Preparação Preparação de um concentrado solúvel A mistura de composto 1 e composto 2 na relação de 3:2 foi dissolvida em sulfóxido de dimetila e a solução resultante foi diluída para uma concentração alvo com água destilada.
Exemplo 1 de Avaliação Avaliação de uma atividade de induzir resistência à doenças em plantas Siegrist, J. et af, (Physiological and Molecular Plant Pathology 53, 223-238:1998) tem revelado a melhora da responsividade do clicitor pelo Acibenzolar-S-metila, uma substância capaz dc induzir resistência em doenças em plantas, adotando um método o qual a responsividade do elicitor de células de salsa cultivadas é medida pela detecção de fitoalexina usando fluorescência, em uni sistema experimental modelo paia investigar uma atividade de induzir resistência à doença em plantas. A atividade de induzir resistência à doença em plantas do composto 1 e composto 2 de acordo com a presente invenção foi também avaliada de acordo com o método de Siegrist, J. et al.,. Os resultados são mostrados na tabela 9.
Tabela 9: Resultados da detecção de fitoalexina NT: não tratadas Dos resultados mostrados na Tabela 9, é observado que composto 1 e composto 2 melhoram a responsividade do elicitor de células de salsa cultivadas como a substância existente tendo uma atividade de induzir resistência à doença em plantas e então tem urna atividade de induzir resistência à doença em plantas.
Exemplo 2 de Avaliação Teste para atividade antimicrobiana contra bactéria do crestamento bacteriano do pepino Se composto 1 e composto 2 exibiu atividade antimicrobiana direta contra crestamento bacteriano do pepino (Pseudomonas syringae pv. laehrymans) foi investigada. Isto é, bactéria do crestamento bacteriano do pepino foi misturada com um meio semi-sintético da batata (um decocto consistindo de 300 g de batata e 1 1 de água destilada, 0,5 g de nitrato de cálcio tetraidratado, 2 g de hidrogeno fosfato de dissódio dodecaidratado, 5 g dc peptona, 20 g dc sacarosc, 15 g de agar pulverulento) mantido a 45°C, em uma proporção de 1 x \{f CFU/ml, e a mistura resultante foi dispensada em 20 ml de alíquotas em placas petri esterilizadas. Após a solidificação do meio» 50 μΐ de uma solução obtida dissolvendo uma mistura de 3:2 de compostos 1 e 2 em sulfóxido de dimetíla a uma concentração de 100 pg/ml foi infiltrada em um disco de papel com um diâmetro de 8 mm, e então o disco de papel foi mantido no meio. Após 48 horas de cultivo a 25°C no escuro, a atividade foi avaliada com base na presença de uma zona de inibição em volta da periferia do disco de papel. Os resultados são mostrados na Tabela 10.
Tabela 10: Atividade antimicrobiana direta contra bactéria do crestamento bacteriano do pepino Dos resultados mostrados na Tabela 10, foi observado que composto 1 e composto 2 não exibiram atividade antimicrobiana direta contra bactéria do crestamento bacteriano do pepino.
Exemplo 3 de Avaliação Teste para efeito no controle em crestamento bacteriano do pepino Cada dos recipiente plásticos foi preenchido com composto de horticultura e semeado com pepino (cultivar: Suyo), seguido pelo crescimento em uma estufa por 20 dias. A muda do pepino novo tendo uma segunda folha real desenvolvida foi submetida ao tratamento com imersão tio pé da planta com a formulação obtida no exemplo de preparação acima mencionado, em uma proporção de 5 ml por muda. Após os recipientes ter sido mantidos em uma estufa a 25°C por 3 dias, as plantas foram inoculadas com uma suspensão (1 x 10a CFU/ml) de bactéria do crestamento bacteriano do pepino (Pseudomonas syringae pv. lachrymans) em água destilada pulverizando. Os recipientes foram mantidos em uma câmara úmida escura a 25°C por 24 horas e então em uma estufa a 25°C por 7 dias para provocar a doença. Lesões em cada folha foram contadas c o valor de proteção foi calculado do número das lesões pela seguinte equação para fazer uma comparação com relação ao efeito no controle. Os resultados são mostrados na Tabela 11, Valor de proteção = {I - (número de lesões na plantas tratadas /número de lesões em plantas não tratadas)} x 100.
