LT4785B - Biologinės medžiagos kovai su šaknų ligomis - Google Patents

Description

Šis išradimas yra skirtas biologinei kovai su viena ar daugiau Rhizoctonia, Gaeumannomyces graminis ir Pythium sukeliamomis augalų šaknų ligomis, naudojant fluorescentinius Pseudomonas spp. kamienus ir ypač kamienus, kurie pasižymi unikalia smulkiagrūdžių kultūrų šaknų kolonizavimo geba, ir biologinės kovos su smulkiagrūdžių kultūrų šaknų puviniu ir ligomis bei velėnos žolių “iššutimo dėmėmis aktyvumu. Išradimas taip pat susijęs su atskyrimu ir identifikavimu biologinei kovai skirtų kamienų, turinčių savyje biosintezės vietas (lokusus), kurios koduoja antibiotiko 2,4diacetilflorogliucinolio gamybą, bei turi unikalų genotipą, įrodytą charakteringu juostiniu modeliu. Išradimas taip pat yra susijęs su kamienais, papildomai turinčiais biosintezės vietas, kurios koduoja antibiotiko fenazino1-karboksirūgšties, kuri stabiliai fiksuojama genome, gamybą. Be to, išradimas apima transgeninių kamienų gavimo būdą ir jų pritaikymą kovai su augalų šaknų ligomis.

Rhizoctonia, Pythium ir Gaeumannomyces graminis sukeliamos šaknų ligos kenkia svarbių kultūrų gamybai visame pasaulyje, mažina kultūrą derlingumą ir dėl to lemia žymius ekonominius nuostolius. Šaknų iššutimo” liga, sukeliama dirvožemio grybelio Gaeumannomyces graminis (Gg) (ypač rūšies tritici (Ggt)), Rhizoctonia šaknų puvinys, sukeliamas Rhizoctonia solani ir R. oryzae, ir Pythium šaknų puvinys, sukeliamas bet kurios ar keleto Pythium rūšių (ypač Pythium ultimum ir P. irregulare), yra svarbiausios smulkiagrūdžių kultūrą kaip antai, kviečią miežią rugią kvietrugių šaknų ligos visame pasaulyje.

Rhizoctonia - bazidiomikotino klasės grybeliai sukelia daugelio pasaulyje auginamų maistinią pluoštinių ir dekoratyvinių augalą įskaitant smulkiagrūdes kultūras, velėnos žolę, šparagus, kukurūzus, cukrinius runkelius, pomidorus, bulves, žirnius, ryžius, pupas, soją, braškes, prieskonius ir medvilnę, šaknų bei stiebo puvimą. Smulkiagrūdžių kultūrų šaknų puvimas, sukeltas Rhizoctonia, stebimas JAV šiaurės vakarų dalyje, Australijoje, Pietų Afrikoje, sutinkamas vidutinio klimato regionuose, kuriuose šios kultūros auginamos, ypač neįdirbtoje dirvoje (tiesiogiai sodinant eilutėmis). Puvimas, sukeltas Rhizoctonia solani AG8, pasireiškia rusvais užuomazginių bei išvystytų šaknų kenksmingais pažeidimais, kurie apsupa ir nukerta šaknis. Augalai tokiomis sutrumpintomis šaknimis lieka sunykę ir galų gale žūva, nesukrovę viršūnės. Liga dengia augalus dėmėmis. Todėl ji įvairiai vadinama - plikoji dėmėtoji, purpurinių dėmių duobelinė liga, miežių neūžauga. Tarp visų siti u Iki ag rūdžių kultūrų miežiai yra labiausiai paveikiami R. solani AG8. Rhizoctonia oryzae užkrečia dygstančių sėklų gemalus, stabdo dygimą ir riboja užuomazginių šaknų formavimą iki vienos ar dviejų kai tuo tarpu sveiki pasėliai išvysto penkias ar šešias užuomazgines šaknis. Pastarųjų dviejų Rhizoctonia rūšių drauge su Rhizoctonia cerealis ir galbūt kitomis Rhizoctonia rūšimis, poveikį lemia dirvožemis, sėjos sistemos, piktžolių apdorojimo praktika ir galbūt iki šiol nenustatyti kiti veiksniai.

Dirvoje besiformuojantis patogeninis Pythium spp. kompleksas apima grybelių priklausančių labiausiai gajiems mikrobiniams kolonistams agrokultūriniame dirvožemyje, grupę. Nustatyta, kad beveik visose pasaulio kultivuotose dirvose yra mažiausiai viena, dvi, trys ar net dešimt Pythium sporų rūšių. Pythium - oomicetės grybelių.klasės narys, kaip Ar Rhizoctonia, faktiškai veikia visus maistinius, pluoštinius ir dekoratyvinius augalus visame pasaulyje (jų pavyzdžiai pateikti aukščiau). Pythium žala smulkiagrūdžiams prasideda gemalo infekcija ir su tuo susijusiu vystymosi stabdymu, o po to smulkiųjų šoninių (šalutinių) šaknelių ir plaukelių irimu. Pythium šaknų puvinio paveikti augalai įgyja menkai tręšiamų augalų išvaizdą, nes liga, ardomai veikdama šalutines šakneles ir plaukelius, sumažina šaknų absorbcinę galią. Egzistuoja kelios Pythium rūšys, gebančios pulti javus, dygstančių sėklų gemalus, šaknų galiukus ir smulkiąsias šakneles arba ir visą jautrų ir paprastai jauną arba meristeminį audinį.

Plačiai paplitusias smulkiagrūdžių kultūrų ir velėnos žolių ligas sukelia *

dirvožeminis grybelis Gaeumannomyces graminis (Gg), priklausantis ascomycotina grybelių klasei. Šios ligos lemia žymius kultūrų derliaus bei· ekonominius nuostolius. “Iššutinimas”, Gg varianto tritici (Ggt) sukeliama liga, pasireiškia pasaulio regionuose, kur auginami kviečiai. Tai, galimas dalykas, svarbiausia kviečių ir kitų smulkiagrūdžių kultūrų šaknų liga. Kviečių iššutimo simptomai: išilginiai šaknies pakenkimai, paaštrėjimo atvejais-visa ₃ LT 4785 B šaknis pajuodusi, grybelis stiebu migruoja augalo vainiko link, kur prasideda vainiko šaknys, ir į želmenis. Sunkiai užkrėsti kviečiai laukuose nustatomi pagal jų pabalusias viršūnes, kai šaknų vainiką užkrėtęs grybelis nutraukia vandens gabenimą į viršūnę ir augalas pirmo laiko žūva. Tokiomis aplinkybėmis galima netekti iki 50 % derliaus. Iki šiol nėra atsparių kultivuotų * kviečių veislių, o registruoti fungicidai ne visada efektyvūs. Be to, kviečių

- augintojai kaskart labiau skatinami silpninti įdirbimą, siekiant kovoti su erozija. Tokia praktika skatina iššutimą ir kitas šaknų ligas. Nors tik kviečiai yra itin jautrūs “iššutimo” grybeliams, daugelis ir kitų Gramineae - miežiai, rugiai, kvietrugiai ir kt. taip pat gali būti užkrėsti.

Paprastai su iššutimu kovojama kultūrų sėjomaina ir žemės įdirbimo normatyvais, t.y. veiksmais, mažinančiais patogeno kenksmingumo potencialą. Tačiau, kadangi ilgalaikė sėjomaina neekonomiška, o žemės įdirbimas artina eroziją, javų auginime einama link mažesnio įdirbimo intensyvumo ir dviejų ar trijų kviečių derlių prieš pertrauką. Abi pastarosios priemonės skatina “iššutimą”. Iki šiol genetiniai atsparumo šiai ligai šaltinį kviečių sandaroje nežinomi. Tuo tarpu cheminės kovos būdai yra rib^ Todėl, siekiant stiprinti žemdirbystę, padaryti ją mažiau priklausančią nuo cheminių pesticidų būtina vystyti kitokį požiūrį į kovą su “iššutimu” ir kitorn^s dirvožemio kilmės ligomis.

Kiti Gg grybeliai, pvz. Gaeumannomyces graminis variantas avenae (Gga) užkrečia avižas ir žolę “iššutimo” dėmių pavidalu, labiau pastebimu velėnos žolėje - smilgose. Gaeumannomyces graminis variantas graminis (Ggg) užkrečia kai kurias žoles ir, manoma, sukelia ryžių vainiko apvalkalo puvimą.

Visos kultūrinės dirvos tam tikru laipsniu pačios priešinasi Ggt ir f kitiems dirvos patogenams. Tai vadinama “bendruoju slopinimu” (N. Gerlagh. Netherlands Journal of Plant Pathology 74; (Suppl. 2) 1-97 (1968)) arba “bendruoju pasipriešinimu” (D. Hornby, Annual Review of Phytopathology, Annual Revievvs Ine. Palo Alto, CA (1983), pp. 65-85). “Bendrąjį pasipriešinimą” apsprendžia bendras mikroorganizmų aktyvumas dirvoje. Be to, Ggt grybelio specifinis slopinimas (biologinė kova, žinoma kaip “iššutimo” slopinimas) - (TAD) tam tikromis sąlygomis papildo “bendrąjį slopinimą ir lemia praktiškai visišką “iššutimo” kontrolę. “Iššutimo slopinimas (TAD) yra natūrali biologinė kova su liga, apibūdinama spontanišku ligos poveikio sumažėjimu ir jautrių Ggt grybeliams paplitusių monokultūrų (pvz. kviečių, miežių) derlingumo padidėjimu. Pirmą kartą TAD (iššutimo slopinimas) buvo pastebėtas daugiau kaip prieš 50 metų. Dabar šis reiškinys pripažįstamas pasaulinio masto fenomenu. Pažymėtinas TAD požymių panašumas plačiame dirvožemių rūšių, klimato, agronominių sąlygų, kuriose kultivuojami kviečiai, miežiai ir kitos smulkiagrūdės kultūros, diapazone. Lauko tyrimai aiškiai parodė, kad visur TAD vystosi pagal vieną ir tą patį modelį, reikalaujantį nepertraukiamos smulkiagrūdinių kultūrų kultivacijos, kai esama “iššutimo” patogenų. Dirvos tipas ir ankstesnė sėjimo istorija veiksniai, vien tik moduliuojantys TAD apimtį ir vystymosi greitį. Nepaisant TAD fakto, daugelis augintojų vengia atskirų monokultūrų dėl galimų žymių nuostolių. Vis dėlto, kaip nustatyta, TAD leidžia tikėtis derliaus padidėjimo ir jo stabilumo, kol pasirinkta monokultūra auginama:'Praktinis TAD reiškinio panaudojimas - tai galimybė natūraliai biologiškai:kovoti su “iššutimu”. Vis dėlto empiriškai reiškinį naudojant, būtina nustatyti ir pritaikyti TAD sukeliančius mechanizmus. Iki šio laiko buvo apsiribojama bendrais reiškinio aprašymais, o TAD išsivystymo priežastys dar nėra pilnai suprantamos. Panašus iššutimo lopų, sukeltų Gga, nykimas atsiranda įsišaknijusioje velėnoje.

TAD buvo plačiai tirtas, turint tikslą nustatyti natūralaus “iššutimo” slopinimo mechanizmus. Labiausiai apibendrintos teorijos, aiškinančios TAD fenomeną, remiasi mikrobiologinės dirvožemio būsenos pakitimais, priešiškų bakterijų susidarymu, grybelių populiacijos ir patogenezės pakitimais bei gynybinių grybelių buvimu (D. Hornby in “Take-AII Decline: A Theorist’s Paradise”, Soil-Borne Plant Pathogens, Ed. B. Schippers and W. Gams, Academic Press, Nevv York (1979), pp. 133-156 ir D. Hornby, Annual Revievv of Phytopathology, Annual Revievvs Ine., Palo Alto, CA (1983), pp. 65-85). Šiuos aiškinimus apžvelgė ir apibendrino Homby. Jis priėjo išvados, kad pasauliniu mastu negali būti vieno TAD mechanizmo. Ši pažiūra buvo priimta visų, dirbančių ligas slopinančių dirvožemių srityje.

Plačiausiai paplitęs TAD mechanizmo aiškinimas yra pagrįstas mikrobų tarpusavio sąveika: tarp “iššutimo” patogenų ir specifinių priešiškų šaknų mikroorganizmų (R.J. Cook and A.D. Rovira, Soil Biology and Biochemistry 8: 269-273 (1976)). Mikrobų pasipriešinimo vaidmenį slopinant Ggt patvirtina eilė pavyzdžių Pvz., Ggt slopinimą galima perduoti, įvedus į “iššutimui” imlią dirvą nedidelį (1-10 tūrio %) TAD dirvožemio kiekį. Be to, ligos slopinimo efektas TAD dirvožemyje panaikinamas bandinio pasterizavimu (esant 60 °C, 30 min.) drėgnu karščiu apdorojant metilo bromidu, ar auginant kultūras, kurios nėra patogeno šeimininkai.

Tiriant mikrobų pasipriešinimą TAD procese, daug pastangų skiriama specifinių Ggt-priešiškų mikroorganizmų nustatymui, jų perkėlimui į dirvą, siekiant atgaminti slopinimą. Plati ištirtų mikroorganizmų įvairovė parodė, kad specifiniai mikroorganizmų kamienai skiriasi įvairiuose TAD dirvožemiuose? Cook ir Rovira (1976) padarė originalią prielaidą, kad tarp priešiškų¹’ mikroorganizmų svarbiausią vaidmenį TAD procese vaidina fluorescentinės⁷ Pseudomonas spp. rūšys. JAV patente Nr. 4456684 aprašomi Pseudomonai kamienai, kurie slopina ligas, sukeltas “iššutimo” ir kitų Gg grybelių Pateritef '1,5.

pateikti kamienų atrankos ir panaudojimo būdai.

Daugelis labiausiai efektyvių kamienų gamina antibiotiką 2,4diacetilflorogliucinolį (Phl) (C. Keel ir kt., Applied and Environmental Microbiology 62: 552-563 (1996)). Phl yra fenolio metabolitas, pasižymintis aktyvumu prieš daugelį bakterijų virusų ir grybelių įskaitant “iššutimo” patogeną (L.S. Thomashovv and D.M. VVeller, In: G. Stacey and N.T. Keen, Plant-microbe Interactions, vol. 1, Chapman & Hali, Ltd. London, pp. 187-236 (1996)). J.M. Raaijmakers ir kt. (Applied and Environmental Microbiology 63: 881-887 (1997)) praneša, kad Phl gaminančios fluorescentinės

Pseudomonas spp. buvo aptiktos ant kviečių šaknų trijose TAD dirvose, JAV, Vašingtono valstijoje. “Iššutimui” imliose dirvose, esančiose arti TAD laukų Phl gaminančios fluorescentinės Pseudomonas spp. neaptiktos, ar aptikus jų tankis buvo 40 kartų menkesnis, negu TAD dirvose. Nors mikrobinių biologinės kovos agentų, kaip praktinių priemonių kovoti su dirvožemyje esančiais patogenais, naudojimo perspektyva palanki ir daug žadanti, visi publikuoti ar patentuoti biologinės kovos su “iššutimu” agentai pasižymi nestabilaus veikimo trūkumu. Be to, kiekvienas jų yra specifinis tik tam tikrai dirvai ir nepajėgus atkartoti stabilios kovos lygį TAD dirvoje. Joks iki šiol tirtas, mikroorganizmas nepademonstravo laukiamos iš kamieno gebos kovoti su liga kaip TAD atvejais. Dėl to nenuostabu, kad joks biologinės kovos su “iššutimu” agentas nebuvo pardavinėjimas. Vadinasi,yra reikalingos biologinės kovos su “iššutimu” efektyvių agentų atkartojančių TAD dirvos slopinimą, nepriklausančių nuo dirvos tipo ir stabiliai veikiančių paieškos.

“Iššutimo” ir Rhizoctonia šaknų puvinio patogenai, kolonizuojantys augalus - šeimininkus, gyvena audiniuose hifos ar grybienos pavidalu. Pythium rūšys gyvena dirvožemyje storasienių oosporų ar sporangijų pavidalu, susidariusių naudojant augalo maistines medžiagas parazituojant. Visada visos trys ligos išsivysto tuo pat metu tuose pačiuose augaluose, nors viena šaknų liga gali dominuoti.

Nors Pythium rūšys egzistuoja visose smulkiagrūdėmis kultūromis apsėtose dirvose, Pythium žala šioms kultūroms (pasėlių augimo ir stiprumo stabdymas) yra didžiausia drėgname dirvožemyje, turinčiame savo sudėtyje daug molžemio ir mažesnį pH, negu 6,0. Leidžiant javams “savaime (kai pjūties metu sėklos išbarstomos dirvos paviršiuje) sudygti ir augti sudorotame lauke, 1-2 dienas prieš naują sėją apdorojant herbicidais, pvz., glifosatu (Round-up®, Monsanto), naikinamos piktžolės, tačiau tai skatina Pythium ir Rhizoctonia šaknų puvinį. Kai kviečiai sėjami į prieš tai nuimto kviečių derliaus ražienas, drėkinant dirvos paviršių purkštuvu ir paliekant nepašalintus šiaudus, stimuliuojamos visos trys šaknų ligos.

Prieš daugelį kviečių, miežių ir kitų kultūrų ligų kovojama auginant atsparių patogenams kultūrų veisles. Tačiau pastaroji priemonė efektyvesnė' kviečių miežių rugių ir kt. lapų, o ne šaknų susirgimams. Vienintelė žinoma priemonė kovoje su “iššutimu” ir Rhizoctonia šaknų puviniu yra tolimas diploidinis giminaitis Daysapyrum villosum, tačiau jis nebuvo naudojamos dėl genų pernešimo sunkumų per tokį taksonomiškai didelį atstumą. Šiuo metu nėra prekiaujama kviečiais, miežiais, rugiais, ar kvietrugiais, atspariais “iššutimui”, Rhizoctonia ir Pythium sukeliamam šaknų puviniui.

Biologinės kovos su augalų grybeliniais patogenais būdai yra paremti Pseudomonas bakterinių kamienų pasižyminčių specifiniu patogenams « aktyvumu, naudojimu. JAV patentas Nr. 4456684 aprašo Pseudomonas kamienus, kurie slopina ligą, sukeltą “iššutimo”ir kitų Gg grybelių. Mikrobų antagonizmo tyrimai “iššutimo” slopinimo (TAD) procese, t.y. natūralioje biologinėje kovoje su “iššutimu” (apibrėžiamoje kaip spontaninis ligos slopinimas ir jautrių Ggt poveikiui monokultūrų (kviečių miežių) derlingumo padidėjimas), yra nukreipti į specifinių Ggt-antagonistinių mikroorganizmų identifikavimą, jų įvedimą į dirvą patogenų slopinimui sukelti. Dauguma labiausiai efektyvių kamienų gamina antibiotiką 2,4-diacetilflorogliucinolį (Phl) (C. Keel ir kt., Applied and Environmental Microbiology 62: 552-563 (1996)).

