KR20010032306A - 뿌리 질병을 조절하기 위한 생조절제 - Google Patents

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젱유 후앙
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마이클 디. 러프
미합중국 농무부
추후제출
워싱턴주립대학 연구소
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Abstract

형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종은 라이족토니아(Rhizoctonia), 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis) 및 피티움(Pythium)에 의해 유발되는 질병을 조절하데에 효과적이다. 생조절 균주는 특유의 띠모양으로 나타나는 고유의 유전자형을 가지고 있으며, 종래의 Gg 억제 균주에 비하여 뿌리상의 개체 밀도가 높고 군집 활성이 확대되어 뿌리 군집력이 우수하다. 생조절 균주의 또 다른 특성은 맥류마름병 감퇴 토양에서 자연발생적으로 나타나는 같은 정도의 생조절 능력이 있다는 것이다. 또한, 이와 같은 균주의 분리와 확인 방법, 그리고 Gg에 의한 질병 조절에의 이용 등이 제공된다. 항생성 2,4-디아세틸플로로글루시놀의 생성을 암호화하는 유전자 자리를 가지고, 항생성 페나진-1-카르복시산 생성을 암호화하는 생합성 유전자 자리가 그 게놈에 안정하게 삽압된 형광성 슈도모나스 유전자 변이군도 개시된다.

Description

뿌리 질병을 조절하기 위한 생조절제{BIOCONTROL AGENTS FOR CONTROL OF ROOT DISEASES}
라이족토니아, 게우만노마이세스 그라미니스(Rhizoctonia, Gaeumannomyces graminis) 및 피티움(Pythium)에 의해 유발되는 뿌리 질병은 세계적으로 주요 곡물의 생산에 심각한 피해를 주고 곡물 수확량을 감소시켜 막대한 경제적 손실을 초래한다. 토양 전파성 균류인 게우만노마이세스 그라미니스(Gg)(특히, 트리티시 변종(Ggt))에 의해 유발되는 뿌리 질병인 맥류마름병과, 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)와 알. 오리제(R. oryzae)에 의해 유발되는 라이족토니아 뿌리 부패병과, 몇 가지 피티움(Pythium), 특히 피티움 울티뭄(Pythium ultimum)과 피. 이레귤라레(P. irregulare)에 의해 유발되는 피티움 뿌리 부패병은 전세계적으로 밀, 보리, 라이밀 및 호밀과 같은 소형 곡물류가 걸리기 쉬운 주요 뿌리 질병이다.
균류의 담자균류 강에 속하는 라이족토니아(Rhizoctonia)는 전세계적으로 소형 곡물류, 잔디, 아스파라거스, 카놀라, 옥수수, 사탕무, 토마토, 감자, 완두, 벼, 콩, 대두, 딸기, 주키니 및 면화를 포함하는 대부분의 식용 식물과 섬유 식물 및 관상 식물의 뿌리와 줄기의 부패를 유발한다. 라이족토니아(Rhizoctonia)에 의해 유발되는 소형 곡물류의 뿌리 부패병은 오스트레일리아의 태평양 북서부 연방 국가 전지역과 남아프리카, 및 잠재적으로는 소형 곡물을 재배하고 특히, 경작이 적거나 거의 않는 (직접 구멍뚫기로 농작물을 재배하는) 전세계의 온대 지역 전체에서 발생한다. 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG8에 의해 발생하는 라이족토니아 뿌리 부패병은 종자근과 관근의 갈색의 썩은 부위로부터 시작하여 종국에는 껍질이 둥글게 벗겨지고 뿌리가 절단된다. 이 질병에 걸려서 뿌리가 잘려진 식물은 성장이 멈추고 결국은 이삭을 맺지 못하고 죽는다. 이와 같은 질병은 주로 밭작물에 피해를 주므로 보리밭 질병, 퍼플 패치, 크레이터병 및 보리 왜화병과 같은 별명으로도 부른다. 소형 곡물류 중에서도 보리는 특히 알. 솔라니(R. solani) AG8에 걸리기 쉽다. 라이족토니아 오리제(Rhizoctonia oryzae)는 발아하는 종자의 씨눈을 감염시켜서 발아를 방해하거나, 건강한 실생 식물이 다섯 개 내지 여섯 개의 뿌리를 생성시킨다고 할 때 겨우 한 두 개의 종자근만이 성장하게 된다. 라이족토니아 시리얼리스(Rhizoctonia cerealis)와 함께 이들 두 가지 라이족토니아(Rhizoctonia) 종과 그밖에 다른 라이족토니아(Rhizoctonia) 종은 토양, 재배 방식, 잡초 관리법, 및 아직 밝혀지지 않은 다른 요인에 따라 서로 복합적으로 발생한다.
피티움(Pythium) 종의 토양 전파성 병원균 복합체는 농업용 토양 속에서 사는 모든 미생물 군체 중에 존재하는 일단의 균류로 이루어진다. 전세계의 거의 모든 경작 토양이 적어도 한 가지 이상, 많게는 열 가지 피티움(Pythium) 종의 포자를 포함하는 것으로 추정된다. 라이족토니아(Rhizoctonia)와 같이 균류의 난균강의 일원이 피티움(Pythium)은 사실상 전세계의 모든 식용 식물, 섬유성 식물 및 관상 식물을 전염시킨다. 상기에 이들 식물의 예를 들었다. 소형 곡물의 피티움(Pythium) 피해는 씨눈 감염과 이와 관련한 부진한 발생 또는 생장의 정지로 시작되어 잔뿌리와 뿌리털이 파괴되는 것으로 진행된다. 피티움 뿌리 부패병에 걸린 식물은 이 질병이 잔뿌리와 뿌리털의 파괴를 통해 뿌리의 흡수 능력을 저하시키므로 충분한 비료를 주지 않은 식물처럼 된다. 곡류작물, 발아 종자의 씨눈, 뿌리 선단 및 잔뿌리, 섬세하고 여린 모든 분열 조직을 공격할 수 있는 피티움(Pythium)에는 몇 가지 종류가 있다.
소형 곡물류와 볏과 식물이 잘 걸리는 병은 균류의 자낭균의 하나인 토양 전파성 균류 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)(Gg)에 의해 유발되며 수확량 감소에 따른 막대한 경제적 손실을 초래한다. 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시(Gaeumannomyces graminis var. tritici)(Ggt)가 유발하는 맥류마름병은 전세계의 모든 밀 경작지에서 발생하며 밀과 소형 곡물이 걸리기 쉬운 가장 중요한 뿌리 질병이다. 밀의 맥류마름병의 증상은 어두운 색의 세로줄이 발생하며 심한 경우에는 균류에 의한 질병이 밀의 부화관(관근이 발생하는 장소)에까지 전파되어 뿌리 전체가 검게 변한다. 매우 심하게 감염된 밀은 균류가 부화관에 퍼졌을 때와 같이 꼭지가 식물의 상부에 이르는 수로에서 떨어져 나가 결국은 식물이 어려서 죽게 된다. 이로 인한 밀의 손실은 예상 수확량의 50%에 이른다. 이 질병에 걸리지 않도록 개발된 밀의 품종은 없으며 등록된 살균제도 효과가 별로 없다. 또한, 재배자들도 토양의 감염을 줄이기 위해서 점차로 밀을 적게 재배하거나 재배하지 않으려 하고 있다. 이와 같은 경향이 맥류마름병이나 다른 뿌리 질병을 심화시키게 된다. 특히 밀이 맥류마름병에 걸리기 쉽지만, 보리, 호밀 및 라이밀과 같은 다른 볏과 식물도 걸릴 수 있다.
종래에는, 곡물의 윤작과 경작을 통하여 병원균의 접종물을 줄이는 방식으로 맥류마름병을 예방하였다. 그러나, 오랜 윤작은 경제적으로 실행하기가 쉽지 않고 경작은 토양이 감염되는 기회가 되기 때문에 곡물 생산의 경향이 경작을 줄이고 휴지기 이전에 밀작물을 두 세 번 수확하는 경향이 생겼다. 아직까지는 맥류마름병에 대한 억제 유전자나 화학적 제어 방법이 알려져 있지 않고 있다. 보다 지속적이고 화학 살충제에 덜 의존적인 농업이 요구됨에 따라 맥류마름병과 그밖에 다른 토양 전파성 질병을 해결하기 위한 대안 방법의 개발이 절실하다.
다른 Gg 진균인 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시(Gaeumannomyces graminis var. tritici)(Ggt)는 귀리와 볏과 식물을 감염시키며, 겨이삭과 같은 볏과 식물의 맥류마름병을 유발하는 것으로 확인되었다. 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시(Gaeumannomyces graminis var. tritici)(Ggt)는 일부 볏과 식물을 감염시키며 벼에서 관근 엽초를 썩게 만든다.