Tabela 11: Efeito no controle do composto 1 e composto 2 em crestamento bacteriano no pepino Na tabela 11, as mesmas letras do alfabeto indicam que não houve significante diferença (nível de sígnificância: 0,05).
Como é observado dos resultados mostrados na Tabela 11, a formulação composta principalmente de composto 1 e composto 2 de acordo com a invenção exibiu um excelente efeito no controle da bactéria do cresta mento bacteriano do pepino contra a qual a formulação não exibiu atividade antimicrobiana direta.
Exemplo 4 de Avaliação Teste para atividade antimicrobiana contra murcha de fusarium do pepino Se composto 1 e composto 2 exibiram atividade antimicrobiana direta contra murcha de Fusarium do fungo do pepino (Fusarium oxysporum f. sp. cucmerium) foi investigado. Isto é, conidia da murcha de Fusarium do fungo pepino foi misturada com um meio de agar com dextrose de batata (Nissui Pharmaceutical) mantida a 45°C, e uma proporção de 1 x 107 esporos/ml, e a mistura resultante foi dispensada em 20 ml de alíquotas em placas petri esterilizadas. Após a solidificação do meio, 50 μ] de uma solução obtida dissolvendo uma mistura de 3:2 de compostos 1 e 2 em sulfóxido de dimetila a uma concentração de 100 pg/ml foi infiltrada em um disco de papel com um diâmetro de 8 mm, e então o disco de papel foi mantido no meio. Após 48 horas de cultivo a 25°C no escuro, a atividade foi avaliada com base na presença de uma zona de inibição em volta da periferia do disco de papel Os resultados são mostrados na Tabela 12.
Tabela 12: Atividade microbiana direta contra murcha de Fusarium do fungo do pepino +: uma zona de inibição evidente estava presente, nenhuma zona de inibição estava presente.
Como é observado dos resultados mostrados na Tabela 12, a mistura 3:2 de composto 1 e composto 2 não exibiu atividade antimicrobiana contra murcha de Fusarium do fungo do pepino (Fusarium oxysporum f. sp. cucumerium) mesmo quando os compostos 1 e 2 foram misturados de modo que suas concentrações deveríam ser 30 ppm e 20 ppm, respectivamente. Exemplo 5 de Avaliação Teste para efeito no controle em murcha de fusaríum do pepino Cada das tinas plásticas foi preenchida com composto de horticultura e semeado com pepino (cultivar: Sagamihanjiro), seguido pelo crescimento em uma estufa por 12 dias. A muda de pepino jovem tendo um cotilédon desenvolvido foi submetida ao tratamento com pulverização da folha com a formulação obtida no exemplo de preparação acima mencionado, em uma proporção de 1 ml por muda. Após as tinas ter sido mantidas em uma estufa a 25°C por 3 dias, o pé das plantas de cada planta foi inoculado com 2 ml de uma suspensão (3 x 107 esporos/ml) de conidia da murcha de Fusaríum do fungo do pepino (Fusaríum oxysporum f. sp. cucumerium) em água destilada por imersão. As tinas foram mantidas em uma câmara úmida escura a 25°C por 24 horas e então em uma estufa a 25°C por 14 dias para provocar a doença. A gravidade da doença foi calculada do grau de infecção e então o valor de proteção foi calculado pelos valores da gravidade da doença pela seguinte equação para fazer uma comparação com relação ao efeito no controle. Os resultados são mostrados na Tabela 13.
Gravidade da doença = (Σ do índice da gravidade da doença x número de mudas pertinentes/ 4 x número de mudas inspecionadas) x 100. índice de gravidade da doença 0: nenhuma infecção; índice de gravidade da doença 1: algumas pequenas manchas foram observadas em uma folhinha; índice de gravidade da doença 2: um grande número de pequenas manchas foram observadas em caules e folhas; índice de gravidade da doença 3: grandes manchas evidentes estavam presentes em caules e folhas; índice de gravidade da doença 4: murcha não tratada e secura até morte.
Valores de proteção = {1 - (gravidade da doença em plantas tratadas/ gravidade da doença em plantas não tratadas)) x 100.
Tabela 13: Efeito no controle em murcha de Fusarium de pepino Na tabela 13, as mesmas letras do alfabeto indicam que não houve significante diferença (nível de signíficãncia: 0,05).