J. Raaijmakers ir kt. (Applied and Environmental Microbiology 63: 881-881 I (1997)) praneša aptikę Phl gaminantį fluorescentinį Pseudomonas sppv , | kviečių auginamų trijose JAV Vašingtono valstijos TAD dirvose, šaknyse, s r

Nors apskritai mikrobiniai biologinės kovos agentai yra perspektyvi T* esančių dirvoje patogenų kontrolės priemonė, visi publikuoti ar patentuot t biologinės kovos su “iššutimu” agentai veikia nestabiliai (nevienodų .1 aktyvumu), naudotini tik tam tikrose dirvose, neatkartoja kontrolės lygio, esančio TAD dirvoje.

JAV patentas Nr. 4647533 aprašo Pseudomonas kamienus, kurie slopina Pythium sukeltas ligas. Pseudomonas kamienų bakterijos yra Rhizoctonia solani arba Pythium ultimum inhibitoriai medvilnėje (žiūr. JAV patentą Nr. 5348742, Howel ir kt.). Nurodoma, kad agentas Bacillus sp.

L324-92 tuo pat metu slopina Gaeumannomyces graminis, Rhizoctonia ir Pythium rūšis (Kim ir kt. Phytopathology 87: 551-558 (1997)). Vis dėlto joks atskiras Pseudomonas kamienas, galintis efektyviai naikinti visus tris patogenus, šiame patente neaprašomas.

Mes išskyrėme unikalius biologinius agentus, skirtus kovoti su ligomis, sukeliamomis smulkiagrūdėse kultūrose ir velėnos žolėje dirvožemyje esančių Gaeumannomyces graminis (Gg) grybelių Išradimas apima unikalius fluorescentinių Pseudomonas rūšių (spp.) unikalius kamienus, kurie slopina (sulaiko, stabdo plitimą, sumažina aštrumą) ligas, sukeltas Gg (tokias, kaip “iššutimas”). Kamienai, naudojami mažomis dozėmis, kolonizuoja šaknis, intensyviau negu kitos žinomos biologinės kovos su Gg medžiagos. Be to, siūlomų kamienų kolonizavimo geba ir biologinės kovos, aktyvumas nepriklauso nuo dirvos tipo.

Išradime pateiktos biologinės kovos medžiagos realizuoja griežtesnę' kovą, negu iki šiol žinomos biologinės kovos su Gg sukeliamomis ligomis (pvz.“iššutimu”) medžiagos. Pateikti kamienai unikalūs savo sugebėjimu atkartoti biologinės kovos, esančios TAD dirvose, lygį.

Iš vienos pusės, išradime pateikti biologinės kovos agentai - tai fluorescentinių Pseudomonas spp. rūšių kamieno biologiškai grynos kultūros, turinčios biosintezės vietą (lokus), koduojančią antibiotiko 2,4diacetilflorogliucinolio, kuris turi unikalų genotipą, gamybą (tai rodo charakteringas atsitiktinis sustiprintas polimorfinės DNR profilis (toliau tekste jis bus žymimas RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)), rodo biologinį aktyvumą 10-1000 kartų mažesnėmis dozėmis, lyginant su iki šiol žinomais “iššutimą” slopinančiais mikroorganizmais, ir pasižymi šaknų kolonizavimo gebos pranašumu (tai rodo 10-1000 kartų didesnis populiacijos tankis). Mes nustatėme, kad išskirti išradime pateikiamų kamienų pavyzdžiai pasižymi šaknų kolonizavimo geba, kuri net septyniuose auginimo cikluose pasireiškia populiacijos tankiu, siekiančiu 10⁵ CFU (kolonijos sudarymo vienetų) vienam gramui šaknų įskaitant rizosferos dirvožemį. Tokia šaknų kolonizavimo geba yra beprecedentė. Naujieji kamienai veikia nepriklausomai nuo dirvožemio tipo.

Išradimas taip pat apima šių unikalių kamienų išskyrimo ir identifikavimo būdus. Bakterijų tyrimo protokolas yra pateiktas 6 figūroje. Toliau atrankos būdas yra aprašytas smulkiai.

Kitas išradimo aspektas - unikalių kamienų ar kompozicijų turinčių kamienus, pritaikymas biologinei kovai su Gaeumannomyces graminis sukeliamomis ligomis. Pateikti išradime kamienai, panaudoti sėklų dirvos, vagų apdorojimui arba laistymui, lauko sąlygomis slopina Gg ir demonstruoja beprecedentį slopinimo stabilumą, ekvivalentišką natūraliam TAD (žiūr. 1 lentelę), kas iki šiol nebuvo stebima. Be to, kadangi “iššutimas” slopinamas mažomis dozėmis, kamienų auginimo ir pritaikymo kaina 10-1000 kartų žemesnė, negu kitų vartojamų biologinės kovos su “iššutimu” agentų. Kamienas lemia ir natūralų TAD. Todėl akivaizdu, kad laukui turi pakakti jų vienkartinio panaudojimo. Tuo tarpu vartojant visus kitus žinomus biologinės kovos agentus, “iššutimas” reikalauja pakartotinio jų panaudojimo.

Išradimo objektas yra pateikti unikalius fluorescentinių Pseudomonas spp. kamienus, intensyviau kovojančius su Gg sukeltomis ligomis, negu kiti žinomi ir biologinei kovai naudojami kamienai.

Kitas išradimo objektas - pateikti biologinės kovos kamienus, pasižyminčius šaknų kolonizavimo geba (aukštesniu šaknų populiacijos tankiu, platesniu poveikiu), kuri viršija bet kurio biologinės kovos su “iššutimu” agento kolonizavimo gebą. Pastaroji savybė itin vertinga, nes yra i

žinoma, kad šaknų ligų tokių kaip iššutimas, slopinime kolonizavimo gebos

-z si padidėjimas lemia didesnį ir stabilesnį aktyvumą biologinėje kovoje.

Kitas išradimo objektas - pateikti dirvos tipo neįtakojamus agentus, skirtus kovai su smulkiagrūdžių kultūrų ir velėnos žolių ligomis, sukeltomis Gaeumannomyces graminis.

Dar vienas išradimo objektas - pateikti kamienų pagal išradimą atrankos būdą, pagrįstą RAPD analize (žiūr. aukščiau) pagal charakteringą juostinį modelį.

Ir dar vienas išradimo objektas - pateikti biologinės kovos su smulkiagrūdžių kultūrų “iššutimu” ir velėnos žolių dėmėtumu būdą, kuriame naudojamasi išradime pateiktais kamienais ir agrokultūrinėmis kompozicijomis, kuriose yra šie kamienai.

Kiti išradimo objektai ir pranašumai išryškės tolesniame aprašyme.

Antrame išradimo įgyvendinime mes pagaminome transformuotų fluorescentinių Pseudomonas spp. kamienų grynas biologines kultūras, turinčias biosintezės vietas (lokus), kurios koduoja antibiotiko fenazino-1karboksirūgšties gamybą. Ši medžiaga stabiliai įvesta į genomą ir slopina ligas, sukeltas dirvoje esančios Rhizoctonia patogeno. Kamienai, be

Rhizoctonia sukeltų ligų pasirinktinai slopina dar ir Pythium arba Gaeumannomyces graminis (Gg) sukeltas ligas, o taip pat turi galimybę kovoti su visomis trimis ligomis.

Išradimo antrojo įgyvendinimo biologinės kovos agentai gaunami stabiliai įvedant biosintezės vietas (lokus) fenazino-1-karboksirūgšties susidarymui į fluorescentinio Pseudomonas spp. kamieno genomą. Pastarasis kamienas, turintis biosintezės vietas (lokus), koduoja antibiotiko

2,4-diacetilflorogliucinolio susidarymą, žymimas kaip išradimo pirmojo įgyvendinimo kamienas. Jo unikalų genotipą patvirtina RAPD (atsitiktinės sustiprintos polimorfinės DNR) profilis. Jam būdinga pranašesnė kolonizavimo geba, kuri bus aptariama toliau.

Transformuotų kamienų rūšiavimas, siekiant atrinkti kamienus, aktyviai slopinančius Rhizoctonia sukeliamas ligas, atliekamas naudojant šiltnamio biologinius bandymas. Šiltnamio bandymai pasirinktinai gali būti atliekami atrenkant transformuotus kamienus, taip pat efektyvius prieš ligas, sukeltas Gaeumannomyces graminis ar Pythium.

Prieš šiltnamio biologinius bandymus pasirinktinai atliekamas Rhizoctonia kultūros slopinimas in vitro transformuotu kamienu.

Vadinasi, antrojo išradimo įgyvendinimo transformuoti biologinės kovos agentai tinka kovai su Rhizoctonia sukeltomis ligomis ir, pasirinktinai, ligomis, sukeltomis Pythium ar Gaeumannomyces graminis. Mes nustatėme, kad pavyzdiniai išradime pateikti transformuoti kamienai Rhizoctonia šaknų puvinį slopina labai mažomis dozėmis (iki 10² koloniją formuojančių vienetų vienai sėklai; toliau šie vienetai - “colony forming units” bus žymimi CFU). Be to, mes nustatėme, kad išradime pateikti kamienų pavyzdžiai papildomai išlaiko pirmojo išradimo įgyvendinimo sugebėjimą slopinti kitas šaknų ligas, t.y. ligas, sukeltas Gaeumannomyces graminis arba Pythium. Taigi, kamienai pagal išradimą yra aktyvūs slopinant visas tris augalų šaknų ligas (sukeliamas Rhizoctonia, Pythium ir Gaeumannomyces graminis).

Dar vienas išradimo aspektas - unikalių kamienų ar kompozicijų turinčių kamienus, panaudojimas biologinei kovai su augalo šaknų ligomis. Lauko sąlygomis, kamienais apdorojus sėklą, dirvą, vagas dirvoje arba

Π LT 4785 B laistant, unikalūs kamienai pagal išradimą sugeba slopinti ligas, sukeltas Rhizoctonia ir pasirinktinai gali slopinti ligas, sukeltas Pythium arba Gaeumannomyces graminis.

Be to, šio išradimo pateikti biologinės kovos agentai gali būti panaudojami biologinės kovos mišinių sudarymui. Tokio mišinio sudėtyje yra bent vienas išradime pateiktas transgeninis kamienas. Kiti mišinio komponentai - vienas ar keli kiti biologinės kovos kamienai (pvz. papildomas kamienas pagal šio išradimo pirmąjį įgyvendinimą ir kiti biologinės kovos kamienai). Išradimas pateikia agrokultūrines kompozicijas, savo sudėtyje turinčias bent vieną išradime pateiktą kamieną ir tinkančias kovai su bent viena augalų šaknų liga.

Likusieji išradimo objektai ir privalumai išryškės toliau pateiktame aprašyme.

Išradimas paaiškinamas brėžiniais, kur:

J;®'·

Fig. 1 - vaizdas, rodantis P. fluorescens Q8r1-96, ML4.9-96, L5.1-96' kamienų juostinius modelius (RAPD). Pirmasis takas žymi 1-kb laiptelį kaip ,· «-a · standartą, palyginimui.

Fig. 2-4 rodo išradime pateikto P. fluorescens Q8r1-96 kamieno kolonižavimo gebą, lyginant su P. fluorescens M1-96 ir Q2-87 kamienais (nesusie: /.M tais su išradimu) Ouincy, Lind ir Moses Lake plėšininėse dirvose, atitinkamai.

Fig. 5 rodo išradime pateikto P. fluorescens Q8r1-96 kamieno kolonizavimo gebą Ouincy, Lind ir Moses Lake plėšininėse dirvose.

Fig. 6 rodo fenazino biosintezės vietos (lokus), surištos su tac promotoriumi, fizikinį žemėlapį. Strėlėmis nurodyti genai, koduojantys fenazino biosintezės fermentus, ir jų genetinio kodo skaitymo kryptys. Simbolis P_fac žymi tac promotoriaus padėtį ir orientaciją.

Fig. 7 rodo pUTKm::phz plazmides fizikinį žemėlapį. Pakreiptos linijos žymi fenazino biosintezės genus. Kanamicino atsparumo determinanto transkripcijų padėtis ir kryptys atvaizduotos atviros dėžutės pavidalu. Maži langeliai, pažymėti “X“ rodo Tn5 19-bp baigmės galų padėtį.

Išradime siūlomi biologinės kovos agentai. Išradime siūlomi biologiniai agentai turi savo sudėtyje bent vieną biologiškai gryną fluorescentinių Pseudomonas spp. kamieną. Pirmajame išradimo įgyvendinime šis kamienas charakterizuojamas tokiais būdingais bruožais: kamienas turi biosintezės vietą (lokus), kuri koduoja 2,4diacetilflorogliucinolio susidarymą; kamienas turi unikalų genotipą, kaip rodo charakteringas, žemiau smulkiai aprašytas juostinis modelis, ir Fig. 1;

I kamienas slopina laukuose auginamų smulkiagrūdžių kultūrų ar velėnos žolių ligas, sukeltas Gg; kamieno kolonizavimo geba apibūdinama didesniu populiacijos tankiu ir plataus kolonizavimo aktyvumu, lyginant su žinomais Gg slopinančiais kamienais.

Kamienui būdingos šios papildomos ypatybės: biologinės kovos aktyvumas (ligos slopinimo geba) ir šaknų kolonizavimo geba, nepriklausoma nuo dirvos tipo; ir/arba smulkiagrūdėse kultūrose kamienas slopina Gg tokiu pat biologinės kovos lygiu kaip ir TAD sąlygomis išsivystęs lygis, t.y. jis atkartoja biologinės kovos lygį, stebimą iššutimo slopinimo (TAD) dirvoje. Pirmojo išradimo įgyvendinimo P. fluorescens kamienų pavyzdžiai: Q8r1-96, ML4.9-96 ir L5.1-96.

Antrajame išradimo įgyvendinime biologinės; kovos agentai turi savo sudėtyje bent vieną biologiškai gryną fluorescentinių Pseudomonas spp. kamieną, kuris charakterizuojamas tokiais būdingais bruožais: kamienas turi biosintezės vietas (lokus), kurios koduoja fenazino-1-karboksirūgšties, stabiliai įvestos į jo genomą, susidarymą; kamienas išlaiko pirmojo įgyvendinimo kamieno biosintezės vietas (lokus), kurie koduoja 2,4diacetilflorogliucinolio susidarymą; kamienas slopina ligas, sukeltas dirvožemio Rhizoctonia patogeno. Pasirinktinai kamienas slopina ligas, sukeltas Pythium arba ligas, sukeltas Gaeumannomyces graminis (Gg) ir, be to, ligas, sukeltas Rhizoctonia, arba būna aktyvus (išreiškia slopinimo gebą) t

prieš visas tris šaknų ligas. Antrojo išradimo įgyvendinimo P. fluorescens kamienų pavyzdžiai: Z30-97, Z32-97, Z33-97 irZ34-97.

Charakteringas juostinis modelis. Biologiškai gryni fluorescentinių Pseudomonas spp. kamienai (priklausantys pirmajam išradimo įgyvendinimui) pasižymi būdingu juostiniu modeliu. Šis profilis gali būti identifikuotas RAPD analize, naudojant masalą M13, kaip aprašyta žemiau LT 4785 B

1-ajame pavyzdyje. Fig. 1 rodo juostinius modelius (RAPD) P. fluorescens Q8r1-96, ML4.9-96 ir L5.1-96 kamienų, kurie yra kamienų pagal išradimą pavyzdžiai. Pirmasis takas vaizduoja 1-kb laiptelius kaip standartą palyginimui. Kaip matyti iš Fig. 1, kamienų bendros juostos yra: 330±20 bp;

600±50 bp; 700±50 bp; 800±50 bp; 900±50 bp; 1100±60 bp. 800±50 bp juosta intensyviausia.

Nagrinėjant išradimo pirmąjį įgyvendinimą, kamienui charakteringas juostinis profilis pasitvirtina, jei kamienas turi juostas ties 600±50 bp; 700±50 bp; 800±50 bp; 900±50 bp sąlygomis, aprašytomis žemiau, 1-jame pavyzdyje. Pageidautiname įgyvendinime, kamienas taip pat turi juostas ties 330±20 bp ir 1100±60 bp.

Kitas identifikavimo, ar kamienas turi pirmajam išradimo įgyvendinimui charakteringą juostinį modelį, būdas - tiriamo kamieno ir P. fluorescens kamieno Q8r1-96 vizualus juostų palyginimas, sugretinant tarp 600±50 bp ir 900±50 bp agaro gelio terpėje. Jei testuojamo kamieno profilis atitinka Q8r1- - J profilį šioje srityje, testuojamas kamienas turi išradimo apibrėžtą i charakteringąjį juostinį modelį (RAPD analizės parodytą DNR profilį).

Kitas identifikavimo būdas, nustatant, ar transformuotas kamienas turi išradimo pirmajam įgyvendinimui charakteringą juostinį modelį, yra išradimo W pirmojo įgyvendinimo pavyzdžio P. fluorescens Q8r1-96, veikiančio pirmojo įgyvendinimo kamieno arba išradimo kamieno pavyzdžio, tokio, kaip Z34-97, sugretinimas agaro gelyje su tiriamu kamienu ir vizualinis palyginimas juostų tarp apytikriai 600±50bp ir 900±50bp. Jeigu tiriamo kamieno profilis atitinka pirmojo įgyvendinimo kamieno Q8r1-96 pavyzdžio, veikiančio motininio kamieno arba išradimo kamieno pavyzdžio šioje srityje profilį, tai tiriamas kamienas turi charakteringą juostinį profilį, įgyvendintą šiuo išradimu.

Antrajame išradimo įgyvendinime transformuotas kamienas, pageidautina, turi tokią papildomą identifikavimo charakteristiką: kamienas išlaiko bent keturias charakteringas modelio juostas, būdingas motininiam ar pirmojo įgyvendinimo kamienui, koduojančiam 2,4-diacetilflorogliucinolį.

Antrojo įgyvendinimo transformuoti kamienai turi tokį identifikuojantį charakteringą juostinį modelį kaip ir motininiai arba pirmojo įgyvendinimo kamienai. Šis profilis gali būti nustatomas RAPD analizės metodu, naudojant M13 pradmenį, kaip aprašyta žemiau, 5 ir 11-ajame pavyzdžiuose. Fig. 1 vaizduoja RAPD juostinio modelio charakterį, gaunamą išradimo pirmojo įgyvendinimo P. fluorescens Q8r1-96, ML4.9-96 ir L5.1-96, kurie yra pirmojo įgyvendinimo kamienų pavyzdžiai. Takas 1 rodo 1-kb laiptelius kaip, standartą palyginimui. Iš Fig. 1 seka, kad pastarieji kamienai turi bendras juostas ties 330±20 bp, 600±50 bp, 700±50 bp, 800±50 bp, 900±50 bp ir' 1100±60 bp. 800±50 bp juosta būna intensyviausia.