모든 농업 토양이 Ggt와 그밖에 다른 토양 전파성 병원균에 대하여 어느 정도 길항작용을 한다. 이 것을 ″일반 억제″(N. Gerla호, Netherlands Journal of Plant Pathology 74: (Suppl. 2) 1-97 (1968))나 ″일반 길항작용″(D. Hornby, Annual Review of Phytopathology, Annual Reviews Inc. Palo Alto, CA (1983), pp. 65-85)라고 한다. 일반 길항작용은 토양에의 전반적인 미생물 활동에 의한 것이다. 또한, (맥류마름병 증세의 감퇴로 알려진) Ggt의 ″특수″ 억제(생물학적 제어)가 ″일반 억제″의 위에 놓여지는 일정한 환경에서 진행되어 맥류마름병을 거의 완전히 제어하기도 한다. 맥류마름병 감퇴(TAD)는 맥류마름병의 자연적인 생물학적 제어이며, 질병이 자연발생적으로 약화되고 Ggt에 걸리기 쉬운 밀이나 보리와 같은 소형 곡물류를 단식 재배하였을 때 수확량이 증대된다. TAD는 50년 훨씬 이전에 관찰되었으며, 이제는 전세계적인 현상으로 인정되고 있다. 전세계적으로 TAD의 유사성은 광범위한 토양의 종류, 기후, 및 밀, 보리 및 그밖에 다른 소형 곡물이 경작되는 농경 조건에 있어서 주목할 만하다. 이 분야의 연구에 의하면, TAD는 소형 곡물은 연속 재배하고 맥류마름병의 병원균이 존재하는 것을 조건으로 한다. 토양의 종류나 이전의 재배 내력과 같은 요인은 TAD의 진행 정도와 속도에만 영향을 주는 것으로 밝혀졌다. 맥류마름병이 종국에는 약화된다는 사실에도 불구하고, 대부분의 재배자들이 일시적인 손실이 막대할 수 있기 때문에 단일 재배를 조급하게 포기한다. 그러나, 일단 TAD가 진행되면 수확량이 회복되고 단일 재배가 지속되는 동안에는 TAD가 유지된다. TAD의 실제 이용함으로써 맥류마름병의 자연적인 생물학적 제어 능력을 얻을 수 있다. 그러나, 일시에 대한 연구가 대부분 한정되어 있으며 특정한 TAD 발생에 대한 충분한 이해가 되어 있지 않고 있다. 이와 유사한 Gga에 의한 맥류마름병의 감퇴는 잔디에서도 나타난다.
자연적인 맥류마름병 억제에 관여하는 매커니즘을 밝히기 위한 노력으로 TAD에 대한 연구가 광범위하게 이루어졌다. 이 현상을 설명하는 가장 일반적인 이론에 의하면, 토양의 미생물학적 상태가 변하여 길항작용을 하는 박테리아가 증식하여 발병과 균류의 개체군에 변화가 생기고, 보호성 균류가 발생한다는 것이다(D. Hornby in ″Take-All Decline: A Theorists's Paradise″, Soil-borne Plant Pathogens, Ed. B. Schippers and W. Gams, Academic Press, New York (1979), pp. 133-156; D. Hornby, Annual Review of Phytopathology, Annual Reviews Inc., Palo Alto, CA (1983), pp. 65-85). Hornby는 이와 같은 사실들을 검토하여 한 가지 메커니즘으로는 전세계의 TAD 현상을 설명할 수 없다고 결론지었다. 이 사실은 질병 억제성 토양에서 작업하는 이들에게 보편적으로 받아들여지고 있다.
가장 일반적으로 알려진 TAD에 대한 설명은 맥류마름병의 병원균과 소정의 길항작용을 하는 뿌리 관련 미생물 사이의 미생물학적 상호작용에 기초하고 있다(R. J. Cook and A. D. Rovira, Soil Biology and Biochemistry 8: 269-273 (1976)). 몇 가지 증거가 Ggt 억제에 대한 미생물의 길항작용을 뒷받침하고 있다. 예를 들면, 맥류마름병이 전파된 토양에 소량(1-10 % w/w)의 TAD(억제성) 토양을 섞으면 억제성이 전이된다. 또한, 토양을 습한 열(60 ℃, 30 분)로 멸균시키고 브롬화메틸로 토양을 훈증 소독하거나 병원체의 숙주가 아닌 작물을 재배하는 경우에는 TAD 토양의 억제성이 사라진다.
TAD에 관련된 미생물의 길항작용 연구는 특정한 Ggt 길항작용을 하는 미생물을 밝혀 내어 이들 미생물을 토양에 이식시켜 억제성을 재생시키는 것에 중점을 두었다. TAD 토양 중에 길항작용을 담당하는 특정 균주들이 서로 다를 것이라는 보편적인 생각에 따라 각종 미생물을 시험하였다. Cook과 Rovira는 1976년에 길항적인 미생물들 중에서 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종이 TAD에 중요한 역할을 할 것이라는 가정을 하였다. 미국 특허 제 4,456,684 호는 맥류마름병의 균류와 그밖에 다른 Gg 균류에 의해 발생하는 질병을 억제하는 슈도모나스 균주와 이들을 선택하여 이용하는 방법을 설명하고 있다.
많은 효과적인 균주들이 길항적 2,4-디아세틸플로로글루시놀(Ph1)을 생성하였다(C. Keet et al., Applied and Environmental Microbiology 62:552-563 (1996)). Ph1은 맥류마름병 병원균을 비롯하여 각종 박테리아, 바이러스 및 균류에 대한 억제 활성을 갖는 페놀 대사물이다(L. S. Thomashow and D. M. Weller, In: G. Stacey and N. T. Keen (eds.) Plant-microbe Interactions, Vol. I, Chpman ＆ Hall, Ltd. London, pp. 187-236 (1996)). J. M. Raaijmakers 등은 Ph1 생성 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종이 워싱턴주(미국)에서 채취한 세 가지 TAD 토양에서 재배한 밀의 뿌리에 존재한다고 보고하고 있다. TAD 밭과 가까운 지역에서 채취한 맥류마름병 전파성 토양에서는, Ph1 생성 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종이 검출되지 않았거나 TAD 토양보다 적어도 40배 적은 밀도로 검출되었다. 미생물에 의한 생조절제가 토양 전파성 병원균을 억제하는 데에 실제적인 수단으로 이용되고 있지만, 맥류마름병에 대하여 등록되었거나 특허받은 모든 생조절제가 일관성 없이 작용하고, 토양에 따라 다르며, TAD 토양에서 관찰된 제어 수준을 그대로 재현하지 못하는 등의 문제를 가지고 있다. 시험한 모든 미생물들이 TAD와 관련한 균주에서 예상되는 질병 제어 능력을 증명하지 못하였다. 그러므로, 아직까지 맥류마름병을 억제하는 생조절제가 상용화되지 못한 것이 당연하다 할 것이다. 그러므로, TAD 토양의 억제성을 재현하고 토양의 종류와는 무관하게 효과적인 맥류마름병 생조절제의 개발이 요구된다.
맥류마름병이나 라이족토니아 뿌리 부패병을 유발하는 병원균은 기생 활동을 통해 숙주 식물의 조직에 있는 균사와 같이 생존한다. 피티움(Pythium) 종은 기생을 통해 식물로부터 빼앗은 영양분에서 생성된 후벽 포자와 같이 토양에서 살아간다. 한 가지 뿌리병이 지배적으로 나타나지만, 세 가지 질병이 같은 식물에 동시에 발병하는 것이 보통이다.
피티움(Pythium) 종은 소형 곡물을 재배하는 농업용 토양에 편재하고 있지만, 모종 발생과 생장력에 감소를 가져오는 등의 피티움(Pythium) 종에 의한 소형 곡물의 피해 젖어 있는 토양, 특히 토양에 원래 진흙이 많고 pH 값이 6.0 이하인 경우에는 최대가 된다. 한 가지 곡물을 추수한 후 다음 곡물을 심기 하루 내지 이틀 전까지 자생 곡물(추수 때 흙 위에 떨어진 씨앗에서 자란 식물)이 자라고 글리포세이트(Round-upⓡ, Monsanto)와 같은 제초제와 함께 살포하면 잡초를 제거하면서도 피티움 뿌리 부패병과 라이족토니아 뿌리 부패병에 유리하게 된다. 흙에 살수기로 배수하여 젖은 상태로 두거나 흙을 밀짚을 덮어두고 이전에 밀을 재배한 밭에 밀을 직파하면 세 가지 뿌리 부패병이 모두 발생하게 된다.
밀, 보리 및 그밖에 다른 곡물의 많은 질병들은 병원균에 저항력이 있는 각종 곡물을 품종 개량함으로써 통제할 수 있다. 그러나, 이와 같은 방법은 주로 잎병에 유효하지만 밀, 보리, 라이밀 또는 호밀의 뿌리 질병에는 효과가 없다. 맥류마름병에 대한 저항력의 유일한 자원은 매우 멀리 떨어진 2배체 동류인 데이사피룸 빌로숨(Daysapyrum villosum)이지만, 이와 같이 분류학적으로 먼 거리로 유전자를 전달하는 것이 어려우므로 소용이 없다. 현재로는 맥류마름병, 라이족토니아 뿌리 부패병 또는 피티움 뿌리 부패병에 저항력이 있는 상용 밀, 보리, 호밀 또는 라이밀은 전세계에 존재하지 않는다.
식물에서 균류 병원균을 생물학적으로 통제하기 위한 방법으로는 병원균에 대하여 특이적인 활성을 갖는 슈도모나스(Pseudomonas) 종의 세균성 균주를 포함한다. 미국 특허 제 4,456,684 호는 맥류마름병과 그밖에 다른 Gg 균류에 의한 질병을 억제하는 슈도모나스(Pseudomonas) 균주에 관한 것이다. 질병의 자발적인 약화와 Ggt에 걸리기 쉬운 소형 곡류작물의 단일 재배로 인한 수확량의 증가로 정의되는 맥류마름병의 자연 생물학적 통제인 맥류마름병 감퇴에 관련된 미생물의 길항작용에 대한 연구는 특정한 Ggt-길항적인 미생물을 확인하여 이들 유기물을 토양에 이식시켜 맥류마름병을 억제하는 것에 중점을 두었다. 효과적인 많은 균주들이 항생 2,4-디아세틸플로로글루시놀(Ph1)을 생성하였다(C. Keel et al., Applied and Environmental Microbiology 62:552-563 (1996)). J. M. Raaijmakers 등(Applied and Environmental Microbiology 63:881-887 (1997))은 Ph1을 생성하는 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종이 워싱턴주(미국)에서 채취한 세 가지 TAD 토양에서 자란 밀의 뿌리에 존재한다고 보고하였다. 미생물에 의한 생조절제가 토양 전파성 병원균을 억제하는 데에 실제적인 수단으로 이용되고 있지만, 맥류마름병에 대하여 등록되었거나 특허받은 모든 생조절제가 일관성 없이 작용하고, 토양에 따라 다르며, TAD 토양에서 관찰된 제어 수준을 그대로 재현하지 못하는 등의 문제를 가지고 있다.