Como é observado dos resultados mostrados na tabela 12, a formulação composta princípalmente de composto 1 e composto 2 de acordo com a presente invenção controlou murcha de Fusarium do pepino, uma doença do solo no caso do tratamento com pulverização na parte acima do solo. A formulação exibiu um excelente efeito no controle no caso do tratamento com uma mistura de composto 1 e composto 2 em concentrações de 12 ppm e 8 ppm, respectivamente, as quais eram concentrações a quais a formulação não exibiu atividade antimicrobiana direta.
Exemplo 3 de Purificação Separação e purificação do composto 1 (Fusaricidin Al e composto 2 (Fusaricidin B) Em 3 ml de sultoxido de dímetila foram dissolvidos 133,7 mg de uma mistura de composto 1 e composto 2, e esses compostos foram purificados por HPLC. As condições de HPLC eram como se segue. Isto é, usando acetonitrila-0,1% de TFA (29:71) (v/v) como uma fase móvel e Shiseido CAPCELL PAK C1K SGI20 5 pm 4,6 x 250 mm como uma coluna, temperatura da coluna 40°C, e vazão de 1 ml/min. Eluatos em tempos de retenção de 20 minutos a 35 minutos foram recuperados em intervalos de 30 segundos e cada fração foi analisada por LC/MS. As condições de analise por HPLC eram como se segue: usando TFA (0,1 %)-contendo acetonitrila-0,1 % de TFA (27:73) (v/v) como uma fase móvel e Shiseido CAPCELL PAK C]8 SG120 3 μνη 2,0 x 100 mm como uma coluna, separação foi realizada em uma volume de injeção para uma porção de 0,01 ml, uma temperatura da coluna 40°C e vazão de 0,2 ml/mirt, e então medição do peso molecular foi realizada sob as condições a seguir. Isto é, a medição foi realizada sob condições de uma temperatura de capilaridade de 245°C, uma voltagem de capilaridade de 10 V, urna vazão de gãs de impulsão de 95 arb, uma vazão de gás auxiliar de 10 arb, uma voltagem de pulverização de 5 kV e uma voltagem multiplicadora de elétron de 700 V.
Frações contendo composto 1 foram combinadas e então concentradas para secura para obter 44,7 mg de composto I. Frações contendo composto 2 foram combinadas e então concentradas para secura para obter 24,8 mg de composto 2.
Exemplo 6 de Avaliação Avaliação da atividade de induzir resistência à doença em plantas de cada do composto 1 e composto 2 A atividade de induzir resistência à doença em plantas de cada do composto 1 e composto 2 foi avaliada na mesma maneira como no exemplo 1 de avaliação adotando o método executado no exemplo 1 de avaliação, isto é, o método no qual a responsivídade do elicitor de células de salsa cultivadas foi medida pela detecção de fitoalexina usando fluorescência. Os resultados são mostrados na Tabela 14.
Tabela 14: Resultados da detecção de fitoalexina Dos resultados mostrados na tabela 14, é observado que cada do composto 1 e composto 2 melhoram a responsivídade do elicitor de células de salsa cultivadas como a substância existente tendo uma atividade de induzir resistência à doença em plantas e então tem uma atividade de induzir resistência à doença em plantas.
Exemplo 2 de Cultivo Cultivo de Paenibacillus polymyxa BS-0105 Um recipiente de 400 ml contendo 100 ml de meio de YPMG (10 g de D-glicose, I g de extrato de carne» 3 g de extrato de levedura, 5 g de peptona, I l de água destilada, pH 7,0) foi inoculada com 100 μΙ de uma suspensão de célula armazenada pelo congelamento da cepa BS-0105 da presente invenção, seguida pelo cultivo por 1 dia a 25°C e um numero de revoluções de 210 rpm.. .Em um fermentador contendo 20 1. de um meio de produção (200 g de D-glieose, 600 g de amido, 50 g de sulfato de amônio, 50 g de farinha de soja, lOg de di-hidrogeno fosfato de potássio, 5 g de cloreto de sódio, 5 g de sulfato de magnésio, 120 g de carbonato de cálcio) foi transferido c inoculado 200 ml da cultura obtida pelo pré-cultivo descrito acima, seguido pelo cultivo por 3 dias a 25°C, uma taxa de aeração de 10 l/min e um número de revoluções de 400 rpm.