Transformuotieji kamienai Z32-97, Z33-97 ir Z34-97 su savo motininiu kamienu P. fluorescens Q8r1-96 turi tokias bendras juostas ties 330±20, 600±50, 700±50, 800±50, 900±50 ir 1100±60 bp. Transformuotas kamienas Z30-97 su savo motininiu kamienu Q8r1-96, turi šias bendras juostas: 600±50, 700±50, 800±50 ir 900±50 bp.

Pagal šį išradimą transformuotas kamienas turi motininio kamieno pavyzdžio charakteringąjį juostinį modelį, jei jis turi juostas ties 600±50, 700±50, 800±50 ir 900±50 bp 5-ajame ar 11-ajame žemiau pateiktuose pavyzdžiuose nurodytomis sąlygomis.

Pageidautina, kad transformuoto kamieno juostos būtų ties 330±20 bp ir 1000±60 bp.

Biologinės kovos aktyvumas. Biologiškai gryni išradimo pirmojo įgyvendinimo fluorescentinių Pseudomonas spp. kamienai sugeba slopinti (stabdo veikimo sferą, aštrumą) ligas, sukeltas Gg (pvz. “iššutimą”) smulkiagrūdėse kultūrose ar velėnos žolėje. Duomenys apie biologinės kovos aktyvumą yra pateikti pavyzdžiuose, 1, 2 ir 4-ojoje lentelėse (žiūr. žemiau). 2-ojoje 3-ojo pavyzdžio lentelėje parodoma, kad Q8r1-96 kamienas lauko sąlygomis 20 % sumažina kviečių užkrėstumą “iššutimu”. 4-ojoje 4-ojo _t pavyzdžio lentelėje parodoma, kad Q8r1-96 beveik du kartus efektyviau slopina “iššutimą”, negu P. fluorescens Q2-87 kamienas (žinomas slopinantis, Phl gaminantis kamienas), po devynių kviečių auginimo ciklų.

Kaip aptariama žemiau, Q8r1-96 atkartoja TAD dirvožemio biologinės kovos lygį.

Biologiškai gryni fluorescentinių Pseudomonas spp. kamienai turi biosintezės vietas (lokus), koduojančias antibiotiko fenazino-1karboksirūgšties susidarymą. Šis antibiotikas stabiliai įjungtas į genomą. Toks kamienas slopina ligas (apriboja jų veikimo sferą bei aštrumą), sukeltas dirvoje esančio Rhizoctonia patogeno. Pasirinktinai, šie kamienai slopina Pythium ar Gaeumannomyces graminis sukeltas ligas, papildomai ligoms, sukeltoms Rhizoctonia. Kamienai gali slopinti ir visas tris ligas.

6, 7 ir 8-joje lentelėse (8 pavyzdyje, žemiau) yra pateikti duomenys apie biologinės kovos aktyvumą. 6-ojoje lentelėje parodyta, kad transformuotų Z30-97, Z32-97 ir Z34-97 kamienų dozės 10²-10³ CFU (koloniją formuojančių vienetų) vienai sėklai sumažina Rhizoctonia solani AG8 užkrėstų kviečio šaknų procentą labiau negu tų pačių dozių motininis kamienas Q8r1-96, P. fluorescens 2-79 (fenazino-1-karboksirūgšties genų šaltinis) ir du neapdoroti kontroliniai bandiniai. Kamienas (motininis) Q8r1-9ė veikia ekvivalentiškai kamienams Z30-97 ir Z32-97 tiktai tada, jei slopinant Rhizoctonia yra naudojama didesnė Q8r1-96 dozė. 7-oji lentelė (8 pavyzdyje, žemiau) rodo, kad Pythium slopinimo eigoje Z34-97 kamieno dozė 10² CFU vienai sėklai tiek pat efektyvi, kiek ir kamieno Q8r1-96 dozė 10³ CFU vienai sėklai. Iš 8-osios (8 pavyzdys, žemiau) lentelės matyti, kad Z34-97 kamienas žymiai slopina Gaeumannomyces graminis variantą tritici (Ggt). 4-8 lentelės (8 pavyzdyje, žemiau) rodo, kad Z34-97 gali slopinti visas tris šaknų ligas.

Kolonizavimo geba. Biologiškai gryni fluorescentinių Pseudomonas spp. pirmojo įgyvendinimo kamienai rodo unikalią kolonizavimo gebą, kuri pasižymi tiek (a) didesniu populiacijos tankiu ant šaknų paviršiaus, tiek (b) didesniu kolonizavimo aktyvumu, lyginant su žinomais slopinančiais kamienais, t.y. išradime pateikti kamienai sugeba tiek kolonizuoti, tiek ir išsilaikyti šaknies paviršiuje. Žemiau pavyzdžiais parodyta, kad išradime pateikti kamienai sugeba kolonizuoti šaknis, esant vidutiniam populiacijos tankiui mažiausiai 10⁵ CFU vienam šaknų masės gramui, įskaitant susijusį rizosferinį dirvožemį, mažiausiai 7-is vienas po kito einančius derliaus ciklus. Fig. 2 vaizduoja kviečių (cv. Penawawa) šaknų kolonizavimą Q8r1-96 kamienu 9-is ciklus Quincy plėšininiame dirvožemyje. 5-ojo ciklo eigoje Q8r1LT 4785 B populiacijos tankis buvo apie 1000 kartų didesnis, negu P. fluorescens Q2-87 ir M1-96 kamienų (pagal išradimą). Lind ir Moses Lake plėšininiuose dirvožemiuose (Fig. 3, 4) Q8r1-96 taip pat parodė žymiai didesnius populiacijos tankius.

Išradimo pirmajam įgyvendinimui priklausantys kamienai pasižymi charakteringa geba kolonizuoti, jei jie kolonizuoja kviečių šaknis, kai jų sukeltas vidutinis populiacijos tankis siekia mažiausiai apie 10⁵ CFU vienam šaknų gramui, įskaitant šaknies plaukelių zonas (rizosferą) bent 5-is vienas po kito einančius auginimo ciklus, sąlygomis, aprašytomis žemiau, 4-ajame pavyzdyje.

Pagal išradimo antrąjį įgyvendinimą, biologiškai gryni transgeniniai kamienai sugeba kolonizuoti augalų sėklas ir šaknis. 9-oje lentelėje (9 pavyzdys, žemiau) parodyta, kad išradimo iliustracijai pateiktų kamienų pavyzdžiai siekė tą patį populiacijos tankį, kaip ir motininis kamienas, praėjus 66-ioms valandoms ir vienai savaitei po apdorotų sėklų sėjos.

Nepriklausomumas nuo dirvos tipo. Pagal išradimo pageidautiną įgyvendinimą, kamienas turi dar tokią savybę, kad jo biologinės kontrolės aktyvumas ir šaknų kolonizavimo geba nepriklauso nuo dirvos tipo. Iš Fig. 5 galima įsitikinti, kad per 7-is ciklus Q8r1-96 kamieno populiacijos tankis nepriklausė nuo dirvos tipo.

TAD (“iššutimą” slopinančios) dirvos biologinės kovos atkartojimas. Kita išradime siūlomo kamieno pageidautina savybė - gebėjimas slopinti smulkiagrūdžių kultūrų ligas, sukeliamas Gg, biologinės kovos lygiu, ekvivalentišku lygiui, kuris stebimas dirvoje “iššutimo” slopinimo (TAD) atvejais, tai yra, kamienas sugeba atkartoti biologinės kovos lygį, pasiekiamą TAD dirvoje. 1-oji lentelė (1 pavyzdys, žemiau) rodo, kad sėklas apdorojus Q8r1-96 kamieno 10⁴ CFU vienai sėklai (koloniją formuojančių vienetų/sėklai) doze ir jas pasėjus Quincy plėšininiame laidžiame dirvožemyje', jis tiek pat efektyviai slopino “iššutimą”, kaip ir Quincy TAD dirva. Be to, Q8r1-96 kamienas Lind plėšininėje (laidžioje) dirvoje buvo toks pat efektyvus, kaip ir Quincy dirvožemis TAD, pridėjus jo 10 masės %/masei į Lind plėšininį dirvožemį. Šis “iššutimo” slopinimo atkartojimas, ekvivalentiškas natūraliam “iššutimo” slopinimui, yra beprecedentis.

Transgeninių slopinančių kamienų pritaikymas kovai su augalų šaknų ligomis. Pagal antrąjį išradimo įgyvendinimą, transgeninių mikroorganizmų kamienai gali būti sėkmingai naudojam kovai su augalo šaknų ligomis, kaip antai, su ligomis, sukeliamomis Rhizoctonia patogeno, ir pasirinktinai, sukeliamomis Pythium bei Gaeumannomyces graminis. Išradime pateikti biologinės kovos agentai ypatingai naudojami kovai su smulkiagrūdžių kultūrų (pvz. kviečių miežių rugių ir kvietrugių) ir velėnos žolių ligoms. Be to, kamienai gali būti naudojami kovai su kitų maistinių pluoštinių ir dekoratyvinių augalų šaknų ligomis. Pastarieji augalai yra jautrūs šaknų ligoms, sukeliamoms dirvos patogenų: Rhizoctonia, Pythium ir Gaeumannomyces graminis. Prie tokių augalų priskirtini: šparagai, kanola, kukurūzai, cukriniai runkeliai, pomidorai, bulvės, žirniai, ryžiai, pupos, sojoš) (i braškės, moliūgai ir medvilnė. « i

Biologinei kovai su gydomo augalo šaknų liga arba su konkretaus f augalo ligomis realizuoti augalas buvo auginamas vieno ar daugiau i fluorescentinio Pseudomonas kamieno pagal išradimą veiksmingo slopinimui s kiekio aplinkoje. Veiksmingas biologinei kovai kiekis yra apibrėžiamas kaip toks biologinės kovos agento kiekis, kuris reikalingas gydomo augalo šaknų ligos ar ligų veiksmingam slopinimui (ligos veikimo, aštrumo nuslopinimui ar sumažinimui), lyginant su ligomis, atsirandančiomis neapdorotame dirvožemyje. Prileidžiama, kad vanduo, trąšos, dirvos ir oro temperatūra nėra gydomo augalo vystymąsi lemiantys veiksniai. Tyrimų eigoje veiksmingas kiekis nustatomas pakartotiniais žinomais šioje srityje bandymais.

Biologinė kova realizuojama, įvedus efektyvų biologinės kovos agento kiekį į augalus, sėklas ar į augalo ar sėklos lokusą. Pvz., kamieną galima įvesti sėklų dirvos, vagos apdorojimu ar dirvos bei velėnos laistymu. Gali būti panaudotos šviežios ar šalčiu išdžiovintos ląstelės.

Kamienas gali būti įvedamas į kompozicijas, tinkamas naudoti augalams, kuriems šaknų ligų slopinimas yra pageidaujamas. Jis gali būti sumaišomas su bet kuriuo agrokultūroje priimtinu nešikliu ar su agronomiškai tinkamu nešikliu, kuris neveikia kamieno aktyvumo. Nešiklių pavyzdžiai vanduo, buferis, metilceliuliozė, durpžemis ar vermikulitas. Kai kamienas vartojamas suspensijos ar emulsijos pavidalo (skysto nešiklio terpėje), į suspensijos ar emulsijos sudėtį pasirinktinai gali įeiti įprastiniai priedai: paviršiaus aktyviosios medžiagos bei drėkinantys agentai, kaip kad žinoma šioje srityje. Kamieno pagal išradimą sudėtyje gali būti kitų kamienų, skirtų biologinei kovai, įskaitant kitus išradimo antrojo įgyvendinimo kamienus, pirmojo įgyvendinimo kamieną, arba kamienus, žinomus šioje srityje.

Naudojimo būdų pavyzdžiai ir efektyvūs kiekiai yra aprašyti žemiau. Kiekis, atitinkantis atskiro atvejo veiksmingumo diapazoną, nustatomas eksperimentiniais bandymas.

Smulkiagrūdžių kultūrų, velėnos žolių ar kitų maistinių, pluoštinių, dekoratyvinių augalų sėkloms apdoroti bakterijos pridedamos į 0,5-2,0 % metilceliuliozės turinčią suspensiją, siekiant sumažinti bakterijų džiūvimą ir skatinti jų sukibimą su sėklomis. Suspensija dedama į sėklas ir maišoma, kol kiekviena sėkla pasidengia 10²-10⁵ CFU vienai sėklai. Apskritai, pageidautinas kiekis yra apie 10²-10⁴ CFU vienai sėklai. Po šio apdorojimo sėklos džiovinamos oru.

Apdorojant dirvą, bakterijos suspenduojamos vandenyje ar buferyje ir pilamos į dirvą, kol pasiekiama apie 10²-10³ CFU vienam dirvožemio gramui. Apdorojant velėną, bakterijos suspenduojamos vandenyje ar buferyje kaip laistymo medžiaga, turinti iki 10²-10⁵CFU vienam mililitrui.

Tiesiogiai apdorojant šaknis, jos panardinamos į bakterijų suspensiją10²-10⁵CFU vienam suspensijos mililitrui.

Tipinis reikalavimas suspensijai, esant kietam nešikliui (pvz., durpžemiui, vermikulitui), yra apie 10⁶-10⁹ CFU vienam nešiklio gramui. Esant skystam nešikliui, šis reikalavimas siekia 10⁸-10¹° CFU vienam nešiklio mililitrui. Šaldymu džiovintų ląstelių atveju tipinis reikalavimas yra apie 10¹°-10¹¹ CFU vienam suspensijos gramui. Suspensijos su šaldymu džiovintomis ląstelėmis gali būti su priedais, žinomais šioje srityje.

Rūšiavimo būdas. Išradimo pirmasis įgyvendinimas apima būdus, skirtus unikalių, išradime pateiktų fluorescentinių Pseudomonas kamienų atrankai. Naudojant musų būdą, gaunami mikroorganizmų kamienai, pasižymintys aukščiau aprašytomis charakteristikomis. Trumpai tariant, mūsų būdas apima šias stadijas: (1) smulkiagrūdžių kultūrų ir velėnos žolių kultivavimą vienas po kito einančių auginimo ciklų metu, “iššutimą slopinančiame dirvožemyje (t.y. “iššutimą” silpninančiame dirvožemyje), praturtinant jį fluorescentinėmis Pseudomonas spp., turinčiomis biosintezės vietą (lokus), kuri koduoja 2,4-diacetilflorogliucinolio gavimą (taip pat nurodomomis kaip Phl gaminančiomis fluorescentinėmis Pseudomonas spp.); (2) potencialiai slopinančių fluorescentinių Pseudomonas bakterijų kamienų išskyrimą; (3) išskirtų kamienų rūšiavimą, siekiant atrinkti kamienus, turinčius biosintezės vietas (lokus), koduojančias 2,4-diacetilflorogliucinolio susidarymą. Tai atliekama kryžminant koloniją su 2,4diacetilflorogliucinoliniui specifiniu DNR bandiniu, siekiant nustatyti Phl gaminančius agentus; ir (4) RAPD analizės panaudojimą turintiems 4 charakteringąjį juostinį modelį (aprašytą aukščiau) kamienams atrinkti. Po (3) 5 stadijos gali būti pasirinktinai patvirtinamas Phl susidarymas. š

Siūlomas atrankos būdas pagal išradimą toliau yra aprašomas J smulkiau.

1-oji stadija. Einantys vienas paskui kitą auginimo ciklai, praturtinantys j dirvą Phl gamintojais. L

Šioje stadijoje smulkiagrūdes kultūros ar velėnos žolės yra kultivuojamos paeiliui einančiais auginimo ciklais natūraliame “iššutimą” slopinančiame dirvožemyje, siekiant praturtinti jį Phl gaminančiomis fluorescentinėmis Pseudomonas spp.: (a) - smulkiagrūdes kultūros ar velėnos žolės auginamos TAD dirvožemyje šiltnamio sąlygomis, mažiausiai 3 savaites, esant sąlygoms, palankioms smulkiagrūdžių kultūrų ar velėnos žolės augimui, siekiant užauginti daigus; (b) - surenkamas dirvožemis drauge su smulkiagrūdžių kultūrų ar žolių daigais ir šaknimis ir viskas gerai sumaišoma; (c) - pakopos (a) ir (b) kartojamos bent 4 vienas po kito einančius ciklus. Pasibaigus eiliniam ciklui, pakopoje (b) pagamintas mišinys naudojamas sėklų daiginimui po to einančiame cikle.

₂₀ LT 4785 B

2- oji stadija. Fluorescentinių Pseudomonas spp. išskyrimas iš cikluose išsivysčiusių šaknų TAD dirvožemyje.

Šioje stadijoje potencialiai slopinantys flourescentinių Pseudomonas bakterijų kamienai išskiriami iš (1) stadijoje vienas po kito einančiais ciklais kultivuotų smulkiagrūdžių kultūrų ar velėnos žolių šaknų bei dirvožemio susijusios rizosferos (šaknies plaukelių). Tai atliekama auginant kamiends Pseudomonas atrankančioje terpėje. Parenkama tokia auginimo trukmė bei sąlygos, kad būtų realizuotas efektyvus Pseudomonas augimas ir augančių terpėje kamienų atranka.

3- oji stadija. Kolonijos kryžminimas (hibridizavimas) su specifiniais bandiniais (zondais), siekiant nustatyti Phl gamintojus.

Šioje stadijoje išskirti 2-ojoje stadijoje kamienai yra rūšiuojami, siekiant atrinkti kamieną, turintį biosintezės vietą (lokus), koduojančią 2,4diacetiIflorogIiucinoliui (Phl) susidarymą, kryžminant kamienų koloniją su 2,4diacetilflorogliucinolio specifiniu bandiniu (zondu) ir po to atrenkant sukryžmintus su bandiniu kamienus. Atrinktos individualios kolonijos surenkamos, pasėjamos, dar kartą sėjamos ruoželiais tol, kol kamienas tampa stabilus ir grynas, t.y. kol pasidaro biologiškai gryna kultūra. Kamienas gali būti laikomas glicerolyje, -80 °C temperatūroje, siekiant išlaikyti jo stabilumą.

3a stadija (pasirinktinė). Phl gamintojų patvirtinimas PCR būdu. Šiame pasirinktiniame etape patvirtinamas Phl gaminančių kamienų egzistavimas. Tai atliekama naudojant pradmenis, kurie amplifikuoja sekas Phl biosintezės vietose (lokus). Tie kamienai, kurie parodo teigiamą PCR reakciją, atrenkami.