미국 특허 제 4,647,533 호는 피티움(Pythium)에 의해 유발된 질병을 억제하는 슈도모나스(Pseudomonas) 종에 관하여 설명하고 있다. 면화에 전염되는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)나 피티움 울티뭄(Pythium ultimum)을 억제하는 슈도모나스(Pseudomonas) 박테리아 균주가 보고되었다(참조: Howel 등이 등록한 미국 특허 제 5,348,742 호). 바실러스(Bacillus) 종 L324-92는 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis) 종과 라이족토니아(Rhizoctonia) 종과 피티움(Pythium) 종을 동시에 억제하는 것으로 보고되었다(Kim et al., Phytopathology 87:551-558 (1997)). 그러나, 이들 세 가지 병원균을 모두 억제할 수 있는 한 가지 슈도모나스(Pseudomonas) 균주는 보고된 바 없다.
본 발명은 형광성 슈도모나스 종(spp.)의 균주를 이용하여 한 가지 이상의 라이족토니아(Rhizoctonia), 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis) 및 피티움(Pythium)에 의해 유발되는 식물성 뿌리 질병을 생조절하는 것으로, 특히 소형 곡물류의 뿌리에서 증식할 수 있고 소형 곡물류의 뿌리 부패병과 질병, 그리고 잔디의 맥류마름병을 생조절할 수 있는 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항생 2,4-디아세틸-플로로글루시놀의 생성을 암호화하는 생합성 유전자 자리를 포함하고 특징적인 유전자 띠모양으로 나타나는 특유의 유전자를 갖는 생조절 균주의 분리와 동정, 그리고 게놈에 안정하게 도입되는 항생 페나진-1-카르복시산의 생성을 암호하는 생합성 유전자 자리를 부가적으로 포함하는 균주에 관한 것이다. 본 발명은 유전자 변이주를 만드는 방법과 식물의 뿌리 질병을 제어하기 위한 이들의 응용도 포함한다.
도 1은 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Q8r1-96, ML4.9-96, 및 L5.1-96의 띠모양(RAPD)을 보여주는 영상이다. 1번 레인은 기준선으로서 1-kb 래더를 나타낸다.
도 2 내지 4는 퀸시 버진 토양, 린드 버진 토양 및 모세 레이크 버진 토양에 각각 존재하는 (발명에 따르지 않는) P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 M1-96 및 Q2-87과 비교한 본 발명에 따른 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Q8r1-96의 군집력을 나타낸다.
도 5는 퀸시 버진 토양, 린드 버진 토양 및 모세 레이크 버진 토양에 존재하는 본 발명에 따른 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Q8r1-96의 군집력을 나타낸다.
도 6은 tac 프로모터에 연결된 페나진 생합성 유전자 wfl의 물리적 지도를 보여준다. 도면에서, 화살표는 페나진 생합성 효소를 암호화하는 유전자와 그 전사 방향을 나타낸다. 부호 Ptac는 tac 프로모터의 위치와 방위를 나타낸다.
도 7은 pUTKm::phz 플라스미드의 물리적 지도를 보여준다. 사선은 페나진 생합성 유전자를 나타낸다. 카나마이신 저항력을 제공하는 유전자의 전사 위치와 방향은 열린 상자로 나타내었다. ″X″로 표시된 작은 상자는 Tn5 19-bp 말단의 위치를 나타낸다.
본 발명은 소형 곡류작물과 잔디에서 토양 전파성 균류 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)(Gg)에 의해 유발되는 질병을 조절하기 위한 생조절제를 분리하는 것이다. 또한, 본 발명은 맥류마름병과 같이 Gg에 의해 유발되는 질병을 소량으로 억제하고(발병을 억제하거나, 발병과 정도를 감소시키는), 종래의 Gg 생조절제보다 뿌리 군집력이 우수한 형광성 슈도모나스 종균을 포함한다. 그리고, 이 종균의 뿌리 군집력과 생조절 활성은 토양의 종류의 영향을 받지 않는다.
본 발명에 따른 생조절제는 맥류마름병과 같이 Gg에 의해 유발된 질병을 억제하는 종래의 모든 생조절제보다 훨씬 강력한 생조절 능력을 갖는다. 또한, 본 발명의 균주는 TAD 토양에서 발견되는 생조절 수준을 재현할 수 있는 특성을 갖고 있다.
본 발명의 일 면에 따르면, 본 발명의 생조절제는 2,4-디아세틸플로로글루시놀의 생성을 암호화하는 생조절 유전자 자리를 갖는 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종균의 생물학적 순수 배양균을 포함한다. 이 균주는 특징적인 RAPD 띠모양으로 나타나는 고유의 유전자형을 가지고, 종래에 비하여 맥류마름병 억제 능력이 10 배 내지 1000 배 높은 생조절 활성을 가진다. 그리고, 종래의 Gg-억제 균주에 비하여 10배 내지 1000 배의 높은 개체 밀도와 뛰어난 군집력으로 특징지을 수 있는 뿌리 군집력을 나타낸다. 또한, 적어도 7 회 연속 생장 주기 동안에 해당 근권 토양을 포함하여 뿌리의 단위 그램 당 콜로니 형성 단위로 적어도 약 105CFU/그램에 해당하는 평균 개체 밀도를 갖는다. 이와 같은 뿌리 군집력은 전례에 없는 일이다. 본 발명의 균주는 토양의 종류에 영향을 받지 않는다.
발명은 또한 이들 고유한 균주를 분리하고 확인하는 방법을 포함한다. 박테리아를 스크리닝하는 방식은 도 6에 나타내었으며, 스크리닝 방법은 하기에 자세히 설명하기로 한다.
발명은 다른 측면은 상기 균주의 이용과, 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)에 의해 유발되는 식물 질병을 생조절하기 위한 균주로 이루어진 조성물을 포함한다. 종자, 토양, 경작지 처리제 또는 처리 용액으로 사용하면, 발명의 균주는 Gg를 억제하는 능력을 나타낸다. 종자나 토양에 발명의 균주를 이용함으로써 종래와는 달리 자연적인 맥류마름병 감퇴(표 1 참조)와 같은 맥류마름병 억제 활성을 얻을 수 있다. 또한, 발명의 균주는 적은 양으로도 맥류마름병을 억제할 수 있으므로, 균류를 기존의 생조절제보다 거의 10 배 내지 1000 배나 낮은 비용으로 배양하여 이용할 수 있다. 또한, 발명의 균주는 자연적인 TAD 효과를 내기 때문에, 경작지에 한 번만 사용하기만 하면 된다. 이에 반하여, 맥류마름병의 다른 생조절제는 모두 반복 사용해야 하는 문제가 있다.
본 발명의 목적은 종래의 생조절 균주보다 Gg에 의해 유발된 질병을 효과적으로 생조절할 수 있는 형광성 슈도모나스 종균을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 종래의 맥류마름병 생조절제보다 뿌리 군집력이 우수한(높은 뿌리 개체 밀도 및 확장성) 생조절 균주를 제공하는 것이다. 맥류마름병과 같은 뿌리 질병을 억제함으로써 뿌리 군집력을 향상시켜서 생조절 활성이 증대되므로, 이 특성은 특히 가변적이다.
본 발명의 또 다른 목적은 토양의 종류에 영향을 받지 않는, 소형 곡물과 잔디에서 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)에 의해 유발되는 식물 질병을 생조절하기 위한 생조절제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 특징적인 띠모양을 나타내는 균주를 선택하기 위하여 RAPD 분석을 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 균주와 이와 결합된 농업 조성물을 이용하여 소형 곡류작물과 잔디의 맥류마름병을 생물학적으로 조절하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적과 이점은 다음 설명을 통하여 보다 분명하게 이해될 것이다.
발명의 다른 실시예에서, 생조절제는 다음과 같은 특성을 갖는 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종의 생물학적으로 순수한 균주를 적어도 한 가지 포함한다: 균주는 게놈에 안정하게 도입되는 항생 페나진-1-카르복시산의 생성을 암호화하는 생합성 유전자 자리를 갖고; 2,4-디아세틸플로로글루시놀의 생성을 암호화하는 균주의 생합성 유전자 자리를 보유하고; 그리고 토양 전파성 병원균인 라이족토니아(Rhizoctonia)가 유발하는 질병을 억제한다. 선택적으로, 이 균주는 라이족토니아(Rhizoctonia)가 유발하는 질병 뿐만 아니라, 피티움(Pythium)이 유발하는 질병이나 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)(Gg)가 유발하는 질병도 억제하고, 또는 이들 세 가지 뿌리병에 대하여 생조절 활성(질병 억제 능력)을 갖는다.
제 2 실시예에 따른 생조절제는 제 1 실시예 균주인 형광성 슈도모나스 종균의 게놈에 페나진-1-카르복시산의 생합성 유전자 자리를 안정하게 삽입하여 얻을 수 있다. 상기 제 1 실시예 균주는 항생성 2,4-다아세틸플로로글루시놀의 생성을 암호화하고 특징적인 RAPD 프로파일로 나타나는 유전자형을 가지며, 하기에 논의하는 바와 같이 우수한 뿌리 군집력을 나타낸다.