Exemplo 2 de Extração Extração de composto 3 e composto 4 Para 5 1 do caldo de cultura obtido no exemplo de cultivo 2 acima foram adicionados 5 1 de álcool isopropílico e 1 1 de 1 mol/l de cloreto de cálcio e a mistura resultante foi filtrada para obter cerca de 10 1 de uma solução do extrato. Após 5 1 da solução do extrato ter sido concentrada para 500 ml» a concentração foi extraída com 500 ml de butanol e a camada de butanol foi extraída três vezes com 200 ml de água destilada para obter 600 ml de uma camada aquosa. A camada aquosa foi concentrada em um evaporador rotatório e a camada aquosa resultante foi carregada em uma coluna de sílica gel de octadecila. A coluna foi lavada com água, seguida pela elnição com 10 a 25% de soluções de acetonitrila aquosas. O eluato foi concentrado para obter o extrato bruto.
Exemplo 4 de Purificação Separação e purificação de composto 3 e composto 4 O extrato bruto obtido no exemplo de extração 2 acima foi dissolvido em 4 ml de 50¾) de metanol e purificado por HPLC. As condições de HPLC eram como se segue: Isto é, usando acetonitrila-0,1% de TFA (32:68) (v/v) como uma fase móvel e Inerstsi! ODS 20 x 250 mm como uma coluna, separação por HPLC foi realizada sob as seguintes condições: injetar um volume para uma porção de l ,5 ml, uma temperatura da coluna de 30°C e uma vazão de 10,0 ml/min. Cada fração foi analisada por LC/MS (fase móvel: TFA (0,1 %)-contendo acetonitrila-0,1% de TFA (27:73) (v/v), coluna: Shiseído CAPCELL PAK Cw UG120 3pm 2,0 x 100 mm), e frações correspondendo a cada de 954 m/z [M +H]+ e 968 m/s |M+H]+ foram combinadas e concentradas para secura para obter 14 mg de composto 3 e 3,1 mg de composto 4, Propriedades físico-químicas de composto 3 Peso molecular: 954,16 Fórmula molecular: C^HyyNuOn Solubilídade; facilmente solúvel em metanol, butanol, álcool isopropílico, e sulfóxido de dimetila; e insolúvel em acetato de etila, clorofórmio e hexano.
Hidrólise ácida: quando bidrolisado com 6-ácido clorídrico normal a 110°C por 24 horas, composto 3 conferiu ácido aspártico, valina, treonina, alotreonina e alanina na relação molar de 1: 2:1:1: 2.
Espectro de ressonância magnética nuclear de próton: mostrado na figura 1 Espectro de ressonância magnética nuclear C-13: mostrado na tabela 15.
Das propriedades físico-químicas acima mencionadas e resultados da análise espectral, a estrutura do novo composto 3 foi identificada como se segue: Fórmula 5 Propriedades físico-químicas do composto 4 Peso molecular: 968,19 Fórmula molecular: C.45H>ii.N|iOi2 Solubilidade: facilmente solúvel em metanol, butanol, álcool isopropilico, e sulfóxido de dimetila; e insolúvel em acetato de etila, clorofórmio e hexano.
Hidrólise ácida: quando hidrolisado com 6-ácido clorídrico normal a 110°C por 24 horas, composto 4 conferiu ácido glutâmico, valina, treonina, alotreonina e alanina na relação molar de 1:2:1:1:2, Espectro de ressonância magnética nuclear de próton (DMSO-d6): mostrado na figura 2 Espectro de ressonância magnética nuclear €-13 (DMSO-d6): mostrado na tabela 15, Das propriedades físico-químicas acima mencionadas e resultados da análise espectral, a estrutura do novo composto 4 foi identificada como se segue: Fórmula 6 Tabela 15: Dados de mudança química por ressonância magnética nuclear ΟΙ 3 para composto 3 e composto 4 GHPD: ácido I5-guanidino-3-hidroxipentadecanóíco Exemplo 7 de Avaliação Avaliação da atividade de induzir resistência à doença em plantas de cada composto 3 e composto 4 A atividade de induzir resistência à doenças em plantas de cada de composto 3 e composto 4 foi avaliada na mesma maneira como no exemplo 1 de avaliação adotando o método executado no exemplo 1 de avaliação, isto é, o método no qual a responsividade do elicitor de células de salsa cultivadas foi medida pela detecção de fitoalexina usando fluorescência. Os resultados são mostrados na Tabela 16.