4- oji stadija. RAPD analizė, siekiant nustatyti Phl gamintojus su apibrėžtu jų juostiniu modeliu.

Šioje stadijoje atliekama RAPD analizė, naudojant M13 pradmenį (seka: GGTGGTCAAG) (žiūr. aukščiau, Keel ir kt.). Pradmuo M13 perkamas iš Operon Technologies Ine., Alameda, Calif.. Atrenkami kamienai, turintys juostas ties 600±50, 700±50, 800±50, 900+50 bp. Pageidautina, kad kamienai taip pat turėtų juostas ties 330+20, 1100±60bp.

Naudodami šį būdą, mes gavome P. fluorescens Q8r1-96, L5.1-96 ir ML4.9-96 kamienų biologiškai grynas kultūras, kurios priskirtinos išradimo pirmojo įgyvendinimo pavyzdžiams.

Transgeninių kamienų gavimas. Išradimo antrojo įgyvendinimo kamienai gaunami pagal rekombinantinės DNR technologiją, kurioje fenazino-1 karboksirūgšties biosintezės vieta (lokus) yra stabiliai įvedama į motininio fluorescentinio Pseudomonas kamieno genomą, kurio charakteristikos aprašytos žemiau. Genetinė vieta (lokus) fenazino-1-karboksirūgšties biosintezei, paimta iš bakterijų kamieno (pvz., iš fluorescentinio Pseudomonas), modifikuojama įvedant fenazino biosintezės genus už promotoriaus, tokio kaip tac. Ši konstrukcija po to klonuojama plazmidėje. tokioje kaip pUT, turinčioje mini - Tn5 su klonavimo padėtimis, tokiomis kaip S/žl arba Not\ ir sugebančioje tarpininkauti stabiliai įtvirtinant fenazino biosintezės genus recipiente fluorescentiniame Pseudomonas. Plazmidė su fenazino biosintezės vietomis (lokus) ir promotoriumi pernešama j 'Vii kamieną, tokį kaip Escherichia coli S17-1 (Apir). Fenazino biosintezės genai stabiliai įtvirtinami recipiento Pseudomonas kamiene, pastarąjį suporuojant su E. coli kamienu. Po suporavimo kultūros suspenduojamos buferyje ir auginamos ant KMB plius kanamicinas. Laikoma, kad fluorescentiniai ir kanamicinui atsparūs kamienai ir yra spėjamieji transformuoti (transgeniniai) kamienai.

Kaip aptariama 5-jame pavyzdyje (žemiau), genetinių vietų (lokus) pernešimo variantas fenazino-1-karboksilinės rūgšties biosintezei buvo sukonstruotas, panaudojus fenazino biosintezės genus iš Pseudomonas fluorescens 2-79 (NRRL B-15132) kamieno. Fenazino biosintezės (phz) vieta (lokus) yra lokalizuota P. fluorescens 2-79 kamiene 8, 505-bp Bg1ll-Xbal DNR fragmente ir sudaryta iš 9 genų, žymimų: phzABCDEFG, phzl ir phzR. Pilna gautos iš P. fluorescens 2-79 phz vietos (lokus) genų seka yra išvardinta GenBank kompiuterinėje duomenų bazėje (kodas: L48616).

phzABCDEFG genai sudaro vieną operoną ir yra atsakingi už fenazino-1-karboksirūgšties (PCA) susidarymą kamiene P. fluorescens 2-79. phzC, phzD ir phzE genų produktai panašūs į fermentus, skatinančius šikimo ir chorizmo rūgščių medžiagų apykaitą, ir drauge su PhzF yra būtini PCA susidarymui. PhzG panašus į piridoksamino-5’-fosfatoksidazes ir, galbūt, yra PCA sintezuojančių fermentų kofaktoriaus šaltinis. phzA ir phzB genų produktai yra labai homologiški vienas kito atžvilgiu ir gali stabilizuoti spėjamą PCA sintezuojantį multifermentinį kompleksą. Genai phzABCDEFG. yra lokalizuoti fenazino biosintezės vietos (lokus) (kamienas 2-79) 6,8-kb Bglll-Xbal fragmente. Šis DNR fragmentas, kontroliuojant tac promotorium,' buvo patalpintas ir po to klonuojamas tarpininkaujančioje, žemiau aprašytoje plazmidėje. Gauta plazmidė panaudota stabiliems chromosominiams įjungimams (įsiuvams) į flourescentinį Psoudomonas spp. kamieną generuoti, kurie (įjungimai) patys savaime negali sudaryti fenazino junginių.

Bakterijų kamienams konstruoti genų inžinerijos metodu buvo panaudota sistema, pagrįsta Tn5 translokacijos savybėmis ir plazmidės pUT tarpininkavimu (V. de Lorenzo, V. Herrero, U. Jakubzik and K. N. Timmis, Journal of Bacteriology 172:6568-6572 (1990)). pUT plazmidė pasižymi π baltymo kilmės struktūros elementų pasikartojimu, būdingu R6K plazmidei. Todėl pUT išsilaiko tik π baltymą gaminančiose bakterijose, pvz:, specialiai sukonstruotame Escherichia coli S17-1 (Xpir) kamiene. pUT taip pat pasižymi plazmidės RP4 oriT pernešimo ypatybėmis. Dėl to pUT užtikrina našų pernešimą iš donorinių E. coli kamienų į recipientinius Pseudomonas kamienus, išreikšdamas RP4 jungiamąsias funkcijas. Pagaliau, pUT neša IS50_r geną tnp, koduojantį Tn5 minielementų perkėlimą. Ši aukščiau aprašyta pristatymo sistema įtvirtina fenazino biosintezės genus apdorojamo Pseudomonas kamieno chromosomose, kur jie palaikomi nedideliu, dažnai natūralių kopijų skaičiumi bent teoriškai, turėtų būti tokie stabilūs, kaip ir kiti chromosomų genai.

Po suporavimo kultūros suspenduojamos buferyje ir auginamos ant KMB plius kanamicinas. Fluorescentiniai ir kanamicinui atsparūs kamienai laikomi spėjamai transformuotais. Atrinktos individualios kolonijos surenkamos, pasėjamos ir dar kartą sėjamos, kol kamienas tampa stabilus ir grynas, t.y. jis tampa biologiškai gryna kultūra. Kamienas gali būti saugojamas glicerolyje, - 80 °C temperatūroje, siekiant išlaikyti jį stabilų.

Atranka šiltnamyje. Transformuotų kamienų rūšiavimas, siekiant atrinkti tuos, kurie slopina Rhizoctonia sukeliamas ligas (pvz., kviečių šaknų puvinys), atliekamas šiltnamio biologiniuose bandymuose. Dirvožemis užkrečiamas Rhizoctonia kultūra ir patalpinamas plastiko vamzdeliuose, kaip aprašyta 8-ajame pavyzdyje, žemiau. Tiriamos jautriosios kultūros (pvz., kviečių) sėklos yra apdorojamos transformuotu kamienu ir pasėjamos į šį dirvožemį. Jei norima atsirinkti transformuotus kamienus, kurie taip pat yra efektyvūs pieš ligas, sukeltas Gaeumannomyces graminis (Gg) ar Pythium, šiltnamių biologiniams bandymams atitinkamai naudojami Gg ar Pythium spp. kaip sėjamoji kultūra.

Pasirinktinė in vitro atranka. Prieš atranką šiltnamyje pasirinktinai galima transformuotu kamienu slopinti Rhizoctonia kultūrą in vitroi Transformuotas kamienas suporuojamas su patogenu ant agaro plokštelės ® matuojama slopinamos zonos apimtis. Žemiau, 6-ajame pavyzdyje* nurodoma, kad iliustratyvūs biologiškai grynų transgeninių kamienų pavyzdžiai demonstravo intensyvesnį Gaeumannomyces graminis tritięį rūšies, Rhizoctonia solani AG8 ir Pythium irregulare slopinimą, negu motininis P. fluorescens Q8r1-96 kamienas.

lentelėje (6-asis pavyzdys, žemiau) parodyta, kad transgeninių kamienų slopinimo zonos žymiai platesnės, negu Q8r1-96. Bendrai paėmus, kamienai slopina Pythium sukeltas ligas ar ligas, sukeltas Gg papildomai ligoms, sukeltoms Rhizoctonia, arba sugeba kontroliuoti visas tris ligas.

Išradimo antrajame įgyvendinime taikant mūsų būdą, gavome biologiškai grynas P. fluorescens kamienų kultūras: Z30-97, Z32-97, Z33-97 ir Z34-97, kurios yra pavyzdžiai pagal išradimą. Pastarieji kamienai buvo gauti transformuojant išradimo pirmojo įgyvendinimo motininį kamieną P. flourescens Q8r1-96, siekiant įvesti stabiliai į genomą biosintezės vietą (lokus) fenazino-1-karboksirūgšties susidarymui. Tai smulkiai aptariama 5ajame pavyzdyje, žemiau. Motininis kamienas Q8r1-96 paprastai gamina antibiotiką 2,4-diacetilflorogliucinolį (Phl). Įvedimas į pastarąjį kamieną ₂₄ LT 4785 B fenazino-1 -karboksirūgšties (PCA) biosintezės genų, suteikė transformuotiems kamienams sugebėjimą gaminti PCA ir Phl drauge.

6-ajame pavyzdyje (žemiau) parodyta, kad fenanzino-1karboksirūgšties biosintezės genų pridėjimas paveikia transformuotus kamienus taip, kad jie daug aktyviau slopina Rhizoctonia sukeltą šaknų puvinį, negu motininis Q8r1-96 kamienas ar fenazino-1-karboksirūgšties biosintezės vietų (lokus) šaltinis - kamienas 2-79. Pavyzdyje pažymėta, kad kamienas Z34-97 efektyviai slopina Rhizoctonia, esant mažai dozei 10²-10³. Tokia dozė 100-1000 kartų mažesnė, negu Rhizoctonia slopinimui reikalingos kamienų R fiuorescens Q8r1-96 ir Bacillus sp. L324-92 dozės.

Kamienų charakteristikos. Motininiam kamienui Q8r1-96 būdingi fiziologiniai požymiai ir substrato naudojimo ypatumai yra tipiški P. fiuorescens kultūrai, kaip nurodo Bergey žinynas (žiūr. 10 lentelę žemiau). Q8r1-96 kamienas taip pat gamina antibiotiką 2,4-diacetilflorogliucinolį. Transformuoti kamienai, gauti išradime (jų pavyzdys - Z34-97), turi motininio kamieno požymių, išskyrus tai, kad transformuoti kamienai be 2,4diacetilflorogliucinolio gamina dar ir fenazino-1-karboksirūgštį.

Deponavimo patvirtinimas. Biologiškai grynos kamienų Q8r1-96, L5.1-96, ML4.9-96 kultūros buvo deponuotos 1997 m. liepos 8 dieną pagal Budapešto sutarties (Treaty in the Agricultural Research Culture Collection NRRL) 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, reikalavimus. Deponuotoms kultūroms suteikti atitinkami priėjimo numeriai: NRRL B21806, NRRL B-21807 ir NRRL B-21808. Kamienai, turintys NRRL B-21806, NRRL B-21807 arba NRRL B-21808 identifikavimo charakteristikas, yra šio išradimo produktai. Šis išradimas apima bet kurią kamieno kultūrą, turinčią kamienų NRRL B-21806, NRRL B-21807 arba NRRL B-21808 identifikavimo charakteristikas, įskaitant subkultūras (ir jų variantus), kurioms būdingos koduojančios antibiotiko 2,4-diacetilflorogliucinolio susidarymą vietos (lokus) ir charakteringi juostiniai modeliai (aprašyti aukščiau) ir kurios išlaiko Gg sukeliamų smulkiagrūdžių kultūrų ir velėnos žolių ligų slopinimo bei charakteringą šaknų kolonizavimo gebą. Terminu “variantai” čia pažymėti transformantai ir mutantai, kuriems priskirtinos aukščiau įvardintos charakteristikos.

Biologiškai grynos P. fluorescens kamienų Z32-97, Z33-97 ir Z34-97 kultūros buvo deponuotos 1997 m. gruodžio 11 dieną, o biologiškai gryna

P. fluorescens kamieno Z30-97 kultūra deponuota 1997 m. gruodžio 15 dieną agrokultūrų kolekcijoje (Agricultural Research Culture Collection) (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604. Deponuotoms kultūroms buvo suteikti atitinkami priėjimo numeriai: NRRL B-21905, NRRL

B-21906, NRRL B-21907 ir NRRL B-21908. Visi kamienai deponuoti pagal

Budapešto sutartį. Turintys NRRL B-21905, NRRL B-21906, NRRL B-21907 arba NRRL B-21908 identifikavimo charakteristikas kamienai yra šio išradimo produktai. Šis išradimas apima bet kurią kamieno kultūrą, turinčią identifikavimo charakteristikas NRRL B-21905, NRRL B-21906, NRRL B21907 arba NRRL B-21908 kamienų įskaitant subkultūras (ir jų variantus), # i kurioms būdingos koduojančios antibiotiko fenazino-1-karboksirūgšties susidarymą vietos (lokus), stabiliai įvestos į genomą, kurios slopina

S

Rhizoctonia patogeno sukeltas ligas ir išlaiko motininio kamieno 2,4diacetilflorogliucinolio vietas (lokus). Pageidautiname įgyvendinime kamienas 'i' taip pat išlaiko keturias motininio kamieno genetinio profilio juostas (kaip buvo parodyta aukščiau). Terminu “variantas” čia pažymėti transformantai ir mutantai, kuriems priskirtinos aukščiau išdėstytos charakteristikos.

Išradime pateiktų kamienų auginimas. Pirmojo įgyvendinimo fluorescentinių Pseudomonas spp. kamienai gali būti auginami bet kurioje tinkamoje kietoje ar skystoje bakteriologinėje terpėje. Terpės pavyzdys Kingo B terpė. Kamienai auginami aerobinėse sąlygose, esant temperatūrai, tinkamai organizmų vystymuisi, t.y. nuo 15°C iki 30 °C. Labiausiai tinkamas temperatūros intervalas: apie 24-28 °C. Maitinančios terpės pH yra rekomenduotinas apytikriai neutralus, t.y. pH = 6,7-7,2.

Išradimo antrojo įgyvendinimo fluorescentinių Pseudomonas spp. kamienai gali būti auginami bet kurioje tinkamoje kietoje ar skystoje bakteriologinėje terpėje. Kingo B terpė - pavyzdinė. Kamienai auginami aerobinėse sąlygose, esant tinkamai organizmų vystymuisi temperatūrai, t.y.

apie 15-30 °C; labiausiai tinkamas temperatūros intervalas: 24-28 °C. Maitinančios terpės pH yra rekomenduotinas neutralus, t.y. pH = 6,7-7,2.

Atsarginių kultūrų priežiūra. Kiekvienas kamienas turi būti laikomas sąlygose, užtikrinančiose jo stabilumą. Tokios sąlygos - glicerolio terpė (-80°C).

Gg slopinančių kamienų naudojimas. Išradime pateikti mikroorganizmų kamienai naudotini kovai su smulkiagrūdžių kultūrų ar velėnos žolių ligomis, sukeltomis Gg. Smulkiagrūdžių kultūrų pavyzdžiai kviečiai, miežiai, rugiai ir kvietrugiai. Gg sukeliamų ligų pavyzdžiu gali būti sukeliamas Ggt “iššutimas”, kuris yra svarbiausia kviečių šaknų liga, o taip pat kitų Graminae, tokių kaip ir miežiai, rugiai ir kvietrugiai. Kiti grybeliai (Gg grupės) Gga infekuoja avižas ir žolę. Jie identifikuojami pagal “iššutimo” dėmes velėnos žolėje - ypač laukų žolėje. Ggg taip pat infekuoja kai kurias laukų žoles.

Biologinei kovai su Gg sukeliamomis ligomis būtina smulkiagrūdes kultūras bei žolę auginti, pridėjus į dirvą atitinkamą išradime pateiktų fluorescentinių Pseudomonas kamienų (vieno ar kelių) reikalingą slopinimui kiekį. Efektyvi biokontrolė apibrėžiama tokiu biologinio agento kiekiu, kuris slopina (sustabdo plėtimąsi, mažina aštrumą) Gg grupės sukeltas ligas, lyginant su neapdorotu kontroliniu bandiniu. Optimaliai biologiškai gryna kultūra yra taikoma siekiant susilpninti augalo šaknų ligą mažiausiai 15 %, lyginant su neapdorotu kontroliniu bandiniu lauke, kur auginamos smulkiagrūdes kultūros arba velėnos žolė. Biokontrolei realizuoti efektyvus biokontrolės agento kiekis taikomas augantiems augalams ar jo sėkloms, arba yra įvedamas į augalo ar sėklų lokusą (vietą). Pvz., kamienas yra naudojamas apdorojant sėklas, dirvą, vagas ar drėkinant velėną bei dirvą. Gali būti naudojamos šalčiu džiovintos ląstelės.

Kamienas gali būti įmaišytas į kompozicijas, kurios naudojamos smulkiagrūdėms kultūroms ir velėnos žolėms. Jį galima sumaišyti su bet kuriuo agrokultūros ar agronomijos siūlomu nešikliu, neturinčiu įtakos kamieno aktyvumui. Nešiklių pavyzdžiai - vanduo, buferis, metilceliuliozė, durpžemis ar vermikulitas. Kai kamienas vartojamas suspensijos ar ₂₇ LT 4785 B emulsijos pavidalo (skysto nešiklio terpėje), suspensijos ar emulsijos sudėtyje gali būti įprastiniai priedai: paviršiaus aktyviosios medžiagos bei drėkinantys agentai. Išradime pateiktas kamienas gali būti komponuojamas ir su kitais, biologinei kovai tinkamais kamienais.

Naudojimo būdų pavyzdžiai ir efektyvūs kiekiai aprašyti žemiau. Kiekis, atitinkantis konkretaus atvejo efektyvumo diapazoną, nustatomas eksperimentiniais bandymais.

Smulkiagrūdžių kultūrų ar velėnos žolių sėklų apdorojimui bakterijos įvedamos į 0,5-2,0 % metilceliulozės suspensiją, siekiant iki minimumo sumažinti bakterijų džiūvimą ir stimuliuoti jų sankabumą su sėklomis. Suspensija ir sėklos maišomos tol, kol kiekviena sėkla pasidengia 10²-10⁶ CFU vienai sėklai. Apskritai, pageidautinas koloniją sudarančių vienetų kiekis yra apie 10⁴-10⁵ CFU vienai sėklai. Apdorotos sėklos išdžiovinamos ore.