라이족토니아에 의해 유발되는 질병을 억제하기 위한 활성을 갖는 균주들을 선택하기 위하여 수행되는 형질전환주의 스크리닝은 온실 생물 검정으로 실시한다. 선택적으로, 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)나 피티움에 의해 유발되는 질병을 억제하는 활성을 갖는 균주를 선택하기 위한 형질전환주의 스크리닝도 온실 검정을 수행할 수 있다.
온실 스크리닝 생물 검정을 수행하기 전단계로서, 형질전환주를 이용하여 라이족토니아 분리주를 생체내 억제할 수 있다.
따라서, 제 2 실시예의 생조절제는 라이족토니아에 의해 유발된 질병과, 선택적으로 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)나 피티움에 의해 유발되는 질병을 억제하는 생조절 능력을 제공한다. 그리고, 본 발명의 형질전환주는 적은 양으로도(종자당 102콜로니 형성 단위(CFU)) 라이족토니아 뿌리 부패병을 억제하는 능력이 있다. 또한, 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)나 피티움에 의해 유발되는 질병을 억제하는 제 1 실시예 균주의 능력도 보유한다. 따라서, 본 발명의 균주는 세 가지 중요한 식물 뿌리 질병을 억제할 수 있다.
발명은 또 다른 측면은, 상기 세 가지 중요한 식물 뿌리 질병을 모두 생조절하기 위한 균주와 이 균주로 이루어진 조성물의 이용을 포함한다. 종자, 토양, 경작지 처리제 또는 처리 용액으로 사용하면, 발명의 균주는 Gg뿐만 아니라, 나머지 두 가지 균주를 억제하는 능력을 나타낸다.
또한, 본 발명의 생조절제는 적어도 한 가지의 발명에 따른 유전자 변이주로 이루어지고, 한 가지 이상의 생조절 균주(예를 들면, 본 발명의 부가적인 유전자 변이주)와; 제 1 실시예의 균주나 다른 생조절 균주를 포함하는 생조절 혼합물을 제조하는 데에 사용할 수 있다. 본 발명은 적어도 한 가지 생조절 균주를 포함하고, 적어도 한 가지 식물 뿌리 질병을 억제하는 데에 유용한 농업 조성물을 제공한다.
본 발명의 생조절제
본 발명에 따른 생조절제는 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종의 생물학적으로 순수한 균주를 적어도 한 가지 포함한다. 본 발명의 제 1 실시예에서, 이 균주는 다음과 같은 특성을 갖는다: 균주는 2,4-디아세틸플로로글루시놀의 생성을 암호화하는 생합성 유전자 자리를 포함하고; 도 1에서 보이는 바와 같이 특징적인 띠모양으로 나타나는 고유의 유전자형을 가지고; 밭에서 자라는 소형 곡류작물나 잔디에서 Gg에 의해 유발되는 질병을 억제하고; 그리고 종래의 Gg-억제 균주에 비하여 높은 개체 밀도와 뛰어난 군집력으로 특징지을 수 있는 뿌리 군집력을 나타낸다.
바람직하게는, 균주는 다음과 같은 부가적인 특성을 갖는다: 생조절 활성(질병 억제 능력)과 뿌리 군집력이 토양의 종류에 의해 영향받지 않고, 그리고/또는 소형 곡류작물이 맥류마름병 감퇴의 상태에 놓인 토양에서 자랐을 때에 나타나는 생조절 수준과 같은 정도로 소형 곡류작물의 Gg를 억제한다. 즉, 맥류마름병 감퇴 토양에서 관찰되는 생조절 수준을 재현한다.
본 발명의 제 1 실시예에 따른 균주의 예로는 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Q8r1-96; ML4.9-96; 및 L5.1-96이 있다.
본 발명의 제 2 실시예에서, 생조절제는 다음과 같은 특성을 갖는 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종의 생물학적으로 순수한 균주를 적어도 한 가지 포함한다: 균주는 게놈에 안정하게 도입되는 항생 페나진-1-카르복시산의 생성을 암호화하는 생합성 유전자 자리를 갖고; 2,4-디아세틸플로로글루시놀의 생성을 암호화하는 균주의 생합성 유전자 자리를 보유하고; 그리고 토양 전파성 병원균인 라이족토니아(Rhizoctonia)가 유발하는 질병을 억제한다. 선택적으로, 이 균주는 라이족토니아(Rhizoctonia)가 유발하는 질병 뿐만 아니라, 피티움(Pythium)이 유발하는 질병이나 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)(Gg)가 유발하는 질병도 억제하고, 또는 이들 세 가지 뿌리병에 대하여 생조절 활성(질병 억제 능력)을 갖는다.
본 발명의 제 2 실시예에 따른 균주의 예로는 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Z30-97; Z32-97; Z33-97; 및 Z34-97이 있다.
특징적인 띠모양
본 발명의 제 1 실시예에 따른 생물학적으로 순수한 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 균주는 특징적인 유전자 띠모양을 갖는다. 이 특성은 하기 실시예 1에서 설명하는 바와 같이 프라이머 M13을 가지고 RAPD 분석을 수행하여 확인할 수 있다. 도 1은 본 발명에 따른 균주인 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Q8r1-96, ML4.9-96, 및 L5.1-96의 띠모양(RAPD)을 보여주고 있다. 1번 레인은 기준선으로서 1-kb 래더를 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 균주에 공통적인 밴드는 330 ±20 bp; 600 ±50 bp; 700 ±50 bp; 800 ±50 bp; 900 ±50 bp; 및 1100 ±60 bp이다. 800 ±50 bp에서 밴드의 세기가 가장 크다.
제 1 실시예에 있어서, 실시예 1에서 설명한 조건에서 600 ±50 bp; 700 ±50 bp; 800 ±50 bp; 900 ±50 bp에서 밴드가 나타나면 균주는 본 발명에 따른 특징적인 띠모양을 갖는다고 할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 균주는 또한 330 ±20 bp와 1100 ±60 bp에서도 밴드가 나타난다.
균주가 제 1 실시예에 따른 특징적인 띠모양을 갖고 있는지를 확인하기 위한 다른 방법은 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Q8r1-96과 시험 균주를 이용하여 실제적으로 약 600 ±50 염기쌍과 900 ±50 염기쌍 사이의 밴드를 비교하는 것이다. 즉, 한천 젤에서 단계별 비교를 수행한다. 이 영역에서 시험 균주의 프로파일이 균주 Q8r1-96의 프로파일과 일치하면, 시험 균주는 본 발명에 의한 특징적인 띠모양을 갖는 것으로 해석한다.
형질전환 균주가 제 1 실시예에 따른 특징적인 띠모양을 갖고 있는지를 확인하기 위한 다른 방법은 제 1 실시예의 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Q8r1-96 균주, 실제 제 1 실시예에 따른 균주, 또는 Z34-97과 같은 본 발명에 따른 시험 균주를 이용하여 실제적으로 약 600 ±50 염기쌍과 900 ±50 염기쌍 사이의 밴드를 비교하는 것이다. 즉, 한천 젤에서 단계별 비교를 수행한다. 이 영역에서 시험 균주의 프로파일이 제 1 실시예의 균주 Q8r1-96이나, 실제 모균주나 본 발명에 따른 균주의 프로파일과 일치하면, 시험 균주는 본 발명에 의한 특징적인 띠모양을 갖는 것으로 해석한다.
본 발명의 제 2 실시예에서, 형질전환 균주는 다음과 같은 부가적인 특성을 갖는 것이 바람직하다: 균주는 2,4-디아세틸플로로글루시놀의 생성을 암호화하는 모균주 또는 제 1 실시예의 균주가 갖는 띠모양의 특징적인 밴드를 적어도 4 개 이상 보유한다. 제 2 실시예에 의한 형질전환 균주는 모균주나 제 1 실시예의 균주와 특징적인 띠모양이 공통적이다. 이 프로파일은 하기 실시예 5와 실시예 11에서 설명하는 바와 같이 프라이머 M13을 가지고 랜덤 증폭 다형성 DNA 분석(RAPD 분석)을 수행하여 확인할 수 있다. 도 1은 본 발명의 제 1 실시예에 따른 균주인 P. 플루오레센스(P. fluorescens) Q8r1-96, ML4.9-96, 및 L5.1-96의 띠모양(RAPD)을 보여주고 있다. 1번 레인은 기준선으로서 1-kb 래더를 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 균주에 공통적인 밴드는 330 ±20 bp; 600 ±50 bp; 700 ±50 bp; 800 ±50 bp; 900 ±50 bp; 및 1100 ±60 bp이다. 800 ±50 bp에서 밴드의 세기가 가장 크다.
형질전환 균주 Z32-97; Z33-97; 및 Z34-97은 모균주인 P. 플루오레센스(P. fluorescens) Q8r1-96과 330 ±20 bp; 600 ±50 bp; 700 ±50 bp; 800 ±50 bp; 900 ±50 bp; 및 1100 ±60 bp에서 공통적인 밴드를 갖는다. 형질전환 균주 Z30-97은 모균주 Q8r1-96과 600 ±50 bp; 700 ±50 bp; 800 ±50 bp; 및 900 ±50 bp에서 공통적인 밴드를 갖는다.
본 발명에 있어서, 실시예 5와 실시예 11에서 설명한 조건에서 600 ±50 bp; 700 ±50 bp; 800 ±50 bp; 900 ±50 bp에서 밴드가 나타나면 형질전환 균주가 본 모균주의 특징적인 띠모양을 갖는다고 할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 균주는 또한 330 ±20 bp와 1100 ±60 bp에서도 밴드가 나타난다.