Tabela 16: Resultados da detecção de fitoalexina Dos resultados mostrados na tabela 16, é observado que cada do composto 3 e composto 4 melhoram a responsividade do elicitor de células cultivadas de salsa como a substância existente tendo uma atividade de induzir resistência à doença em plantas e então tem uma atividade de induzir resistência à doença em plantas.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
Como descrito acima em detalhes, as cepas de tal gênero Paenibacillus da presente invenção, tais como Paenibacillus sp. BS-0048, Paenibacillus sp. BS-0074, Paenibacillus polymyxa BS-105 e Paenibacillus sp. BS-0277 são muito eficazes em controlar várias doenças em plantas e então são úteis como controladores. Além disso, é observado que essas cepas do gênero Paenibacillus, composto l (Fusaricidin A) e composto 2 (Fusaricidin B), as quais são substâncias bem conhecidas, e novos compostos 3 e 4 têm uma atividade de induzir resistência à doenças em plantas e exibem efeito no controle também de doenças em plantas as quais tem sido consideradas incontroláveis. Além disso, tem sido revelado que já que essas cepas do gênero Paenibacillus e esses compostos têm uma atividade de induzir resistência à doença em plantas, eles podem proteger plantas de infecções com patógenos de plantas.

Claims (13)

1. Composição compreendendo esporos de cepa que pertence ao gênero Paenibadilus, caracterizada pelo fato de que a cepa é de Paenibadilus poiymyxa BS-0105 tendo número de acesso IPOD FERM BP-10379, e um veículo agrícola aceitável que não resulte em uma mera diluição dos ditos esporos da dita cepa de Paembacillus poiymyxa.
2. Controlador de doença em plantas, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição como definida na reivindicação 1.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou um controlador de doença em plantas de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que controla doenças em plantas provocadas por cepas de fungos que pertencem ao gênero Coietotrichum ou cepas de fungos que pertencem ao gênero Clomerella.
4. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou um controlador de doença em plantas de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que controla antracnose de plantas do CucurhiiacetL
5. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou um controlador de doença em plantas de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que controla antracnose de morango.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou um controlador de doença em plantas de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que controla doenças em plantas provocadas por bactérias Gram-negativas exibindo uma atividade de induzir resistência à doença cm plantas.
7. Composição ou controlador de doença em plantas, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as bactérias Gram-negativas são cepas que pertencem ao gênero Pseitdomonas.
8. Composição ou controlador de doença em plantas, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que controla praga bacteriana de plantas da família Cucurbitacea provocada por cepas de bactérias que pertencem ao gênero Pseudomonas.
9. Composição de acordo com as reivindicação 1 ou um controlador de doença em plantas de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que controla doenças em plantas provocadas por cepas de fungos que pertencem ao gênero Fusarium, o dito controle sendo através de uma atividade de induzir resistência à doença em plantas.
10. Composição de acordo com as reivindicação 1 ou um controlador de doença em plantas de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que controla doenças em plantas quando usados para tratamento da folhagem, zona de enraizamento e/ou de semente.
11. Método de controlar doenças em plantas, caracterizado pelo fato de aplicar uma cepa que pertence ao gênero Paenibacillus, que é Paenibacillus polymyxa BS-0105 tendo número de acesso IPOD FERM BP-10379, ou uma composição ou controlador de doença em plantas conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 em uma planta.
12. Método de controlar doenças em plantas, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a cepa que pertence ao gênero Paenibacillus, que é Paenibacillus polymyxa BS-0105 tendo número de acesso IPOD FERM BP-10379, ou a composição ou controlador de doença em plantas conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 exibem atividade de induzir resistência à doença em plantas.
13. Método de controlar doenças em plantas, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a cepa que pertence ao gênero Paenibacillus, que é Paenibacillus polymyxa BS-0105 tendo número de acesso IPOD FERM BP-10379, ou a composição ou controlador de doença em plantas conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 exibem atividade de induzir resistência à doença em plantas, sem exibir atividade microbiana direta.
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