Apdorojant dirvožemį, bakterijos suspenduojamos vandenyje ar buferyje ir naudojamos pirmojo dirvožemio sudrėkinimo metu, siekiant gauti apie 10²-10⁶ CFU vienam dirvožemio gramui. Apdorojant velėną, 2 ng) laistymo medžiagos, turinčios 10²-10⁶ bakterijų viename mililitre, supilama į*į. cm diametro žolės plotą. *

Tipinis reikalavimas kolonizavimo aktyvumui, esant kietam nešikliui (pvz., durpžemiui ar vermikulitui), yra apie 10⁷-10⁹ CFU vienam nešiklio gramui. Kai nešiklis skystas, reikalaujama 10^s-10¹°CFU vienam nešiklio mililitrui. Šaldymu džiovintai konsistencijai tipinis kiekis yra 10¹°-10¹¹ CFU vienam konsistencijos gramui ir savo sudėtyje gali turėti priedų žinomų šioje srityje.

Motininiai kamienai transgeninių kamienų pagal išradimą gavimui. Išradime gaunamiems transgeniniams kamienams sudaryti yra tinkami motininiai kamienai, turintys šias charakteristikas: kamienas turi biosintezės vietas (lokus), koduojančias 2,4-diacetilflorogliucinolio susidarymą, ir unikalų genotipą, kaip parodyta būdingu jo genomui juostiniu modeliu (smulkiai aprašytu žemiau, ir parodytu Fig. 1). Šis profilis gali būti indentifikuotas RAPD analize, naudojant M13 pradmenį, kaip pavaizduota žemiau, 5-me pavyzdyje. Pavyzdiniai motininiai kamienai yra P. fluorescens kamienai: Q8r1 -96, L5.1-96 ir ML4.9-96, aptarti anksčiau.

₂₈ LT 4785 B

Pagal šį išradimą motininis kamienas turi charakteringą juostinį profilį, jei spektro juostos yra ties 60Q±50bp, 700±50bp, 800±50bp, 900±50bp, esant sąlygoms, aprašytoms 5 pavyzdyje. Transgeniniame kamiene motininio kamieno juostos pasipildo ties 330±20bp ir 1100±60bp. Norint alternatyviai identifikuoti, ar motininis kamienas turi charakteringą juostinį modelį, testuojamas kamienas agaro gelyje vizualiai palyginamas su P. flourescens kamienu Q8r1-96 600±50bp4-900±50bp juostų intervale. Jei tikrinamo kamieno profilis šiame intervale sutampa su Q8r1-96 profiliu, tikrinamas kamienas turi charakteringą motininiam kamienui juostinį modelį ir papildomai slopina sukeltas Gg laukuose auginamų smulkiagrūdžių kultūrų arba velėnos žolės ligas bei rodo šaknų kolonizavimo gebą, pasižyminčią tiek didesniu populiacijos tankiu, tiek didesniu kolonizavimo aktyvumu, lyginant su žinomais Gg slopinančiais kamienais.

Motininio kamieno aktyvumas biologinėje kovoje. Biologiškai grynų fluorescentinių Pseudomonas spp. kamienų aktyvumas biologinėje kovoje aptartas aukščiau.

TAD (“iššutimą” slopinančios) dirvos biologinės kovos atkartojimas. Išradime pateiktas motininis kamienas yra charakterizuojamas kaip slopinantis smulkiagrūdžių kultūrų Gg sukeltas ligas tuo pačiu biologiniu lygiu, kaip ir tada, kai smulkiagrūdės kultūros auginamos natūraliose TAD (“iššutimo” slopinimo) sąlygose. Tai yra, kamienas sugeba atkartoti biologinės kovos lygį, būdingą TAD dirvai. Pvz., pavyzdinio motininio kamieno Q8r1-96 naudojimo dozė 10⁴ CFU vienai sėklai, po to pasėtai Quincy plėšininėje pralaidžioje dirvoje, tiek pat efektyviai slopino “iššutimą”, kaip ir Quincy TAD dirva. Be to, Q8r1-96 Lind plėšininėje pralaidžioje dirvoje buvo tiek pat efektyvus, kaip ir Quincy TAD dirva, pridėta į Lind dirvą 10 masės%/masės. “Iššutimo slopinimo atkartojimas, ekvivalentiškas natūraliam TAD, yra beprecedentis.

Motininių kamienų pageidautina, naudojamų kaip atsarginė medžiaga aukščiau minėtuose procesuose, gavimo būdas yra aptartas aukščiau, atžvilgiu motininių kamienų - biologiškai grynų P. fluorescens kultūrų pavyzdžių: Q8r1-96, L5.1-96 ir ML4.9-96.

₂₉ LT 4785 B

Motininių kamienų auginimas ir atsarginių jų kultūrų priežiūra yra vykdoma kaip aprašyta aukščiau, ryšium su transgeninių kamienų paruošimu pagal šį išradimą.

PAVYZDŽIAI

Žemiau pateikti pavyzdžiai yra skirti vien tik plačiau iliustruoti išradimą, o ne apriboti jo teisinę apimtį, kuri yra nustatyta apibrėžtyje.

pavyzdys

Šis pavyzdys aprašo pirmojo išradimo įgyvendinimo fluorescentinių Pseudomonas spp. atranką.

Apžvalga. Pseudomonas fluorescens kamienai Q8r1-96, L5.1-96, ML4.9-96 buvo išskirti 1996 metais iš kviečių auginamų dirvožemyje, surinktame iš agrokultūrinių laukų esančių TAD būsenoje, šaknų prie Quincy, Lind, Moses Lake, Vašingtono valstijoje (JAV). Q8r1-96 buvo išskirtas iš kviečių augintų Quincy TAD dirvoje, šaknų per 8 vienas po kito einančius ciklus (trunkančius po tris savaites); L5.1-96 išskirtas iš kviečių augintų Lind TAD dirvoje, šaknų per vienas po kito einančius 5 ciklus; ML4.9-96 - iš kviečių šaknų augintų Moses Lake TAD dirvoje per vienas po kito einančius 4 ciklus (kiekvieno trukmė - 3 savaitės).

Toliau yra pateiktas smulkus dirvožemių aprašymas ir išskyrimo bei charakterizavimo technika.

Dirvožemiai. Trys skirtingi dirvožemiai buvo paimti iš Quincy, Lind, Moses Lake apylinkių Vašingtono valst.(JAV) agrokultūrinių laukų esančių TAD būsenoje. Visos trys dirvos yra slopinančios kviečių “iššutimą”. 1995 metų duomenimis, Lind TAD laukas buvo be pertraukos užsėjamas kviečiais 28 metus. Quincy ir Moses Lake TAD laukai (1980 m. duomenimis) buvo kviečiais be pertraukos užsėjami 22 metus, o 1980-95 metais juose augintos šalia kviečių ir kitos kultūros. Dirvų bandiniai buvo paimti 1995 m. kovo mėnesį iš 30-ties cm viršutinio dirvos sluoksnio ir džiovinami ore 1 savaitę. Po to, prieš naudojimą bandiniai buvo sijojami (sieto tankis - 0,5 cm dydžio skylutės). Bandinių fizikinės ir cheminės savybės nustatytos Idaho Universiteto Analitinių mokslų laboratorijoje.

etapas: vienas po kito einantys kviečių augimo ciklai, siekiant pagausinti Phl gamintojus.

Po 12 kviečio sėklų buvo pasodintos keturkampiuose PVC puodeliuose (aukštis - 8 cm, plotis - 7,5 cm), kuriuose buvo po 200 g sijoto natūralaus dirvožemio (Quincy, Lind ar Moses Lake TAD dirvos), sudrėkinto 50 ml vandens su metalaksilu (Novartis, Greensboro, NC), 2,5 mg ml'¹ aktyvaus ingrediento, siekiant kontroliuoti Pythium šaknų puvinį. Pseudomonas pastarojo fungicido neveikiamos.Virš sėklų buvo paskleistas 1 cm storio dirvožemio sluoksnis. Augalai buvo auginami kontroliuojamos aplinkos kameroje, 16 °C temperatūroje, su 12 vai. šviesos periodu. Du kartus per savaitę į puodelius įpilama 50 ml atskiesto santykiu 2:3 tūris/tūris Hoaglundo tirpalo (tiktai makroelementai). Praėjus 3-4 auginimo savaitėms, augalų želmenys buvo nupjauti prie dirvos paviršiaus, o žemė su šaknimis perdėta į plastiko maišelį, stipriai plakama, siekiant aeruoti ir sumaišyti. Taip “kultivuotas” dirvožemis, išlaikytas apie savaitę 15 °C temperatūroje, vėl grąžintas į tą patį puodelį ir iš naujo užsėtas 12 kviečio sėklų Ši augalų auginimo ir nupjovimo procedūra kartota mažiausiai 4 (iki 8) vienas po kito einančių ciklų. Ciklų metų buvo atsitiktinai atrenkami augalo keturi pavyzdžiai iš kiekvieno pakartojimo ir šaknų pavyzdžiai buvo ruošiami, siekiant nustatyti antibiotiką gaminančio fluorescentinio Pseudomonas spp. populiacijos mastą.

etapas: fluorescentinių Pseudomonas spp. išskyrimas iš TAD dirvožemyje ciklais augintų kviečio šaknų.

Keturi atsitiktinai pasirinkti augalai, auginti 1-e etape, buvo imami nuo kiekvieno pakartojimo, ir laisvai prilipusi žemė buvo atsargiai nukratoma nuo šaknų. 1 g šaknų su šaknų plaukeliais buvo suspenduojamas 5-iuose ml sterilaus vandens ir vieną minutę stipriai kratomas Vortex maišiklyje. Po to vieną minutę bandinių ląstelės buvo ardomos ultragarsu ultragarsiniame valytuve, ir eiliniai šaknų skiediniai užnešami ant King’o B terpės [KMB] agaro (proteozės peptonas - 20 g; glicerolis - 10 ml; K₂HPO₄ -1,5 g; MgSO₄

-1,5 g; agaras -15 g; H₂0-1000 ml), praturtinto cikloheksimidu (100 pg ml'¹), chloramfenikoliu (13 pg ml¹) ir ampicilinu (40 pg ml*¹) [KMB⁺j. Plokštelės inkubuojamos 25 °C temperatūroje. Po 48 valandų kolonijos buvo sunumeruotas. Fluorescentinių Pseudomonas spp. kolonijos ultravioletinėje šviesoje (bangos ilgis - 366 nm) buvo atskirtos nuo nefluorescentinių kolonijų.

etapas: Kolonijos kryžminimas (hibridinimas) su specifiniu zondu, siekiant nustatyti Phl gamintojus.

Skaitlingos fluorescentinės Pseudomonas spp. rūšys, turinčios Phl gaminančius genus, nustatomos kolonijos hibridinimu. Bakterijų kolonijų pernešimas į Hybond-N⁺ nailono membranas (Amersham) buvo atliktas standartiniais būdais. Išdžiovintos ore membranos 1 vai. šildytos vakuuminėje krosnyje, 80 °C temperatūroje. Bakterijų ląstelių atplaišoms pašalinti membranos buvo plaunamos 1,5 vai. 42 °C temperatūroje, tirpale, kurio sudėtis: 2 x SSPE (20 mM NaH₂PO₄ [pH 7,4]; 0,36 M NaCI, 2 mM EDTA); 0,1 % natrio dodecilsulfato (SDS) ir proteinazės (100 pg ml¹). Po to

-įsĘ*’·' membranos vėl plautos 1 vai. 56 °C temperatūroje, 2 x SSPE ir 0,1 % SDS tirpale. Hibridinimas atliktas standartiniais būdais, išlaikant itin griežtas sąlygas: 1,5 vai. išankstinis hibridinimas 65 °C temperatūroje, 12 vai hibridinimas 65 °C temperatūroje, du kartus membrana plaunama po 5 minutes kambario temperatūroje 2 x SSC ir 0,1 % SDS tirpale, du kartus ji plaunama 30 minučių 65 °C temperatūroje 0,1 x SSC ir 0,1 % SDS tirpale.

Zondai generuojami iš sekų biosintezės vietose (lokus), sudarančiose

2,4-diacetilflorogliucinolį (genų banko kodo Nr. U41818). Zondas konstruotas iš kamieno Q2-87 vidinių geno Phl D sekų atsitiktinai atžymint PCR fragmentus, naudojant neradioaktyvią DIG sistemą (Boehringer Mannheim). Hibridizuoti zondai buvo imunodetektuojami anti-digoksigenino-AP-Fab fragmentais ir vizualizuoti kolorimetriniais substratais - tetrazolio nitromėlio druska ir 5-brom-4-chlor-3-indolilfosfatu (pagal tiekėjo protokolus).

Norint atskirti Phl gamintojus, membranos signalai sugretinami su kolonijomis, paskleistomis ant agaro plokštelės. Kiekviena individuali kolonija, duodanti signalą membranoje, buvo surinkta, pasėta ir dar kartą pasėta ruoželiais, kol kamienas tapo stabilus ir grynas, t.y. pasidarė biologiškai gryna kultūra. Kiekvienas kamienas po to buvo saugomas glicerolyje, 80 °C temperatūroje, siekiant išlaikyti jį stabilų.

3a etapas (pasirinktinis): Phl gamintojų patvirtinimas PCR būdu.

Šis etapas leidžia iš kolonijos hibridinimo analizės eliminuoti tariamai teigiamus kolonijos hibridinimo signalus.

Šilumos ardomų bakterijų suspensijos, naudotos PCR analizėje, buvo paruoštos iš kultūrų, 48 valandas 25 °C temperatūroje augintų ant KMB. Dvi bakterijų kolonijos (2 mm diametro) buvo suspenduotos 100 pi ližės tirpale (0,05 M-NaOH; 0,25 % SDS) ir inkubuojamos 15 minučių, 100 °C temperatūroje. Po to suspensija centrifuguojama 1 min., esant 12000 aps. per min. ir 50 kartų praskiesta steriliu distiliuotu vandeniu. Kiekvienai reakcijai naudota 5 μΙ praskiestos suspensijos.

Pradmenys ir PCR analizė. Pradmenys - oligonukleotidai, panaudoti PCR, formuojami iš vidinių P. fluorescens Q2-87 struktūros sekų 2,4diacetilflorogliucinolio (Phl) biosintezės vietoje (lokus) (genų banke priėjimo Nr. U41818). Pradmenys buvo susintetinti Operon Techn. Ine. (Alameda, CA). Pradmenys Phl2a (seka: GAGGACGTCGAAGACCACCA) ir Phl2b (seka: ACCGCAGCATCGTGTATGAG) buvo suformuoti iš vidinių phl D struktūros sekų. Tai leidžia prognozuoti baltymą iš 349 aminorūgščių, homologiškąchalkono sintezei iš augalų.

PCR amplifikacija atlikta 25-iuose μΙ reakcijos mišinio, kurio sudėtis: 5 μΙ praskiestos šilumos išardytų ląstelių suspensijos, 1 x GeneAmp PCR buferis (Perkin Elmer Corp., Norvvalk, CT), po 200 μΜ kiekvieno dATP, dTTP, dGTP ir dCTP (Perkin Elmer), 20 pM kiekvieno pradmens ir 2,0 U AmpliTag DNR polimerazės (Perkin Elmer). Kiekvienas mišinys buvo padengtas vienu mineralinės alyvos lašu.

Amplifikacijos atliktos termostate (Perkin Elmer Thermal Cycler 480). PCR programą sudarė pradinis denatūravimas (2 min. 94 °C temperatūroje), lydimas 30 ciklų po 60 sek., esant 94°C; 45 sek., esant 67°C ir 60 sek., esant 72 °C temperatūrai. PCR produktų (po 9 μΙ) pavyzdžiai atskiriami 1,2 % agaro gelyje su 1 χ TBE buferiu (90 mM Tris-boratų 2 mM EDTA; (pH 8,3)) per tris valandas, esant 75 V. Toliau gelis dažomas etižio bromidu (30 min.). PCR produktai vizualizuoti ultravioletiniame transiliuminatoriuje.

etapas: RAPD analizė Phl gamintojų nustatymui pagal identifikuojantį juostinį modelį. RAPD analizė (Random Amplified Polymorphic DNA - atsitiktinė amplifikuota polimorfinė DNR) su pradmeniu M13 atlikta, turint tikslą sugrupuoti skirtingus Phl gaminančius fluorescentinius Pseudomonas kamienus, išskirtus iš šaknų kviečių augintų Quincy, Lind ir Moses Lake TAD dirvožemyje.

DNR amplifikacija atlikta 25 pi reakcijos mišinio, kurio sudėtyje - 5 μΙ praskiestos, šilumos suardytų ląstelių suspensijos, 1 x GeneAmp PCR buferio (Perkin Elmer Corp., Norvvalk, CT) ir po 200 μΜ dATP, dTTP, dGTP ir dCTP (Perkin Elmer), 80 pM pradmens M13 ir 2,0 U Ampli Tag DNR polimerazės (Perkin Elmer). Kiekvienas mišinys užpiltas mineralinės alyvos lašu. Amplifikacijos atliktos Perkin Elmer terminiame ciklų uždaviklyje 480. PCR programą sudarė pradinis denatūravimas (1 min. 30 sek. 94 °C, temperatūroje), lydimas kaskart 2 ciklų procedūrų: 30 sek. 94 °C; 30 sek. 36 °C; 2 min. 72 °C temperatūroje. Po pastarųjų - kaskart 40 ciklų: 20 sek. ciklai 94 °C; 15 sek. ciklai 36 °C, 15 sek. ciklai 45 °C; 1,5 min. ciklai 72 °C temperatūroje. Po to dar vienas 10 min. ciklas 72 °C temperatūroje. PCR produktų pavyzdžiai (po 9 μΙ) atskiriami 2,5 % agaro gelyje, įsodrintame 1 x TBE buferiu (90 mM Tris-borato; 2 mM EDTA (pH 8,3)), 5 valandas, esant 75 V. Po to gelis dažomas etidžio bromidu 60 min.. PCR produktai vizualizuojami ultravioletiniame transiliuminatoriuje.

Išradime pateikti biologiškai gryni fluorescentiniai Pseudomonas kamienai rodo unikalų juostinį modelį, kaip demonstruoja RAPD analizė (pradmuo M13). Fig. 1 rodo P. fluorescens Q8r1-96, ML4.9-96 ir L5.1-96 kamienų juostinius modelius (RAPD spektrą). 1-asis takas rodo laiptelius 1kb kaip palyginamuosius. Iš Fig. 1 matyti, kad išradime pateiktiems kamienams būdingas juostų rinkinys yra: 330±20bp, 600±50bp, 700±50bp, 800±50bp, 900±50bp ir 1100±60bp.

pavyzdys

Šis pavyzdys parodo, kad išradimo pirmojo įgyvendinimo biokontrolės kamienas atkartoja TAD biologinės kovos lygį.