생조절 활성
본 발명의 제 1 실시예에 따른 생물학적으로 순수한 형광 슈도모나스(Pseudomonas) 균주는 소형 곡류작물나 잔디에서 맥류마름병과 같이 Gg에 의해 유발되는 질병을 억제하는(발병을 억제하거나, 질병의 발생이나 악화를 감소시키는) 능력을 갖는다. 하기 실시예에서 표 1, 2 및 4는 생조절 활성을 나타내는 데이터이다. 실시예 3의 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, 균주 Q8r1-96은 밭에서 발생하는 맥류마름병에 감염된 밀의 비율을 20%로 감소시켰다. 하기 실시예 4의 표 4에서 나타낸 바와 같이, 균주 Q8r1-96은 9 번의 밀 수확 후에 맥류마름병 감소율이 P. 플루오레센스(P. fluorescens) Q2-87(종래의 억제성 Ph1 생성 균주)의 거의 두 배로 나타났다. 하기에 논의하는 바와 같이, Q8r1-96은 TAD 토양의 생조절성을 재현하였다.
본 발명에 따른 생물학적으로 순수한 형광 슈도모나스(Pseudomonas) 균주는 게놈에 안정하게 도입되는 항생 페나진-1-카르복시산의 생성을 암호화하는 생합성 유전자 자리를 갖고, 전파성 병원균이 라이족토니아(Rhizoctonia)가 유발하는 질병을 억제하는(발병을 억제하거나, 질병의 발생이나 악화를 감소시키는) 능력을 갖는다. 선택적으로, 이 균주는 라이족토니아(Rhizoctonia)가 유발하는 질병 뿐만 아니라, 피티움(Pythium)이 유발하는 질병이나 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)(Gg)가 유발하는 질병도 억제하고, 또는 이들 세 가지 뿌리병에 대하여 생조절 활성(질병 억제 능력)을 갖는다.
하기의 도 6, 7 및 8은 생조절 활성을 보여주는 데이터이다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 종자당 102내지 103CFU의 형질전환 균주 Z30-97, Z32-97 및 Z34-97은 동일한 양의 모균주 Q8r1-96, P. 플루오레센스(P. fluorescens) 2-79(페나진-1-카르복시산 유전자의 자원), 및 두 개의 비처리 대조군에 비하여 라이족토니아(Rhizoctonia) AG8에 감염된 밀뿌리의 비율을 감소시켰다. 모균주 Q8r1-96은 더 많은 양을 사용했을 때에만 라이족토니아(Rhizoctonia) 억제 능력이 Z30-97 및 Z32-97과 같다. 하기 실시예 8의 표 7을 보면, 종자당 102CFU의 균주 Z34-97은 피티움(Pythium) 억제 능력이 종자당 103CFU의 모균주 Q8r1-97과 같다. 하기 실시예 8의 표 8에 나타낸 바와 같이, 균주 Z34-97은 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시(Gaeumannomyces graminis var. tritici)(Ggt)를 크게 억제한다. 하기 실시예 8의 표 4 내지 8에서 알 수 있는 바와 같이, Z34-97은 세 가지 뿌리 질병을 모두 억제할 수 있다.
균주의 군집력
제 1 실시에 따른 생물학적으로 순수한 형광 슈도모나스(Pseudomonas) 균주는 종래의 억제성 균주에 비하여 (a) 뿌리상 개체 밀도가 높고 (b) 군집력이 크다는 두 가지 특징을 갖는 특유의 군집력을 갖는다. 즉, 본 발명에 따른 균주는 소형 곡물의 뿌리에 군집하여 살아나는 능력이 있다. 하기 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 균주는 적어도 7 회 연속 생장 주기 동안에 해당 근권 토양을 포함하여 뿌리의 단위 그램 당 콜로니 형성 단위로 적어도 약 105CFU/그램에 해당하는 평균 개체 밀도를 갖는다. 도 2는 퀸시 버진 토양에서 재배한 밀의 9 회 생장 주기 동안에 Q8r1-96에 의한 밀(cv Penawawa) 뿌리의 배양 상태를 보여준다. 주기 5에 이를 때까지, Q8r1-96의 개체 밀도는 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Q2-87 및 M1-96(본 발명과 관계없는 균주들)보다 거의 1000 배 높았다. 도 3 및 도 4에서 Q8r1-96도 린드 버진 토양과 모세 레이크 버진 토양에서의 개체 밀도가 훨씬 높았다.
본 발명에 있어서, 제 1 실시예에 따른 균주는 하기 실시예 4의 생장 조건하에 적어도 9 회 연속 생장 주기 동안에 해당 근권 토양을 포함하여 뿌리의 그램수 당 개체 밀도가 적어도 약 105CFU일 때 특징적인 군집력을 갖는다고 할 수 있다.
제 2 실시예에 따른 생물학적으로 순수한 유전자변이주는 식물 종자와 뿌리에 배양되는 능력을 갖는다. 하기 실시예 9의 표 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 균주는 처리 종자를 파종한 후 66 시간 내지 일 주일이 되었을 때 모균주와 같은 개체 밀도에 도달하였다.
토양의 종류에 무관함
바람직한 실시예에서, 발명에 따른 생조절 균주는 그 생조절 활성과 뿌리 배양 효과가 토양의 종류에 영향을 받지 않는다는 또 다른 특징을 갖는다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 7 회의 생장 주기 동안에 Q8r1-96의 개체 밀도는 토양의 종류에 의해 영향을 받지 않았다.
TAD 토양의 생조절 현상의 재현
바람직하게, 발명에 따른 생조절 균주는 소형 곡류작물에서 Gg에 의해 유발되는 질병을 억제하는 능력이 소형 곡류작물이 맥류마름병 감퇴(TAD) 상태의 토양에서 자랐을 때에 나타나는 생조절 수준과 같은 특징이 있다. 즉, 이 균주는 맥류마름병 감퇴 토양에서 얻을 수 있는 수준의 생조절 현상을 재현할 수 있다. 하기 실시예 1의 표 1에 나타낸 바와 같이, 104콜로니 형성 단위(CFU)/종자의 양만큼 Q8r1-96을 접종하여 퀸시 버진(전파성) 토양에 파종하였을 때 퀸시 TAD 토양과 같이 맥류마름병을 억제하는 데에 효과가 있었다. 또한, Qr81-96은 린드 버진 토양에 10 %(w/w)으로 접종하였을 때 퀸시 TAD 토양과 같이 린드 버진(전파성) 토양에 효과적이었다. 이와 같이 자연적인 맥류마름병 감퇴와 같은 수준으로 맥류마름병을 억제할 수 있는 것은 전례에 없는 일이다.
식물 뿌리 질병의 생조절을 위한 억제성 유전자 변이주의 이용
발명의 제 2 실시예에 따른 유전자 변이 미생물 균주는 식물 뿌리 질병, 특히 토양 전파성 병원균인 라이족토니아(Rhizoctonia)에 의한 질병과, 선택적으로 피티움(Pythium)과 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)에 의한 질병을 통제하는 데에 유용하다. 발명에 따른 생조절제는 소형 곡물과 잔디의 뿌리 질병을 조절하는 데에 이용된다. 소형 곡류작물의 예로는 밀, 보리, 호밀 및 라이밀이 있다. 또한, 균주들을 라이족토니아(Rhizoctonia)나, 피티움(Pythium), 또는 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)와 같은 토양 전파성 병원균에 의해 유발되는 뿌리 질병에 걸리기 쉬운 식용 식물, 섬유성 식물 또는 관상 식물의 뿌리 질병을 조절하는 데에 이용할 수 있다. 이와 관련한 식물로는 아스파라거스, 카놀라, 옥수수, 사탕무, 토마토, 감자, 완두, 벼, 콩과식물, 콩, 딸기, 주키니 및 면화가 있다.
특정 식물의 식물 뿌리 질병(들)을 생조절하기 위해서는, 발명에 따른 한 가지 이상의 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 균주를 유효 억제량만큼 주입하여 식물을 재배한다. 유효 억제량은 비처리 대조군에서 발생하는 것에 비하여 소정의 뿌리 질병(들)을 억제하는(발병을 억제하거나, 질병의 발생이나 악화를 감소시키는) 생조절제의 수준으로 정의한다. 이는, 물, 비료, 토양 및 기온과 같은 요인들이 목적 작물의 생장에 제한을 주지 않는 것을 가정한다. 경우마다 유효량은 종래의 시행 방식과 마찬가지로 용이하게 결정할 수 있다.
생조절은 유효량의 생조절제를 식물이나 식물의 종자, 또는 식물이나 종자의 유전자 자리에 첨가함으로써 이루어진다. 예를 들면, 균주를 종자, 토양 또는 밭고랑에 처리하거나 잔디나 토양에 적시는 형태로 가할 수 있다.
균주는 뿌리 질병을 통제하고자 하는 식물에 접종하기에 적당한 조성물에 결합시켜 사용할 수 있다. 그러므로, 균주를 농학상으로 허용되는 매개체나, 균주의 활성을 방해하지 않을 농경학상으로 허용되는 매개체와 섞어서 사용할 수 있다. 이와 같은 매개체로는 물, 완충액, 메틸셀룰로오스, 이탄, 또는 질석이 있다. 균주를 액상 매개체의 현탁액이나 에멀젼으로 사용하는 경우, 현탁액이나 에멀젼은 종래와 같이 계면활성제나 습윤제와 같은 종래의 첨가제를 선택적으로 함유할 수 있다. 발명에 따른 균주는 본 발명의 제 2 실시예에 따른 다른 균주와, 제 1 실시예의 균주 또는 종래의 균주를 비롯하여 다른 생조절 균주를 포함하도록 제조할 수도 있다.