P. fluorescens kamienas Q8r1-96 atskirtas ir daugintas aukščiau aprašytu 1-ajame pavyzdyje būdu. Bakterijos buvo suspenduotos 0,5 % metilceliuliozėje ir sumaišytos su kviečių sėklomis (Cv. Penawawa) doze 10⁴ CFU vienai sėklai. Sėklos, panaudotos kaip kontroliniai bandiniai, gavo tiktai metilceliuliozę. Ouincy plėšininis, Quincy TAD, Pullman pralaidusis ir Pullman TAD dirvožemiai buvo modifikuoti 0,5 % masė/masė) avižų grūdine medžiaga ( 0,25-0,5 mm dydžio), turinčia “iššutimo” patogeno. Po keturias tiriamas sėklas pasėta keturkampiuose plastikiniuose puodeliuose (3 cm x 3 cm), užpildytuose (po 50 g) sijotu natūraliu dirvožemiu, sudrėkintu vandeniu, praturtintu metalaksilu (Novartis, Greensboro, NC) su 2,5 mg/ml aktyvaus kovoje su Pythium ingrediento. Augalai auginti kontroliuojamoje klimatinėje kameroje, 16 °C temperatūroje su 12 vai. šviesos periodu. Du kartus per savaitę puodelių turinys gavo (2:3 tūris/tūris) Hoaglund’o skiedinio (makroelementai). Praėjus keturioms savaitėms, želmenys buvo nupjauti, šaknų ligos būsena įvertinta, daigai sveriami ir matuojami.

Rezultatai pateikti žemiau, lentelėje. Rezultatai rodo, kad įvestas į Ouincy plėšininį ar Pullman pralaidų dirvožemį Q8r1-96 kamienas demonstruoja tokį pat ligos slopinimo mastą, kaip ir Ouincy TAD, Pullman TAD dirvožemiai ar perkeltas į Pullman pralaidųjį Ouincy TAD dirvožemis.

Q8r1-96 kamienas nedidina Pullman TAD dirvožemyje stebimo ligos slopinimo lygio.

₃₅ LT 4785 B

LENTELĖ: Phl gaminančio Pseudomonas fluorescens kamieno

Q8r1-96 ir Ouincy TAD perkelto dirvožemio poveikis “iššutimo” aštrumui natūraliuose dirvožemiuose

Apdoroti dirvožemiaiu)	Phl gamintojaiv) (CFU vienam šaknų gramui)	Ligos v'w) aštrumas	Augalo masėv) (mg)	Daigo aukštisv) (mm)
1 eksperimentas Quincy plėšininis	nerastax)	4,2 a	180 a	106 a
Quincy plėšininis. + Ο8Π-96	4,6x10®a	3,1 b	262 b	133 b
Quincy TAD	3,7x105b	2,5 b	281 b	139 b
2 eksperimentas Puilman Cond. (pralaidus)	nerasta	3,8 a	212 a	142 a
Puilman Cond.+ OuincyTAD (9:1)y)	4,5x105a	2,1 b	335 b	181 b
Puilman Cond.+ Q8r1-96	4,5x107c	2,5 b	288 b	172 b
Puilman TAD	1,3x106b	1,9 b	336 b	184 b
Puilman TAD+ OuincyTAD (9:1)y)	3,5 χ 105 a	2,3 b	286 b	177 b x
Puilman TAD+ Q8r1-96	3,4x107c	2,3 b	306 b	178 b -

^u) Quincy ir Puilman Cond. dirvožemiai - abu praleidus kviečių “iššutimo” ligai, kar tuo tarpu papildymas TAD dirvožemiu slopina “iššutimą”. Mikrofloros suaktyvinimui Quincy plėšininė ir Quincy TAD dirvožemiai buvo kultivuoti kviečiams šešis (kiekvienas po 4 savaites) paeiliui einančius ciklus. Puilman Cond. ir Puilman TAD dirvožemis paimtas tiesiai iš kviečių lauko. Visi dirvožemiai buvo modifikuoti avižų grūdine medžiaga (0,5 % masė/masė), turinčia “iššutimo” patogeno. Apdorotos Q8r1-96 bakterijomis kviečių sėklos gavo 10⁴ CFU vienai sėklai dozę.

^v) Įvesto kamieno Q8r1-96 ar natūraliai susidariusio Phl gaminančio fluorescentinio Pseudomonas spp. populiacijos apimtis, ligos aštrumas, šviežio augalo masė ir daigo aukštis buvo nustatyti po keturių augimo savaičių. Lentelėje pateiktos šešių pakartojimų dviejų augalų pavyzdžių vidutinės reikšmės. Phl gaminančių Pseudomonas spp. populiacijos tankio, augalų masės (šviežių augalų) ir daigų aukščio skaitinių reikšmių skirtumai tarp apdorotų dirvožemių buvo įvertinti Studentized Range testu. Ligos aštrumo skirtumai buvo analizuoti Wilcoxon Rank Sum testu. Kiekvienam eksperimentui ir kiekvienam parametrui skirtingomis raidėmis pažymėti vidurkiai statistiškai tarpusavyje žymiai skyrėsi (a = 0,05).

^w) Iššutimo” ligos aštrumas buvo įvertintas skalėje 0-8 (0 - ligos nėra, 8 - augalas žuvęs).

^x) Žemiau negu 10⁴ CFU · g'¹ šaknų apatinė riba.

^y) Tiek Puilman Cond (praleidus), tiek Puilman TAD dirvožemis maišytas su Quincy TAD dirvožemiu santykiu 9:1 (masė/masė).

pavyzdys

Šis pavyzdys aprašo biologinę kovą su lauke augintų kviečių “iššutimu”. Pseudomonas fluorescens Q8r1-96 buvo išbandomas komerciniame lauke šalia Almoto, WA. Praėjusiais metais šiame lauke buvo nuimtas kviečių derlius. Laukas natūraliai užsikrėtęs “iššutimo” liga.

Eksperimentai. Pavasariniai kviečiai (Alpowa rūšis) buvo pasėti nesuartoje dirvoje į žeminių kviečių ražieną. Atskirtas ir kultivuotas P. fluorescens Q8r1-96 kamienas (žiūr. 1 pavyzdį) 1,5 % metilceliuliozės suspensijoje buvo panaudotas pavasarinių Alpowa kviečių sėkloms doze apie 1x10⁵ ir 1x10⁶ CFU vienai sėklai. Kontroliuota lyginant su neapdorotomis kamienu kviečių sėklomis. Pirmame kontroliniame bandinyje, 2-ojoje lentelėje pažymėtame terminu “dezinfekuota, neapdorotos sėklos buvo pasėtos į metilo bromidu dezinfekuotą dirvą, siekiant patogeną eliminuoti ir sukurti kontrolinį bandinį, pavadintą “sveikuoju”. Kitu atveju, pažymėtu “kontrolinis”, neapdorotos sėklos pasėtos į natūralią dirvą, siekiant sukurti ligotą kontrolinį bandinį. Tyrimo sklypą sudarė 8 eilės (tarpas tarp eilių - 1 pėda). Kiekvienos eilės ilgis - 25 pėdos. Kviečiai buvo nupjauti, praėjus 135 dienoms nuo sėjos.

Rezultatai. Duomenys pateikti 2-oje lentelėje. Kaip matyti iš duomenų kamienas Q8r1-96 sumažino infekuotų augalų skaičių 20 %.

LENTELĖ

Apdorojimo pobūdis	Augalai, užkrėsti “iššutimu”, %a)
Kontrolinis	69,3 A
Q8r1-96	48,0 B
Dezinfekuota	13,3 C

^a) duomenų vidurkiai, pažymėti ta pačia raide diapazone žymiai nesiskiria; P = 0,1; LSD = 21,1 pavyzdys

Šis pavyzdys demonstruoja išradime pateiktų kamienų kolonizavimo gebos pranašumą.

₃₇ LT 4785 B

Išradime pateiktas kamienas Pseudomonas fluorescens Q8r1-96 buvo palygintas su P. fluorescens kamienais M1-96 ir Q2-87 (nesusietais su išradimu). Visi trys kamienai gamina antibiotiką 2,4-diacetilflorogliucinolį ir pasižymi tipiškais P. fluorescens fiziologiniais požymiais ir substrato panaudojimo būdais, aprašytais Bergey žinyne (žiūr. 3 lentelę žemiau). Tačiau išradime pateikti kamienai, atstovaujami pavyzdžio Q8r1-96, turi charakteringą RAPD juostinį modelį, nesusijusį su šio išradimo kamienų spektrais.

LENTELĖ

	Q8r1-96	Q2-87
Dažas pagal Gramą	-	-
Forma	lazdelė	lazdelė
Fluorescuojantis pigmentas	+	+
Oksidazė	+	+
Arginino dihidrolazė	+	+
Gliukozės fermentacija	-	-
β-galaktozidazė	-	-
Želatinos hidrolizė	-	+
Denitrifikavimas	+	+
Panaudojimas:
D-gliukozės	+	+
L-arabinozės	+	+
sacharozės	+	+
propionato	+	+
butirato	-	-
gliucitolio	+	+
adonitolio	-	-
D-manito	+	+
N-acetil-D-gliukozamino	+	+
maltozės	-	-
D-gliukonato	+	+
ka prato	+	+
adipato	-	-
L-malato	+	+
citrato	+	+
fenilacetato	-	-

Šiais tyrimais nustatant kolonizavimo gebą, kiekvienas kamienas buvo įvestas į Quincy plėšininį, Lind plėšininį ir Moses Lake plėšininį dirvožemį _3S LT 4785 B doze kiekvienam dirvožemiui - 100 CFU (bakterijų ląstelės) dirvožemio bandinio gramui (puodelio matmenys - 8 cm aukščio ir 7,5 cm pločio). Kviečiai (Penawawa) kiekviename dirvožemyje buvo auginti 3 savaites. Po to augalai buvo nupjauti, o bakterijų populiacijos ant šaknų nustatomos išsėjant praskiedimo būdu. Dirvožemis ir su juo susieta šaknų sistema buvo perpilama į plastiko maišelį, kratoma, siekiant sumaišyti ir aeruoti. Praėjus savaitei po nupjovimo, kiekvienas dirvožemis grąžinamas į tą patį puodelį jr iš naujo užsėjama kviečiais. Tuo būdu, kiekvieno ciklo trukmė tarp sėjos - 4 savaitės.

Rezultatai. Fig. 2 rodo trijų kamienų populiacijos Quincy plėšininiame dirvožemyje tankį (CFU vienam šaknų gramui) po 9 ciklų. Nesunku pastebėti, kad net po 9 ciklų kamienas Q8r1-96 rodo didesnį populiacijos tankį, negu 10⁵ CFU/šaknų gramui. Priešingai, kamienų (nesusietų su išradimu) M1-96 ir Q2-87 populiacija yra tik 10² CFU vienam šaknų gramui. Kaip matyti iš duomenų išradime pateiktų kamienų kolonizavimo geba viršija kitų biologinės kontrolės kamienų rodiklius; išradime pateikti kamienai kolonizuoja šaknis žymiai intensyviau ir pasižymi plačiu kolonizavimo aktyvumu.

Biologinės kovos aktyvumo palyginimas Quincy plėšininiame dirvožemyje. 9-ajame cikle į dirvą buvo įvestas Ggt užkratas kolonizuotų avižų grūdų pavidalu. Prieš tai užkratas buvo sumaltas ir išsijotas. Po to jo 0,25-0,50 mm dalelės įmaišomos į dirvožemį, esant koncentracijai 0,5 % (masė/masė). “Iššutimo” liga vertinta skalėje 0-8 (aprašyta žemiau). Bakterijos lygintos su kontroliniu bandiniu, kuriame į dirvožemį bakterijų nebuvo pridėta. Augalai buvo auginami puodeliuose (8 cm aukščio ir 7,5 cm pločio) 4 savaites. Duomenys pateikti 4-ojoje lentelėje, žemiau. Kaip matyti iš lentelės, vien tik Q8r1-96 (išradime pateiktas kamienas) slopino ligą. Apdoroti nesusijusiais su išradimu kamienais augalai rodė tą patį ligos mastą, kaip ir kontroliniai (neapdoroti kamienais augalai). Kamieno Q8r1-96 pranašumą slopinant ligą (9-ajame cikle) galima paaiškinti aukštu šaknų kolonizavimo lygiu ir jo pastovumu. Visa tai rodo šio kamieno, kaip biologinės kovos medžiagos, agresyvumą.

LENTELĖ

Kamienas	Ligos aštrumas1)
Q8r1-96	3,33 a 2)
M1-953)	6,42 b
Q2-873)	6,08 b
Kontrolinis bandinys	6,00 b

¹⁾ “Iššutimas” vertintas skalėje nuo O iki 8 (Ovvnley ir kt., Phytopathology 82: 178-184 (1992)), kur 0 - jokia liga nestebima; 1 - <10 % šaknų plote - juodi pakenkimai; 2-10-25 % šaknų plote juodi pakenkimai; 3->25 % šaknų plote juodi pakenkimai ir viena šaknis su stiebo apačios pakenkimu; 4 - daugiau, negu viena šaknis su stiebo apačios pakenkimu; 5 - visos šaknys su stiebo apačios pakenkimu, ir bent vienas pakenkimas stiebo žemutinėje dalyje, tačiau be lapų chlorozės; 6 - daug stiebo pakenkimų ir pirmojo tikrojo lapo chlorozė; 7 - visi lapai chloroziniai ir augalas sunykęs; 8 - augalas žuvęs ar beveik žuvęs.

²⁾ Reikšmių vidurkiai, žymimi ta pačia raide, tarpusavyje žymiai nesiskiria, P = 0,05.

³⁾ Kamienai, nesusiję su išradimu, pateikti tik palyginimui. Fig. Fig. 3-4 rodo trijų kamienų populiacijos tankį (CFU/ vienam šaknų gramui) Lind ir Moses Lake plėšininiuose dirvožemiuose po 7 ciklų, atitinkamai. Akivaizdu, kad net po 7-ų ciklų kamieno Q8r1-96 populiacijos tankis viršija 10⁵ CFU vienam šaknų gramui. Priešingai, kamienai (nesusiję su išradimu) M1-96 ir Q2-87 sumažino populiacijos tankį iki 10² CFU vienam šaknų gramui. Kaip matyti iš duomenų, išradime pateikto kamieno kolonizavimo geba pranašesnė, negu kitų kamienų; jis kolonizuoja šaknis žymiai aukštesniu lygiu ir platesniu kolonizavimo aktyvumu. Aukštesni kolonizavimo rezultatai aktyvesnėje biologinėje kovoje buvo palyginti su nesusijusiais su išradimu kamienais.

Fig. 5 vaizduoja išradime pateikto kamieno P. fluorescens Q8r1-96 kolonizavimo gebą Quincy, Lind ir Moses Lake plėšininiuose dirvožemiuose. Iš pateiktų duomenų matyti, kad išradime pateiktam kamienui dirvos tipas neturi įtakos.

pavyzdys

Šis pavyzdys aprašo pavyzdinių transgeninių, fenaziną gaminančių fluorescentinių pseudomonadų. kamienų konstravimą. Visuose žemiau išvardintuose eksperimentuose naudoti standartiniai plazmidės DNR išskyrimo, apribojimo fermento įsisavinimo, agaro gelio elektroforezės, ligiravimo ir transformavimo būdai (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, K. Struhl, 1995. Short protocols in Molecular Biology. J. VViley and Sons, NY). Visi fermentai (įskaitant apribojimo endonukleazes, T4 DNR ligazę, Klenovv’o DNR polimerazės I fragmentą) ir reikalingi atlikti žemiau nurodytiems eksperimentams reagentai yra perkami firmoje Life Technologies, Gaithersburg, MD. Gelio ekstrakcijos įranga QIAEX II gali būti įgyta firmoje QIAGEN Ine., Chatworth, CA. Ši įranga panaudota DNR ekstrakcijai iš agaro gelių. Escherichia coli kamienas JM109, naudotas visiems DNR klonavimo eksperimentams, gali būti įgytas firmoje Promega Corporation, Madison, Wl. Visi bakterijų kamienai dauginti LB terpėje (Bacto tryptone (Difco Laboratories., Detroit, Ml), 10 g; Bacto mielių ekstraktas (Difco Laboratories Detroit, Ml) - 5 g; NaCI - 5 g; H₂O- 1000 ml).

etapas, phz genų klonavimas, kontroliuojant tac promotoriui.

6,8-kb figfll-Xbal DNR fragmentas, turintis P. fluorescens 2-79 genus phz-A, -B, -C, -D, -E, -F, -G, buvo įterptas į pALTER-Ex1 klonavimo vektoriaus BamHI ir Xba\ klonavimo (dauginimo) vietas. Vektorius turi universalų polilinkerį su stipriu tac promotoriumi klonuotų genų in vivo bei in vitro išreiškimui. pALTER-Exf klonavimo vektorių galima įgyti iš firmos Promega Corporation, Madison, Wl. Po DNR susiuvimo pavyzdys buvo transformuotas į kompetentingas E. coli JM109 ląsteles. Transformantai buvo atrenkami LB agar-agare, modifikuotame 12 pg/ml tetraciklino. LB skystoje terpėje (su tetraciklinu) užaugintos kelios individualios kolonijos buvo panaudotos DNR plazmidės gryninimui, phz biosintezės vietų (lokus) įterpimas buvo patvirtintas įsisavinimu su apribojimo endonukleazėmis.

etapas. Perkeliamų fenazino biosintezės vietų (lokus) kopijų konstravimas.

pALTER Ex1 DNR, talpinanti phz genus, buvo įsisavinta su Seal, Xba\, Hind III apribojimo endonukleazėmis, kurios generavo 6,8-kb; 4,3-kb ir 1,4-kb DNR fragmentus. 6,8-kb Hind\\\-Xba\ DNR fragmentas, talpinantis surištus ₄₁ LT 4785 B su tac stimuliatoriumi phz genus (Fig. 6), buvo atskirtas nuo kitų fragmentų preparatine gelio elektroforeze, išgrynintas nuo agarozės/gelio ir defosforilizuojant užbaigtas Klenovv DNR polimerazės I fragmentu. Šis fragmentas buvo susiūtas su pUC18Sfi klonavimo vektoriaus DNR (M. Herrero, V. de Lorenzo, K. Timis, Journal of Bacteriology 172:6557-6567 (1990)), kuri buvo iš anksto atkirsta EcoRI apribojimo endonukleaze ir dar apdorota Klenovv DNR polimerazės I fragmentu. Susiuvimo mišinys po to buvo transformuotas į E. coli JM109, o transformantai su įterptomis phz vietomis (lokus) išrūšiuoti, pasinaudojus jų kolonijos balta spalva, ant LB agaro, praturtinto 40-čia pg/ml 5-brom-4-chlor-3-indolil-p-D-galaktopiranozido (X-gal) ir 80-čia pg/ml ampicilino. Plazmidės DNR pavyzdžiai, gauti iš transformantų baltųjų kolonijų buvo tuo pat būdu toliau rūšiuojami pagal phz genus, kaip aprašyta aukščiau.

Hibridinė pUC18Sfi plazmidė, turinti phz vietas (lokus), buvo įsavinta su S/žl apribojimo endonukleaze ir susiūta su Sfil atverta pUTKm plazmide (žiūr. Herrero ir kt.). E. coli S17-1 (Zpir) kompetentingos ląstelės toliau buvo transformuotos susiuvimo mišiniu, o transformantai atrinkti LB terpėje; praturtintoje kanamicinu ir ampicilinu (kiekvieno po 100 pg/ml). Kelią individualių kolonijų DNR plazmidė buvo gryninama ir rūšiuojama pagal phz genus, skaldant ląsteles ribojimo endonukleazėmis EcoRI ir Hindlll. Gautos plazmidės pUTKm::phz genetinis žemėlapis pateiktas Fig. 6. E. coli S17-1 (Xpir), talpinanti pUTKm:;phz, buvo panaudota donoro vaidmenyje konjuguojant su Pseudomonas spp..

etapas. E. coli S17-1 (λρϊΓ) konjugacija su Pseudomonas spp. rūšimis.

Plazmidė pUTKm::phz buvo perkelta iš E. coli S17-1 (Xpir) į Pseudomonas fluorescens Q8r1-96, panaudojus kryžminimo techniką, aprašytą Herrero ir kt.. Talpinantis pUTKm::phz donorinis kamienas E. coli S17-1 (λρϊτ) buvo augintas per naktį kratant 37 °C temperatūroje 10-tyje ml skystos LB terpės, praturtintos ampicilinu ir kanamicinu (po 100 pg/ml). Rifampicinui atsparus recipientas - Q8r1-96 kamienas atskirai per naktį buvo augintas 10-yje ml skystos LB terpės (buljono) be antibiotikų. Donorinio ir recipientinio kamienų kultūros buvo atskirai centrifuguotos (5 min., 6000 aps. per min. greičiu) ir ląstelės suspenduotos 1-ame ml šviežios LB terpės. Donorinio E. coli S17-1 (λρι'Γ) kamieno ląstelių suspensijos (30 pi) užlašinta ant 2 x 2 cm plotelio nitroceliuliozės membranos paviršiaus. Pastaroji membrana buvo patalpinta ant LB plokštelės paviršiaus. Po to virš donoro sluoksnio užlašina 20 pi recipientinio kamieno ląstelių suspensijos. Gryna nitroceliuliozės membrana (0,45 mikronų) gali būti įgyta firmoje Bio-Rad’ Laboratories, Hercules, CA. Plokštelės, padengtos membranomis, per naktį brandintos (inkubuotos) 27 °C temperatūroje. Po to ląstelės nuo membranų paviršiaus buvo suspenduotos 1-ame ml sterilaus vandens, nusodintos centrifugavimu (6000 aps./min, 5 min) ir po to suspenduotos 1-ame sterilaus vandens mililitre. Ląstelių suspensija 10-tį kartų praskiesta. Po to 100 pi praskiestos suspensijos išsėta M9 minimalioje terpėje (Na₂HPO₄ x 7H₂O - 21 g; KH₂PO₄-3g; NaCi - 0,5 g; NH₄CI -1,0 g; 1M CaCI₂-0,1 ml; 1 M MgSO₄2 ml; 20% gliukozė - 20 ml; H₂0 - iki 1000 ml), praturtintoje 100 pg/ml kanamicino ir inkubuota 3 dienas 27 °C temperatūroje. Užaugintos M9 kanamicino terpėje kelios recipientinio Q8r1-96 kamieno kolonijos užneštos ant King’o terpės B plokštelių (proteozės peptonas (Difco Laboratories, Detroit, Ml) - 20 g; glicerolis - 10 ml; K₂HPO₄ - 1,5 g; MgSO₄ - 1,5 g; Bacto agar-agaras (Difco Laboratories, Detroit, Ml) - 15 g, H₂O - iki 1000 ml), praturtintų 100 pg/ml kanamicino. Tikrinant buvo patvirtintas fluorescuojančio pigmento produkavimas. Po šio išrūšiavimo klonai buvo auginami per naktį skystoje LB terpėje, paskui saugomi 50 % (tūris/tūris) glicerolyje - 80 °C temperatūroje tolesniems tyrimams.

pavyzdys.

Šis pavyzdys aprašo grybelių in vitro slopinimo bandymus.

Trijų šaknų patogenu (ligos sukėlėjų) augimo slopinimas recipientų

Q8r1-96 kamienais(transformuotais), paruoštais pagal 5-ą pavyzdį, buvo vykdomas bulvių dekstrozės agare (PDA) Petri lėkštelėse. Naudotas būdas panašus į būdą, aprašytą Thomashovv and VVeller, Journal of Bacteriology 170: 3499-3508 (1988), išskyrus kelias, nurodytas žemiau, modifikacijas. Per naktį išlaikytos LB buljone bakterijų kamienų kultūros (3 pi) paskleidžiamos dviejų dėmelių (mikrolašelių) pavidalu priešingose PDA lėkštelės pusėse, 1 cm atstumu nuo lėkštelės šoninių kraštų. Lėkštelės centre patalpinamas patogeno kultūros, išaugintos PDA terpėje, 0,5 cm intarpas nuo vedančiojo krašto. Lėkštelės buvo inkubuojamos 28 °C temperatūroje ir po to skaičiuojama matuojant atstumą tarp bakterijų kolonijos ir grybienos (patogeno) sandūrų. Siekiant slopinti Gaeumannomyces graminis variantą tritici, išlaikytos buljone bakterinės kultūros paskleidžiamos, praėjus 24 valandoms po grybelinio patogeno intarpo patalpinimo. Slopinimas žymėtas 5 dienas po to, kai bakterijos buvo panaudotos.

Slopinant Rhizoctonia solani AG8, bakterijų buljono kultūros paskleidžiamos drauge su patogenu tuo pat metu. Slopinimas žymimas sekančias 5 dienas.

Slopinant Pythium irregulare, išlaikytos buljono terpėje bakterijų kultūros paskleidžiamos 48 valandas prieš grybelinio patogeno patalpinimą. Slopinimo mastas buvo žymimas 2 dienas (skaičiuojant nuo grybelio įvedimo).

Rezultatai pateikti 5-ojoje lentelėje, žemiau. Matome iš duomenų kad transgeninių kamienų Z30-97, Z32-97, Z33-97 ir Z 34-97 slopinimo zonos žymiai platesnės, negu Q8r1-96.

LENTELĖ

Gaeumannomyces graminis var. tritici, Rhizoctonia solani AG8 ir Pythium irregulare in vitro slopinimas motininiu kamienu Pseudomonas fluorescens Q8r1-96 ir transgeniniais dariniais Z30-97, Z32-97, Z33-97 ir Z34-97 (bulvių dekstrozės agaro terpėje)

Slopinimo zonos mastas

Kamienas	Ggt	Rhizoctonia	Pythium
P. fluorescens Q8r1-96	0,50 D	0,17 B	0,47 B
Z30-97	1,55 B	0,55 A	0,80 A
Z32-97	1,13 C	0,53 A	0,70 A
Z33-97	1,66 AB	0,57 A	0,67 A
Z34-97	T,70 A	0,55 A	0,78 A

Ta pačia raide pažymėti vidurkiai menkai tesiskiria tarpusavyje (P = 0,05).

pavyzdys

Šis pavyzdys aprašo rūšiavimo šiltnamyje biologinius bandymus.

Medžiagos ir būdai.

Sėklų apdorojimas: pavasarinių kviečių (Penawawa) sėklos buvo padengtos skirtingomis bakterijų kamienų dozėmis. Kamienai auginti KMB terpėje (Pseudomonas sp.), NBY terpėje (Bacillus spp.) ir suspenduoti 0,5 °/o metilceliuliozėje. Bakterijų suspensija tolygiai paskleidžiama virš visos lėkštelės ir auginama 3 dienas 27 °C temperatūroje. Kiekvienam kamienui buvo paruošta po tris lėkšteles. Bakterijų ląstelės nuimamos, nugremžiant jas į centrifūgos mėgintuvėlį ir du kartus jas praplaunant 40-čia ml sterilaus distiliuoto vandens. Toliau bakterijų ląstelės resuspenduotos 15-oje ml 0,5 %-tų metilceliuliozės, ir buvo sudarytos 10 kartų praskiestos su 0,5% metilceliulioze serijos. 25 g kviečių sėklų kruopščiai sumaišyta su 9 ml bakterijų suspensijos metilceliuliozės tirpale. Sėklos buvo džiovinamos per naktį. Realios bakterijų ląstelių dozės kiekvienai sėklai buvo įvertinamos suskaičiuojant atskiedus lėkštelėje.

Ligos slopinimo bandymai šiltnamyje “Iššutimo” (sukelto Gaeumannomyces graminis varianto tritici (Ggt), šaknų puvinio (sukelto Rhizoctonia solani AG8) ir Pythium šaknų puvinio (sukelto Pythium spp. komplekso, įskaitant Pythium irregulare) slopinantys transgeniniai kamienai buvo tirti, naudojant mėgintuvėlius (Ownley ir kt., Phytopathology 82: 178--184 (1992) bei VVeller ir kt., Plant Disease 69:70713 (1985)). Kiekvieno minėtų trijų patogenų inokuliatas buvo ruoštas 4 savaites auginant kiekvieną patogeną atskirai, autoklave apdorotuose pilnuose avižų grūduose (JAV patentas Nr. 4456684, nurodytas šiame aprašyme kaip analogas). Inokuliatas, prieš jį panaudojant, buvo laikomas šaldytuve. Analizuojamiems pavyzdžiams naudoti mėgintuvėliai buvo pagaminti iš plastiko, turėjo kūgio formą ir skylėtą dugną. Jų ilgis - 20, diametras - 2,5 cm. Mėgintuvėliai pakabinami, naudojant plastikinius dėklus. Kiekvienas mėgintuvėlis užkemšamas su medvilniniais kamuoliukais, o po to pusė mėgintuvėlio tūrio užpildoma smulkiu vermikulitu ir po to - apie 13 gramų paprasto dirvožemio su grunto avižų inokuliatu ar be jo. Tiriant ₄₅ LT 4785 B “iššutimą” ir Rhizoctonia šaknų puvinį, dirvožemis buvo sumaišomas su 1 % (masės/masė) šviežiai kultivuotų avižų grūdų inokuliatu (avižų grūdų dalelės 0,25-0,50 mm apimties). Tiriant Pythium sukeliamą šaknų puvinį, dirvožemis buvo užkrečiamas avižų grūdais, kolonizuotais Pythium irregulare. Po to į kiekvieną Pythium užkrėsto dirvožemio mėgintuvėlį pridedama po 10 ml vandens, o į Ggt ir Rhizoctonia solani užkrėsto dirvožemio mėgintuvėlius - po 10 ml vandens su metalaksilu (Ridomil 0,075 g/l; Norvatis, Greensboro, NC). Sudrėkinus, mėgintuvėliai, talpinantys Pythium irregulare ar Rhizoctonia solani apkrėstą dirvožemį, 48 vai. prieš sėjimą inkubuojami kambario temperatūroje. Mėgintuvėliai, talpinantys Ggt užkrėstą dirvą, užsėjami tuoj pat po sudrėkinimo. Kiekviename mėgintuvėlyje pasodinama po du kviečio grūdus, kurie užbarstomi plonu smulkaus vermikulito sluoksniu ir sudrėkinami 3 ml vandens (Pythium bandymams) ar metalaksilo tirpalu (Ggt, ir Rhizoctonia bandymams). Mėgintuvėlių angos padengiamos plastiku, siekiant išsaugoti reikalingą daiginimui drėgmę. Taip paruošti mėgintuvėliai

4-5 savaitėms patalpinami į šiltnamį (pastovi temperatūra - 16 °C, šviesos laikotarpis - kas 12 vai.). Pasirodžius kviečių daigams (po 3-4 dienų) mėgintuvėliai pradedami drėkinti du kartus savaitėje 5 ml 1/3 stiprumo Hoagland’o tirpalu. Visi eksperimentai atlikti, naudojant Ouincy plėšininį dirvožemį, gautą iš Ouincy, WA, kartojant bandymą 5-6 kartus, 5 mėgintuvėliais kiekvienam pakartojimui. Visų trijų šaknų ligų aštrumas vertintas, nuplovus šaknis nuo įsišaknijimo terpės. Rhisoctonia šaknies puvinio aštrumas apibūdinamas infekuotų šaknų procentais. Pythium infekcijos aštrumas įvertintas daigų išaugimu iš jų aukščiu. “Iššutimo aštrumas įvertintas naudojant Ovvnley ir kt. (1992) 0-8 skalę (žiūr. aukščiau).

Statistinė analizė. Rezultatai buvo analizuoti statistine kompiuterine programa SAS (SAS Institute, Cary, NC). Augimo greitis buvo analizuotas, atlikus arksinusinį duomenų apdorojimą. “Iššutimo” ligos įvertinimo duomenys analizuoti neparametrinės statistikos būdu. Apdorojimo vidurkiai atskirti Fisher*io saugomu mažiausio reikšmių skirtingumo metodu (LSD), esant P = 0,05.

⁴⁶ LT 4785 B

Rezultatai pateikti 6-10 lentelėse, žemiau. Iš 6 lentelės matyti, kad transformuotų kamienų Z30-97, Z32-97 ir Z34-97 dozės 10²-10³ CFU vienai sėklai labiau sumažino Rhizoctonia solani AG8 infekuotų kviečio šaknų procentą, lyginant su panašia motininio Q8r1-96 kamieno doze, su P. fluorescens Z2-79 (fenazino-1-karboksirūgšties genų šaltiniu) ar dviem neapdorotais kontroliniais bandiniais. Motininis kamienas Q8r1-96 Rhizoctonia slopinimo mastu susilygina su Z30-97 ir Z32-97, tiktai kai naudojama didesnė Q8r1-96 dozė. 7-oji lentelė rodo, kad slopinančio Pythium kamieno Z34-97 dozė 10² CFU vienai sėklai tiek pat efektyvi, kaip ir motininio Q8r1-96 kamieno 10³ CFU vienai sėklai dozė. Kamienas Z34-97 ypač efektyviai slopina Gaeumannomyces graminis variantą tritici - Ggt (žiūr. 8 lentelę). Pagal 5-8 lentelių (žemiau) duomenis, Z34-97 sugeba slopinti visas tris šaknų ligas.

LENTELĖ

Kviečio šaknų Rhizoctonia puvinio (Rhizoctonia solani AG8) slopinimas, apdorojant sėklas gamtiniu būdu ir naudojant transgeninius biologinės kovos

Apdorojimo priemonė	CFU vienai sėklai1)	Užkrėstos šaknys, %2)
Metilceliuliozė3) Neapdorota3* Pseudomonas fluorescens 2-795) Pseudomonas fluorescens Q8r1-965,6)	0 0 106 103	60,7 a4) 55.3 ab 48,9 b 37.3	c
Pseudomonas fluorescens Q2-87S)	106	34,8	cd
Pseudomonas fluorescens Q8r1-965,6)	104	30,8	cde
Bacillus spp. L324-925)	107	28,1	def
Transgeninis Z32-97	102	25,1	efg
Transgeninis Z30-97	102	25,1	efg
Transgeninis Z34-97	102	21,6	fg
Transgeninis Z34-97	103	18,8	g

¹⁾ sėklos buvo apdorotos bakterijomis, suspenduotomis 0,5 % metilceliuliozės tirpale, siekiant suteikti sėklai pažymėtas dozes.

²⁾ Rhizoctonia tipiškai pakenktų šaknų dalis, išreikšta procentais (praėjus 4 savaitėms nuo sėjos).

³⁾ Metilceliulioze apdorotos sėklos - apdorotas tik 0,5 % metilceliulioze. Neapdorotos - sėklos niekuo nebuvo paveiktos.

⁴’ Skaitinių reikšmių vidurkiai, pažymėti viena ir ta pačia raide, tarpusavyje žymiai nesiskiria, P = 0,05.

⁵⁾ Nepateikti išradime kamienai, skirti vien palyginimui.

⁶) Motininis kamienas.

LENTELĖ

Kviečio šaknų Pythium puvinio (Pythium irregularė) slopinimas, apdorojant sėklas gamtiniu būdu ir naudojant transgeninius biologinės kovos agentus

Apdorojimo priemonė	CFU vienai sėklai1)	Sudygimas1 2’
Metilceliulioze3’	0	50 d4’
Neapdorota3’	0	54 cd
Pseudomonas fluorescens 2-795’	106	63 cd
Pseudomonas fluorescens Q8r1-965,6’	103	92 ab
Pseudomonas fluorescens Q2-875’	10®	50 d
Pseudomonas fluorescens Q8r1-965,6’	104	71 bcd
Bacillus spp. L324-925’	107	92 ab
Transgeninis Z32-97	102	67 cd
Transgeninis Z30-97	102	67 cd
Transgeninis Z34-97	102	96 a
Transgeninis Z34-97	103	79 abc

¹’ sėklos buvo apdorotos bakterijų suspensija 0,5 % metilceliuliozės tirpale) siekiant suteikti sėklai pažymėtas dozes.

²⁾ Pasirodžiusių daigų skaičius, praėjus 4 savaitėms po sėjos.

³⁾ Metilceliulioze apdorotos sėklos - apdorotos tik 0,5 % metilceliulioze. Neapdorotos - sėklos niekuo nebuvo paveiktos.

⁴’ Skaitinių reikšmių vidurkiai, pažymėti viena ir ta pačia raide, tarpusavyje žymiai nesiskiria, P = 0,05.

⁵⁾ Nepateikti išradime kamienai, skirti vien palyginimui.

⁶⁾ Motininis kamienas.