다음은 균주의 사용 방법과 그 유효량을 설명하기로 한다. 특정한 경우 유효 범위에 해당하는 사용량은 실험을 통하여 결정할 수 있다.
소형 곡류작물나 잔디, 또는 그밖에 식용 식물, 섬유성 식물 또는 관상 식물을 종자 처리하기 위하여, 약 0.5 내지 2.0%의 메틸셀룰로오스를 함유하는 현탁액에 박테리아를 첨가한다. 현탁액을 종자에 가하여 섞어서 종자 당 약 102내지 105CFU로 종자를 피복하도록 한다. 일반적으로, 바람직한 양은 종자 당 약 102내지 104CFU이다.
토양을 처리하기 위하여, 박테리아를 물이나 완충액에 부유시켜 토양 그램당 약 102내지 105CFU가 되도록 토양에 가한다. 잔디의 경우, 박테리아를 물이나 완충액에 부유시키고 ㎖ 당 약 102내지 105CFU를 포함하는 용액으로 잔디에 가한다.
뿌리를 직접 처리하기 위하여, 뿌리를 현탁액 ㎖당 약 102내지 105CFU 밀도의 박테리아 현탁액에 담근다.
매개체가 이탄이나 질석과 같은 고체인 경우, 매개체 그램당 약 106내지 109CFU가 되도록 한다. 매개체가 액체이면, 매개체 ㎖당 약 108내지 1010CFU가 되게 한다. 동결 건조 제형인 경우, 제형 그램당 약 1010내지 1011CFU가 되게 한다. 동결 건조된 제형에 종래에 공지된 첨가물을 포함시킬 수 있다.
스크리닝 방법
또한, 발명의 제 1 실시예는 발명에 따른 특유의 형광성 슈도모나스(Pseudomonas)를 선택하기 위한 방법도 포함한다. 이 방법을 이용하면, 앞서 설명한 특성을 갖는 미생물 균주를 얻을 수 있다. 간단히 말하자면, 이 발명은 (1) 맥류마름병 억제성 토양(즉, 맥류마름병 감퇴 상태에 있는 토양)에서 연속 성장 주기 동안 소형 곡류작물 또는 잔디를 재배하여 2,4-디아세틸플로로글루시놀(또는, Ph1 생성 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종이라고도 함)의 생성을 암호화하는 생합성 유전자 자리를 갖는 형광성 슈도모나스(Pseudomonas)를 증식시키는 단계; (2) 억제 잠재성 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 박테리아 균주를 분리하는 단계; (3) 2,4-디아세틸플로로글루시놀 특이성 DNA 프로브와 콜로니 혼성화하여 Ph1 생성 균주를 검출함으로써 분리한 균주를 스크리닝하여 2,4-디아세틸플로로글루시놀의 생성을 암호화하는 합성 유전자 자리를 갖는 균주를 선택하는 단계; 및 (4) RAPD 분석을 이용하여 상기에 설명한 특징적인 띠모양을 갖는 균주를 선택하는 단계를 포함한다. 단계 3 이후에 Ph1 생성을 확정하는 부가 단계를 삽입할 수도 있다.
다음은, 발명에 따른 선택 방법을 보다 상세히 설명하고자 한다.
단계 1: Ph1 생산 유전자를 증가시키기 위한 연속 성장 주기.
이 단계에서는, 다음과 같은 절차에 따라 천연의 맥류마름병 억제성 토양에서 소형 곡류작물 또는 잔디를 연속 성장 주기 동안에 재배하여 Ph1 생성 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 증식시킨다: (a) 모종을 얻기 위하여 소형 곡류작물 또는 잔디의 생장에 효과적인 조건하에 적어도 3 주 동안 온실에서 맥류마름병 감퇴 상태에 있는 토양(TAD 토양)에 소형 곡류작물이나 잔디의 종자를 발아시키는 단계; (b) 상기 토양에서 자란 소형 곡류작물이나 잔디의 묘목에서 흙과 뿌리를 채취하여 섞는 단계; 및 (c) 적어도 4 번의 연속 주기 동안에 단계 (a)와 (b)를 반복하는 단계. 여기서, 단계 (b)의 혼합물을 사용하여 연속 주기 동안에 종자를 발아시킨다.
단계 2: TAD 토양에서 생장 주기를 마친 뿌리로부터 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종의 분리.
이 단계에서는, 슈도모나스의 생장에 효과적인 조건에서 소정의 시간 동안 슈도모나스 선택적 배지 위에 균주를 배양시키고 배지에서 자라는 균주를 선택함으로써 단계 (1)에서 연속으로 배양된 소형 곡류작물 또는 잔디의 뿌리와 근권 토양으로부터 억압 잠재성 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 박테리아의 균주를 분리시킨다.
단계 3: Ph1 생산 유전자를 검출하기 위한 특정 프로브와의 콜로니 혼성화.
이 단계에서는, 단계 2에서 분리한 균주를 스크리닝하여 2,4-디아세틸플로로글루시놀(Ph1) 특이성 DNA 프로브로 균주의 콜로니를 혼성화하고 프로브에 혼성화되는 균주를 선택하여 Ph1 생성을 암호화하는 합성 유전자 자리를 갖는 균주를 선택한다. 선택된 각 콜로니를 채취하여 스트리킹하고 안정하고 순수한 균주가 될 때까지, 즉 생물학적으로 순수한 배양균이 될 때까지 다시 스트리킹한다. 균주를 안정한 상태로 유지하기 위하여 -80 ℃에서 글리세롤에 보관할 수 있다.
단계 3a (선택적): PCR에 의한 Ph1 생성 균주 확정.
이 선택적인 단계에서는, Ph1 생합성 유전자 자리 내의 시퀀스를 증폭시키는 프라이머를 이용하여 Ph1 생성 균주를 확정하고, 양성 PCR 반응을 나타내는 균주를 선택한다.
단계 4: 선명한 띠모양을 갖는 Ph1 생성 균주를 확인하기 위한 RAPD 분석.
이 단계에서는, 프라이머 M13(시퀀스: GGTGGTCAAG)을 이용하여 랜덤 증폭 다형성 DNA 분석을 수행한다(참조: Keet 등., supra). 프라이머 M13은 캘리포니아주 아라메다시의 오페론 테크놀러지사에서 시판하고 있다. 600 ±50 bp; 700 ±50 bp; 800 ±50 bp; 900 ±50 bp에서 밴드가 나타나는 균주들을 선택한다. 330 ±20 bp와 1100 ±60 bp에서 밴드가 나타나는 균주들도 바람직하다.
이 방법을 이용하면, 발명의 제 1 실시예에 따른 균주인 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Q8r1-96, L5.1-96 및 ML4.9-96의 생물학적으로 순수한 배양균을 얻을 수 있다.
유전자 변이주의 제조
제 2 실시예에 따른 균주는 재조합 DNA 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 이 때, 페나진-1-카르복시산의 생합성 유전자 자리를 하기에 상세히 설명되는 특성들을 갖는 형광성 슈도모나스(Pseudomonas)의 모균주의 게놈에 도입한다. 형광성 슈도모나스(Pseudomonas)와 같은 박테리아 균주로부터 얻은 페나진-1-카르복시산의 생합성 유전자 자리는 tac와 같은 프로모터 다음에 페나진 생합성 유전자를 삽입하여 변형시킨다. 이 구조물을 SfiI나 NotI와 같은 클로닝 자리를 갖는 미니-Tn5를 포함하고 페나진 생합성 유전자를 형광성 슈도모나스(Pseudomonas)에 안정하게 삽입시킬 수 있는 pUT와 같은 플라스미드에 복제한다. 페나진 생합성 유전자 자리와 프로모터를 가진 플라스미드를 대장균(Escherichia coli) S17-1(λpir)과 같은 균주에 도입한다. E. coli 균주를 슈도모나스(Pseudomonas) 균주와 짝지음(박테리아 접합)으로써 페나진 생합성 유전자를 슈도모나스(Pseudomonas) 균주에 삽입한다. 접합 후, 배양균을 완충액에 부유시켜 KMB 플러스 카나마이신 위에 심는다. 형광성이고 카나마이신에 저항성을 갖는 균주들은 형질전환된(유전자 변이) 균주로 추정된다.
하기 실시예 5에서 설명한 바와 같이, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) 균주 2-79(NRRL B-15132)로부터 페나진 생합성 유전자를 이용하여 페나진-1-카르복시산을 생합성하기 위한 유전자 자리의 전치 형태를 구성하였다. 페나진 생합성 (phz) 유전자 자리는 8,505-bp Bg1II-XbaI DNA 단편 내의 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 2-79에 배치되고, phzABCDEFG, phzI 및 phzR로 명시되는 9 개의 유전자로 이루어진다. P. 플루오레센스(P. fluorescens) 2-79로부터 얻은 phz 유전자 자리의 완전한 시퀀스는 취득 번호 L48616으로 유전자은행 컴퓨터 데이터베이스에 등록되어 있다.
phzABCDEFG 유전자는 단일 오페론 내에 조직되어 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 2-79에서 페나진-1-카르복시산(PCA) 생성을 담당한다. phzC, phzD 및 phzE 유전자 생성물은 시키미산과 초리스민산의 대사에 관여하는 효소들과 유사하며, 이들은 phzF와 함께 PCA 생성에 절대적으로 필요하다. phzG는 피리독사민-5'-인산 산화효소와 유사하고 PCA 합성 효소(들)의 조효소의 근원으로 추정된다. phzA와 phzB 유전자 생성물은 서로 동형이며 PCA 합성 다효소 복합체의 안정화에 관여한다. phzABCDEFG 유전자는 균주 2-79의 페나진 생합성 유전자 자리로부터 얻은 6.8-kb Bg1II-XbaI 단편 내에 배치된다. 이 DNA 단편을 tac 프로모터로 조절한 후, 하기에 설명하는 바와 같이 전달 플라스미드에서 복제하였다. 그 결과로 얻은 플라스미드는 원래 페나진 화합물을 생성하기에 불안정한 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종에서 안정한 염색체 삽입물을 발생하는 데에 이용하였다.
유전자 공학적으로 박테리아 균주를 구성하기 위하여, Tn5의 전이인자 특성과 플라스미드 pUT의 전달 특성에 기초한 시스템을 이용하였다(V. de Lorenze, M. Herrero, U. Jakubzik and K.N. Timmis, Journal of Bacteriology 172:6568-6572 (1990)). pUT는 플라스미드 R6K 복제의 π단백질 의존성 근원이고, 특수하게 조작된 대장균 S17-1(λpir)인 π 단백질 생성 박테리아에만 있다. pUT는 또한 플라스미드 RP4의 전달 oriT의 근원을 운반하여, 결국에는 RP4 접합 기능을 발현하는 대장균 균주로부터 슈도모나스(Pseudomonas)로 효과적으로 전달된다. 마지막으로, pUT는 미니-Tn5원소의 전치에 필요한 전위효소를 암호화하는 IS50R의 tnp 유전자를 운반한다. 상기와 같은 전달 시스템을 이용하여, 페나진 생합성 유전자는 목적 슈도모나스(Pseudomonas) 균사의 염색체 내부로 삽입되어 낮은 자연 복제 회수를 유지하고 적어도 이론적으로는 다른 염색체 유전자와 같이 안정하게 유지된다.
접합이 끝나면, 배양균을 완충액에 부유시키고 KMB 플러스 카나마이신 위에 놓는다. 형광성이고 카나마이신에 대한 저항력이 있는 균주들은 형질전환 균주로 간주된다. 선택된 각 콜로니를 채취하여 스트리킹하고 안정하고 순수한 균주가 될 때까지, 즉 생물학적으로 순수한 배양균이 될 때까지 다시 스트리킹한다. 균주를 안정한 상태로 유지하기 위하여 -80 ℃에서 글리세롤에 보관할 수 있다.
온실 내의 스크리닝
밀의 라이족토니아(Rhizoctonia) 뿌리 부패병과 같이 라이족토니아(Rhizoctonia)에 의해 유발되는 질병을 억제하는 활성을 갖는 균주들을 선택하기 위한 형질전환 균주의 스크리닝 작업이 온실 생물 검정에서 수행된다. 토양에 라이족토니아(Rhizoctonia) 접종물을 주입하여 하기 실시예 8에서 설명한 바와 같이 플라스틱관에 둔다. 밀과 같이 질병에 걸리기 쉬운 종자를 형질전환 균주로 처리하여 토양에 뿌린다. 선택적으로, 게우만노마이세스 그라미니스(Gg)나 피티움(Pythium)에 의해 유발되는 질병에 효과적인 형질전환 균주를 선택하기 위하여, 접종물로서 게우만노마이세스 그라미니스(Gg)나 피티움(Pythium)을 각각 이용하여 온실 생물 검정을 수행한다.
선택적인 시험관내 스크리닝
온실 스크리닝 이전의 선택적인 단계가 형질전환 균주에 의한 라이족토니아(Rhizoctonia) 분리주의 시험관내 억제이다. 한천 플레이트 상에 병원체를 갖는 형질전환 균주를 접합시키고 억제 영역의 크기를 측정한다. 하기 실시예 6에 설명되어 있는 같이, 생물학적으로 순수한 유전자 변이주는 모균주인 P. 플루오레센스(P. fluorescens) Q8r1-96보다 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시(Gaeumannomyces graminis var. tritici), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG8 및 피티움 이레귤라레(Pythium irregulare)의 실험관내 억제 효과가 더 크다. 하기 실시예 6의 표 5에 나타낸 바와 같이, 유전자 변이주의 억제 영역은 Q8r1-96의 억제 영역보다 훨씬 크다. 선택적으로, 이 균주는 라이족토니아(Rhizoctonia)가 유발하는 질병 뿐만 아니라, 피티움(Pythium)이 유발하는 질병이나 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)(Gg)가 유발하는 질병도 억제하고, 또는 이들 세 가지 뿌리병에 대하여 생조절 활성(질병 억제 능력)을 갖는다.
제 2 실시예에 따른 이 방법을 이용하면, 발명의 균주인 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Z30-97; Z32-97; Z33-97; 및 Z34-97의 생물학적으로 순수한 배양균을 얻을 수 있다. 이들 균주들은 제 1 실시예에 따른 모균주인 P. 플루오레센스(P. fluorescens) Q8r1-96을 형질전환시켜 페나진-1-카르복시산 생성을 위한 생합성 유전자 자리를 게놈에 안정하게 도입시켜서 얻었다. 이는 하기 실시예 5에서 자세히 논의하기로 한다. 모균주 P. 플루오레센스(P. fluorescens) Q8r1-96은 항생성 2,4-디아세틸플로로글루시놀(Ph1)을 생성하고, 형질전환 균주에 수여된 PCA 생합성 유전자의 도임으로 Ph1 뿐만 아니라, 페나진-1-카르복시산도 생성할 수 있게 된다.
하기 실시예 6에 나타낸 바와 같이, 페나진-1-카르복시산 생합성 유전자를 첨가함으로써 모균주 Q8r1-97이나 균주 2-79보다 라이족토니아(Rhizoctonia)를 효과적으로 억제하는 형질전환 균주로서 페나진-1-카르복시산 생합성 유전자 자리의 근원인 균주를 얻을 수 있다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 균주 Z34-97은 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Q8r1-96과 바실러스(Bacillus)종 L324-92를 비롯한 다른 라이족토니아(Rhizoctonia) 억제 균주가 필요로 하는 양보다 100배 내지 100배 낮은 102내지 103일 때 라이족토니아(Rhizoctonia) 억제가 효과적이다.
균주 특성
모균주 Q8r1-96은 베르게이(Bergey)의 매뉴얼에 설명되어 있는 것과 같이 P. 플루오레센스(P. fluorescens)의 물리학적 특성과 기질 이용 패턴을 나타낸다(표 10 참조). 균주 Q8r1-96도 항생성 2,4-디아세틸플로로글루시놀을 생성한다. Z34-97과 같은 본 발명의 형질전환 균주는 2,4-디아세틸플로로글루시놀과 함께 페나진-1-카르복시산을 생성하는 것을 제외하고는 모균주의 특성을 그대로 가지고 있다.
등록
균주 Q841-96, L5.1-96 및 ML4.9-96의 생물학적으로 순수한 배양균은 농업 연구 문화 컬렉션(NRRL)(1815 North University Street, Peoria, I11. 61604)에서 부다페스트 조약에 의거, 1997년 7월 8일에 등록되었으며 각각 NRRL B-21806, NRRL B-21807 및 NRRL B-21808의 취득 번호를 부여받았다. 본 발명은 NRRL B-21806, NRRL B-21807 및 NRRL B-21808의 확인 특성을 갖는 균주들도 포함한다. 본 발명을 위하여, 항생성 2,4-디아세틸플로로글루시놀의 생성을 암호화하는 생합성 유전자 자리를 갖고 상기에 설명한 띠모양을 나타내며, 소형 곡류작물이나 잔디에서 Gg에 의해 유발되는 질병을 억제하고 특징적인 뿌리 군집력을 가질 수 있는 부차배양균과 그 변종을 비롯하여 균주 NRRL B-21806, NRRL B-21807 및 NRRL B-21808의 확인 특성을 갖는 분리주가 포함된다.
P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Z32-97, Z33-97, 및 Z34-97의 생물학적으로 순수한 배양균은 농업 연구 문화 컬렉션(NRRL)(1815 North University Street, Peoria, I11. 61604)에서 1997년 12월 11일에 등록되었으며, P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Z30-97은 1997년 12월 15일에 등록되어 각각 NRRL B-21905, NRRL B-21906, NRRL B-21907 및 NRRL B-21908의 취득 번호를 부여받았다. 이들 균주들은 모두 부다페스트 조약에 의거하여 등록되었다. 본 발명은 게놈에 안정하게 도입된 항생성 2,4-디아세틸플로로글루시놀의 생성을 암호화하는 생합성 유전자 자리를 갖고 토양 전파성 병원균인 라이족토니아(Rhizoctonia)에 의한 질병을 억제하며 모균주의 2,4-디아세틸플로로글루시놀의 유전자 자리를 갖는 부차배양균과 그 변종을 비롯하여, NRRL B-21905, NRRL B-21906 및 NRRL B-21907 및 NRRL B-21908의 확인 특성을 갖는 분리주도 포함한다. 바람직한 실시예에서, 분리주는 또한 상기에 자세히 설명한 바와 같이 모균주의 유전자 유형을 갖는 네 가지 밴드를 나타낸다. 여기서, 변종이라 함은 앞서 지정한 특성을 갖는 형질전환체와 돌연변이체를 포함하는 것으로 정의된다.