₄₈ LT 4785 B

LENTELĖ

Kviečio šaknų “iššutimo” puvinio (Gaeumannomyces graminis var. tritici) slopinimas, sėklas apdorojant gamtiniu būdu ir naudojant transgeninius biologinės kovos agentus

Apdorojimo priemonė	CFU vienai Ligos aštrumo sėklai1> įvertinimas2)
Metilceliuliozė3*	0	4,2
Neapdorota3*	0	4,2	ab
Pseudomonas fluorescens 2-795>	10®	3,9	abc
Pseudomonas fluorescens Q8r1-9656)	103	2,9	e
Pseudomonas fluorescens Q2-875)	106	3,7	bcd
Pseudomonas fluorescens Q8r1-965 6)	104	2,9	e
Bacillus spp. L324-925*	107	3,5	cd
Transgeninis Z32-97	102	3,9	ab
Transgeninis Z30-97	102	3,8	abc
Transgeninis Z34-97	102	3,5	d
Transgeninis Z34-97	103	3,4	d

¹⁾ Sėklos buvo apdorotos bakterijomis, suspenduotomis , 0,5 % metilceliuliozės tirpale, siekiant suteikti sėklai nurodytas dozes.²⁾ “lššutimas” buvo vertintas skalėje nuo 0 iki 8 (Ovvnley ir kt., 1992), kurioje: 0 - jokia liga nestebima; 1 - <10 % šaknų srityje - juodi pakenkimai; 2-10-25 % šaknų srityje juosvi pakenkimai; 3->25 % šaknų srityje juosvi pakenkimai ir viena šaknis su stiebo pagrindo pakenkimu; 4 - daugiau negu vienos šaknies stiebo pagrindo pakenkimai; 5 - visos šaknys su stiebo pagrindo pakenkimu, mažiausiai vienas pakenkimas stiebo žemutinėje dalyje, tačiau nėra lapų chlorozės; 6-daug stiebo pakenkimų ir pirmojo tikrojo lapo chlorozė; 7-visi lapai chlorotiniai ir augalas labai sunykęs; 8-augalas žuvęs ar beveik žuvęs.

³⁾ Metilceliulioze apdorotos sėklos - apdorotos tik 0,5 % metilceliulioze. Neapdorota - sėklos niekuo nebuvo paveiktos.

⁴⁾ Skaitinių reikšmių vidurkiai, pažymėti viena ir ta pačia raide, tarpusavyje žymiai nesiskiria, P = 0,05.

⁵⁾ Nepateikti išradime kamienai, skirti vien palyginimui.

⁶⁾ Motininis kamienas.

pavyzdys

Šis pavyzdys aprašo kviečio šaknų kolonizavimą laukiniais ir transgeniniais kamienais.

Rizosferos kolonizavimas. Rizosferos (šaknies plaukelių) kolonizavimas transgeniniais kamienais charakterizuotas naudojant biologinius bandymus mėgintuvėliuose, kaip ir aukščiau aprašyti ligos slopinimo bandymai. Kviečių sėklos, padengtos tiriamo kamieno bakterijų ląstelėmis, buvo pasėtos, esant dozei 10³ CFU vienai sėklai. Skaitinė CFU ant sėklų reikšmė fiksuota po 66 valandų ir po vienos savaitės nuo sėjos. Tai buvo atliekama sėjant KMB terpėje praskiedimo būdu, praturtinus terpę rifampicino ir cikloheksimido priedais (kiekvieno po 100 pg/ml).

Rezultatai pateikti 9-oje lentelėje. Matome, kad išradime pateikti transgeniniai kamienai po 66 valandų ir po vienos savaitės nuo sėjos pasiekė tą patį populiacijos tankį, kaip ir motininis kamienas, praėjus tam pačiam laikui nuo sėjos.

LENTELĖ

Dienų skaičius po sėjos

Kamienasa)	Po 66 vai. (CFUx10z vienai sėklai)	Po 7 dienų (CFUx10z vienam šaknų g)
Pseudomonas
fiuorescens Q8r1-96	1,4 A b)	26,8 A
Z32-97	1,1 A	11,7A
Z33-97	1,1 A	16,2 A
Z34-97	1,1 A	16,0 A
Z30-97	1,5A	13,2 A

^a) kviečių sėklos buvo padengtos 10³ CFU vienai sėklai doze;

^b) skaitinių reikšmių vidurkiai (pagal Fisher’io mažiausio skirtumo testą LSD), pažymėti viena ir ta pačia raide, tarpusavyje skiriasi nežymiai, P = 0,05.

pavyzdys

Šis pavyzdys aprašo fiziologinius požymius ir substrato (maitinančios terpės) panaudojimo ypatumus.

Pavyzdinis Pseudomonas fiuorescens kamienas Q8r1-96 buvo palygintas su P. fiuorescens kamienu Q2-87 (kuris taip pat pasižymi vietomis (lokus), koduojančiomis antibiotiko 2,4-diacetilflorogliucinolio susidarymą). Abiem kamienams būdingi tipiniai P. fiuorescens fiziologiniai požymiai ir substrato panaudojimo ypatumai (žiūr. Bergey žinyną ir 10 lentelę, žemiau).

LENTELĖ

	Q8r1-96	Q2-87
Dažas pagal Gramą	-	-
Forma	lazdelė	lazdelė
Fluorescuojantis pigmentas	+	+
Oksidazė	+	+
Arginindihidrolazė	+	+
Gliukozės fermentacija	-	-
β-galaktozidazė	-	-
Želatinos hidrolizė	-	+
Denitrifikacija	+	+
Panaudojimas:
D-gliukozės	+	+
L-arabinozės	+	+
Sacharozės	+	+
Propionato	+	+
Butirato	-	-
Gliucitolio	+	+
Adonitolio	-	-
D-manito	+	+
N-acetil-D-gliukozamino	+	+
Maltozės	-	-
D-gliukonato	+	+
Kaprato	+	+
Adipato	-	-
L-malato	+	+
Citrato	+	+
Fenilacetato	-	-

Pavyzdys

Šis pavyzdys aprašo RAPD analizę, skirtą transformuotų kamienų identifikavimui pagal charakteringą juostinį modelį.

RAPD analizė naudota (dalyvaujant pradmeniu! M13) transformuotų kamienų ir motininio kamieno Q8r1-96 palyginimui. DNR amplifikuota 25-μΙ reakcijos mišinyje. Mišinio sudėtis: 5 μΙ, praskiestos šilumos paveiktų ląstelių suspensijos, 1 x GeneAmp PCR buferio (Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT), po 200 μΜ dATP, dTTP, dGTP ir dCTP (Perkin Elmer), 80 pM masalo M13 ir 2,0 U AmpliTag DNR polimerazės (Perkin Elmer). Kiekvieno mišinio paviršiuje paskleista po lašą mineralinės alyvos. Amplifikacijos atliktos ₅₁ LT 4785 B termostate (Perkin Elmer Thermal Cycler 480) ciklams realizuoti. PCR programa: pradinis denatūravimas (trunkantis 1 min. 30 sek.) 94 °C temperatūroje, lydimas besikartojančių 2-jų ciklų (režimai: 30 sek., 94 °C; 30 sek., 36 °C; 2 min., 72 °C), po to - besikartojančių 40-ties ciklų (režimai: 20 sek., 94 °C; 15 sek., 36 °C; 15 sek., 45 °C; 1 min.30 sek., 72 °C) ir pabaigoj 1 ciklo (10 min., 72 °C). PCR produktų bandiniai (9μΙ.) atskiriami 1 x TBE buferiu (9 mM triborato, 2 mM EDTA; pH 8,3) įsodrintame 2,5 %-iniame agaro gelyje, 5 vai., 75 V. Gelis buvo dažomas etido bromidu 60min., o PCR produktai vizualizuojami ultravioletiniu transiliuminatoriumi.

Transformuoti kamienai Z32-97, Z33-97, Z34-97 turi šias bendras su motininiu P. fluorescens kamienu Q8r1-96 RAPD juostas: 330±20bp, 600±50bp, 700±50bp, 800±50bp, 900±50bp ir 1100±60bp. Transformuotas kamienas Z30-97 turi šias bendras su motininiu kamienu Q8r1-96 juostas: 600±50bp, 700±50bp, 800±50bp ir 900±50bp.

Claims (4)

1. Fluorescentinio Pseudomonas spp. bakterijų kamieno biologiškai gryna kultūra, turinti biosintezės vietą (lokus), koduojančią 2,4diacetilflorogliucinolio susidarymą.

2. Biologiškai gryna kultūra pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtos fluorescentinio Pseudomonas spp. bakterijos turi biosintezės vietą (lokus), koduojančią stabiliai įvestos į genomą fenazino-1-karboksirūgšties susidarymą.

3. Biologiškai gryna kultūra pagal 1 arba 2 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtoms fluorescentinio Pseudomonas spp. bakterijoms būdingos juostos ties 600±50 bp, 700±50 bp, 800±50 bp, 900±50 bp, identifikuojamos atsitinktinės amplifikuotos polimorfinės DNR (RAPD) analizės metodu, naudojant M13 pradmenį.

4. Biologiškai gryna kultūra pagal 3 punktą, besiskirianti tuo, kad ji dar turi juostas ties 330±20 bp ir 1100±60 bp.

5. Biologiškai gryna kultūra pagal bet kurį iš 1-4 punktų besiskirianti tuo, kad minėtas kamienas sugeba slopinti laukuose auginamų smulkiagrūdžių kultūrų ar velėnos žolių ligas, sukeliamas grybelio Gaeumannomyces graminis (Gg), kai minėtas gebėjimas, pageidautina, yra ekvivalentiškas biologinės kovos lygiui, gautam, kai smulkiagrūdės kultūros auginamos “iššutimo” slopinimo būsenoje esančioje dirvoje.

6. Biologiškai gryna kultūra pagal 1 arba 2 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas kamienas sugeba slopinti augalų šaknų ligas, sukeliamas Rhizoctonia grybelio.

7. Biologiškai gryna kultūra pagal 1 arba 2 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas kamienas sugeba slopinti augalų šaknų ligas, sukeliamas Gaeumannomyces graminis (Gg) ar Pythium grybelių.

8. Biologiškai gryna kultūra pagal bet kurį iš 1 - 4 punktų besiskirianti tuo, kad minėtas kamienas dar sugeba kolonizuoti šaknis tokiu populiacijos tankiu, kurio vidurkis yra mažiausiai 10⁵ koloniją formuojančių vienetų (CFU) vienam šaknų gramui, įskaitant susijusį rizosferos dirvožemį, bent 5-is vienas po kito einančius auginimo ciklus.

₅₃ LT 4785 B

9. Biologiškai gryna kultūra pagal 8 punktą, besiskirianti tuo, kad kamieno minėtas šaknų kolonizavimo sugebėjimas nepriklauso nuo dirvos tipo.

10. Biologiškai gryna kultūra pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad minėtas fluorescentinis Pseudomonas kamienas turi identifikuojančias P. fluorescens charakteristikas NRRL B-21806, NRRL B-21807, NRRL B21808, NRRL B-21905, NRRL B-21906, NRRL B-21907 ar NRRL B21908 (deponuota Agricultural Research Culture Collection (NRRL), 1815 Norht University Street, Peoria, Illinois 61604).

11. Biologiškai gryna kultūra pagal 1 punktą, besiskirianti tuo, kad joje dar yra agrokultūrinis nešiklis.

12. Bakterijų rūšiavimo būdas, skirtas atrankai kamienų turinčių savybes pagal 1 ar 3 punktus, .besiskiriantis tuo, kad jis apima šiuos etapus:

(1) smulkiagrūdžių kultūrų ar velėnos žolių kultivavimą vienas po kito einančiais ciklais natūraliai “iššutimą” slopinančiame dirvožemyje, siekiant jį praturtinti Phl gaminančiais fluorescentiniais Pseudomonas spp., kuris apima šias stadijas:

(a) smulkiagrūdės kultūros ar velėnos žolių sėklų auginimą “iššutimą” slopinančiame (TAD) dirvožemyje mažiausiai 3 savaites šiltnamyje, sąlygomis, užtikrinančiomis minėtų smulkiagrūdžių kultūrų arba velėnos žolių daigų pasirodymą;

(b) minėto auginimo dirvožemio bei minėtos smulkiagrūdės kultūros arba velėnos žolių daigų augintą minėtame dirvožemyje, šaknų surinkimą bei jų sumaišymą;

(c) stadijų (a) ir (b) pakartojimą bent 4-is vienas po kito einančius pilnus ciklus, kur (b) mišinį naudoja sėklų daiginimui po to einančiame cikle;

(2) potencialiai slopinančių fluorescentinių Pseudomonas bakterijų kamienų išskyrimą iš smulkiagrūdės kultūros ar velėnos žolių šaknų bei susijusios rizosferos dirvožemio, paeiliui kultivuotų 1-ajame etape, auginant minėtus kamienus Pseudomonas atrankai tinkamoje terpėje tiek laiko ir tokiomis sąlygomis, kurios yra veiksmingos Pseudomonadų auginimui bei kamienų, auginamų terpėje, atrankai;

(3) atskirtų (2)-ame etape kamienų rūšiavimą, siekiant atrinkti kamieną, pasižymintį biosintezės vietomis (lokus), koduojančiomis 2,4-diacetilflorogliucinolio (Phl) susidarymą, kryžminant minėtų kamienų koloniją su

2,4-diacetilflorogliucinoliui specifiniu zondu ir atrenkant kamienus, kurie kryžminasi su minėtu zondu;

(4) atsitiktinės amplifikuotos polimorfinės DNR (RAPD) analizės atlikimą naudojant M13 pradmenį ir atrinkimą kamienų, kaip Gg slopinančių kamienų, kurie turi juostas ties 600±50 bp, 700±50 bp, 800±50 bp ir 900±50 bp.

13. Būdas pagal 12 punktą, besiskiriantis tuo, kad jame dar yra etapas, įterptas tarp (3) ir (4) etapų, į kurį įeina Phl gaminančių kamienų patvirtinimas naudojant pradmenis, kurie amplifikuoja sekas su Phl biosintezės vietomis (lokus), bei teigiamą PCR reakciją rodančių kamienų atrinkimas.

14. Kovos su šaknų liga, sukelta Rhizoctonia, Pythium ar Gaeumannomyces graminis (Gg) grybelių jautriuose šiai šaknų ligai augaluose, būdas, b e siskiriantis tuo, kad jis apima minėto augalo auginimą, esant veiksmingam biologinei kovai kiekiui fluorescentinio Pseudomonas kultūros kamieno pagal bet kurį iš 1-4 punktų.

15. Būdas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtą augalą parenka iš smulkiagrūdžių kultūrų, velėnos žolių arba maistinių, pluoštinių bei dekoratyvinių augalų grupės.

16. Būdas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad dirvą ar vagas, skirtas smulkiagrūdėms kultūroms ar velėnos žolėms auginti, prieš minėtą auginimą apdoroja veiksmingu biologinei kovai su Gg minėto kamieno kiekiu.

17. Būdas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtą velėnos žolę apdoroja bakterinio apdorojimo tirpalu, kuris turi veiksmingą biologinei kovai su Gg minėto kamieno kiekį ir kamienui tinkamą skystą nešiklį.

₅₅ LT 4785 B

18. Būdas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad naudojamas minėtas Pseudomonas kamienas yra P. fluorescens kamienas, turintis identifikuojančias charakteristikas NRRL B-21806, NRRL B-21807, NRRL B-21808, NRRL B-21905, NRRL B-21906, NRRL B-21907 ar NRRL B21908 (deponuota Agricultural Research Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, llinois, 61604).

19. Būdas pagal 15 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėtų augalų sėklas apdoroja taip, kad koncentracija būtų apytikriai nuo 10² iki 10⁶ CFU vienai sėklai.

20. Būdas pagal 17 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėto apdorojimo tirpalo koncentracija yra nuo 10⁸ iki 1O¹⁰ CFU vienam tirpalo mililitrui.

21. Būdas pagal 14 punktą, besiskiriantis tuo, kad minėto augalo šaknis panardina į bakterinę suspensiją, kurios koncentracija yra 10²-10⁵ CFU vienam suspensijos mililitrui.

22. Agrokultūrinė kompozicija, skirta kovai su šaknų liga, sukelta Rhizoctonia, į

Pythium ar Gaeumannomyces graminis grybelio(Gg) jautriuose šiai šaknų ligai augaluose, besiskirianti tuo, kad jos sudėtyje yra tinkamas $ nešiklis ir veiksmingas biologinei kovai kiekis biologiškai grynos ų fluorescentinio Pseudomonas kamieno kultūros pagal vieną iš 1-4 punktų. ų

23. Agrokultūrinė kompozicija pagal 22 punktą, besiskirianti tuo, kad, joje nešiklis yra parinktas iš grupės, sudarytos iš vandens, buferio, metilceliuliozės, durpių ir vermikulito.

24. Agrokultūrinė kompozicija pagal 22 punktą, besiskirianti tuo, kad, joje minėto kamieno koncentracija yra 1O⁸-1O¹⁰ CFU vienam skysto nešiklio mililitrui arba 10⁷-10⁹ CFU vienam kieto nešiklio gramui.

25. Agrokultūrinė kompozicija pagal 22 punktą, besiskirianti tuo, kad joje minėtas Pseudomonas kamienas yra P. fluorescens kamienas, turintis identifikuojančias charakteristikas NRRL B-21806, NRRL B-21807, NRRL B-21808, NRRL B-21905, NRRL B-21906, NRRL B-21907 ar NRRL B21908 (deponuota Agricultural Research Culture Collection (NNRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604).

26. Smulkiagrūdės kultūros sėkla, besiskirianti tuo, kad jai yra panaudotas veiksmingas biologinei kovai biologiškai grynos kultūros pagal vieną iš 1-3 punktų kiekis.

27. Sėkla pagal 26 punktą, besiskirianti tuo, kad jos koncentracija yra 10²-10⁵ CFU vienai sėklai.

28. Transgeninio fluorescentinio Pseudomonas bakterijų kamieno, turinčio savybes pagal 1 ir 2 punktus, gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad jis apima;

(1) genų, turinčių fenazino-1-karboksirūgšties vietas (lokus), koduojančias fenazino-1-karboksirūgšties susidarymą, klonavimą, kontroliuojant promotoriui;

(2) kilnojamos klonuotos fenazino-1-karboksirūgšties vietos (lokus) kopijos konstravimą perdavimo sistemoje, gebančioje tarpininkauti minėtos fenazino-1-karboksirūgšties vietos (lokus) stabiliam įterpimui recipientiniame fluorescentiniame Pseudomonas kamiene bei minėtos perdavimo sistemos įdėjimą į donorinį bakterinį kamieną; ir (3) bakterijų ląstelėms konjuguojant, perdavimo sistemos stabilų įterpimą iš minėto donorinio bakterinio kamieno į recipientinį motininį Pseudomonas kamieną, turintį biosintezės vietą (lokus), koduojantį 2,4diacetilflorogliucinolio susidarymą ir turintį juostas ties 600±50 bp, 700±50 bp, 800±50 bp ir 900±50 bp, identifikuojamas atsitiktinės amplifikuotos polimorfinės DNR analize (RAPD), naudojant M13 pradmenį, siekiant tokiu būdu gauti transformuotą fluorescentinį Pseudomonas spp. bakterijų kamieną, turintį biosintezės vietą (lokus), koduojančią stabiliai įtvirtintos jo genome fenazino-1-karboksirūgšties susidarymą, ir turintį biosintezės vietą (lokus), koduojančią 2,4-diacetiIflorogIiucinolio susidarymą.