발명에 따른 균주의 생장
발명의 제 1 실시예에 따른 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 균주는 적당한 고체상 또는 액상의 세균학적 배지에서 배양시킬 수 있다. 사용되는 배지로는 킹스(King's) 배지 B가 있다. 균주의 생장은 약 15 ℃ 내지 30 ℃에 해당하는 생물의 생장에 적당한 온도를 갖는 호기 조건에 이루어진다. 바람직한 온도 범위는 약 24 ℃ 내지 28 ℃이다. 영양 배지의 pH는 대략 중성, 즉 pH 6.7-7.2인 것이 바람직하다.
발명의 제 2 실시예에 따른 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 균주도 적당한 고체상 또는 액상의 세균학적 배지에서 배양시킬 수 있다. 사용되는 배지로는 킹스(King's) 배지 B가 있다. 균주의 생장은 약 15 ℃ 내지 30 ℃에 해당하는 생물의 생장에 적당한 온도를 갖는 호기 조건에 이루어진다. 바람직한 온도 범위는 약 24 ℃ 내지 28 ℃이다. 영양 배지의 pH는 대략 중성, 즉 pH 6.7-7.2인 것이 바람직하다.
보존 배양균의 유지
각 균주는 -80 ℃에서 글리세롤 내에 보관하는 것과 같이 안정한 상태를 유지하도록 한다.
Gg 억제성 균주의 이용
발명에 따른 미생물 균주는 Gg에 의해 유발되는 소형 곡류작물이나 잔디의 질병을 조절하는 데에 유용하다. 소형 곡류작물의 예로는 밀, 보리, 호밀 및 라이밀이 있다. Gg에 의해 유발되는 질병의 예를 들면, 가장 중요한 밀의 뿌리 질병이고 보리, 호밀 및 라이밀과 같은 다른 볏과 식물에 전염될 수 있는 Ggt에 의한 맥류마름병이다. 다른 Gg 균류로는 귀리와 볏과 식물에 전염되는 Gg와, 잔디에 맥류마름병을 유발하는 것으로 확인된 Gg와, 일부 볏과 식물에 전염되는 Gga가 있다.
소형 곡류작물과 잔디에서 Gg에 의해 유발되는 질병을 생조절하기 위하여, 유효 억제량의 한 가지 이상의 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 균주와 함께 작물이나 잔디를 재배한다. 유효 억제량은 비처리 대조군에서 발생하는 것에 비하여 소정의 뿌리 질병(들)을 억제하는(발병을 억제하거나, 질병의 발생이나 악화를 감소시키는) 생조절제의 양으로 정의된다. 비처리 대조군에 비하여 밭재배 소형 곡류작물 또는 잔디의 발병률이 저어도 15% 이하가 되도록 생물학적으로 순수한 배양균을 접종시키는 것이 적정하다. 생조절은 유효량의 생조절제를 식물이나 식물의 종자, 또는 식물이나 종자의 유전자 자리에 첨가함으로써 이루어진다. 예를 들면, 균주를 종자, 토양 또는 밭고랑에 처리하거나 잔디나 토양에 적시는 형태로 가할 수 있다.
균주는 뿌리 질병을 통제하고자 하는 식물에 접종하기에 적당한 조성물에 결합시켜 사용할 수 있다. 그러므로, 균주를 농학상으로 허용되는 매개체나, 균주의 활성을 방해하지 않을 농경학상으로 허용되는 매개체와 섞어서 사용할 수 있다. 이와 같은 매개체로는 물, 완충액, 메틸셀룰로오스, 이탄, 또는 질석이 있다. 균주를 액상 매개체의 현탁액이나 에멀젼으로 사용하는 경우, 현탁액이나 에멀젼은 종래와 같이 계면활성제나 습윤제와 같은 종래의 첨가제를 선택적으로 함유할 수 있다. 발명에 따른 균주는 본 발명의 제 2 실시예에 따른 다른 균주와, 제 1 실시예의 균주 또는 종래의 균주를 비롯하여 다른 생조절 균주를 포함하도록 제조할 수도 있다.
다음은 균주의 사용 방법과 그 유효량을 설명하기로 한다. 특정한 경우 유효 범위에 해당하는 사용량은 실험을 통하여 결정할 수 있다.
소형 곡류작물나 잔디, 또는 그밖에 식용 식물, 섬유성 식물 또는 관상 식물을 종자 처리하기 위하여, 약 0.5 내지 2.0%의 메틸셀룰로오스를 함유하는 현탁액에 박테리아를 첨가한다. 현탁액을 종자에 첨가 혼합하여 종자 당 약 102내지 105CFU로 종자를 피복하도록 한다. 일반적으로, 바람직한 양은 종자 당 약 102내지 104CFU이다. 처리된 종자는 공기 건조시킨다.
토양을 처리하기 위하여, 박테리아를 물이나 완충액에 부유시켜 토양 그램당 약 102내지 105CFU가 되도록 토양에 첨가한다. 잔디의 경우, 박테리아를 물이나 완충액에 부유시키고 ㎖ 당 약 102내지 105CFU를 포함하는 용액으로 잔디에 첨가한다.
매개체가 이탄이나 질석과 같은 고체인 경우, 일반적인 제형은 매개체 그램당 약 106내지 109CFU이다. 매개체가 액체이면, 매개체 ㎖당 약 108내지 1010CFU가 되게 한다. 동결 건조 제형인 경우, 제형 그램당 약 1010내지 1011CFU가 되게 한다. 동결 건조된 제형에 종래에 공지된 첨가물을 포함시킬 수 있다.
발명에 따른 유전자 변이주를 제조하기 위한 모균주
본 발명에 따른 유전자 변이주를 제조하는 데에 유용한 모균주는 (1) 2,4-디아세틸플로로글루시놀의 생성을 암호화하는 생합성 유전자 자리를 갖고 (2) 하기와 도 1에 상세히 설명하고 있는 바와 같이 특징적인 띠모양으로 나타나는 고유의 유전자형을 가지고 있는 등의 특성을 가진 균주이다. 이와 같은 균주의 띠모양은 하기 실시예 5에서 설명하는 바와 같이 프라이머 M13을 이용한 RAPD 분석에 의해 확인할 수 있다. 이에 해당하는 균주로는 앞서 논의한 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Q8r1-96, ML4.9-96, 및 L5.1-96이 있다.
본 발명을 구현하기 위하여, 모균주는 실시예 5에서 설명한 조건에서 600 ±50 bp; 700 ±50 bp; 800 ±50 bp; 900 ±50 bp에서 밴드가 나타나면 본 발명에 따른 특징적인 띠모양을 갖는다고 할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 모균주는 또한 330 ±20 bp와 1100 ±60 bp에서도 밴드가 나타난다.
모균주가 특징적인 띠모양을 갖고 있는지를 확인하기 위한 다른 방법은 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Q8r1-96과 시험 균주를 이용하여 실제적으로 약 600 ±50 염기쌍과 900 ±50 염기쌍 사이의 밴드를 비교하는 것이다. 즉, 한천젤에서 단계별 비교를 수행한다. 이 영역에서 시험 균주의 프로파일이 균주 Q8r1-96의 프로파일과 일치하면, 시험 균주는 본 발명에 의한 특징적인 띠모양을 가지며, 선택적으로 밭에서 재배되는 소형 곡류작물이나 잔디에서 Gg에 의해 유발되는 질병을 억제하고, 종래의 Gg 억제성 균주에 비하여 개체 밀도가 높고 군집력이 우수한 것을 특징으로 하는 뿌리 군집력을 나타내는 것으로 해석한다.
모균주의 생조절 활성
생물학적으로 순수한 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 모균주의 생조절 활성은 상기에 논의한 바와 같다.
TAD 토양의 생조절 재현
발명에 따른 모균주는 소형 곡류작물에서 Gg에 의해 유발되는 질병을 억제하는 능력이 소형 곡류작물이 맥류마름병 감퇴(TAD) 상태의 토양에서 자랐을 때에 나타나는 생조절 수준과 같은 것이 특징이다. 즉, 이 균주는 맥류마름병 감퇴 토양에서 얻을 수 있는 수준의 생조절 현상을 재현할 수 있다. 예를 들면, 104 콜로니 형성 단위(CFU)/종자의 양만큼 Q8r1-96을 사용하여 퀸시 버진(전파성) 토양에 파종하였을 때 퀸시 TAD 토양과 같이 맥류마름병을 억제하는 데에 효과가 있었다. 또한, Qr81-96은 린드 버진 토양에 10 %(w/w)으로 접종하였을 때 퀸시 TAD 토양과 같이 린드 버진(전파성) 토양에 효과적이었다. 이와 같이 자연적인 맥류마름병 감퇴와 같은 수준으로 맥류마름병을 억제할 수 있는 것은 전례에 없는 일이다.
상기 과정의 출발 물질로서 사용되는 데에 바람직한 모균주를 얻는 방법은 모균주로서 P. 플루오레센스(P. fluorescens) Q8r1-96, ML4.9-96, 및 L5.1-96의 생물학적으로 순수한 배양균에 대하여 상기에 설명하였다.
모균주의 생장과 모균주의 보존 배양균의 유지는 본 발명의 유전자 변이주에 대하여 앞서 설명한 것과 같이 수행된다.
실 시 예
다음 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이며, 청구항에 의해 정의된 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1]
다음은 본 발명의 제 1 실시예에 따른 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종의 선택을 설명하는 것이다.
개 관
1996년에 맥류마름병 감퇴(TAD) 상태에 있던 미국 워싱턴주의 퀸시, 린드 및 모세 레이크 근처의 농경지에서 채취한 토양에서 재배한 밀의 뿌리로부터 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Q841-96, L5.1-96 및 ML4.9-96을 분리하였다. Q8r1-96은 8 회의 연속적인 생장 주기(각 주기가 3 주이다) 동안에 퀸시 TAD 토양에서 자란 밀의 뿌리로부터 분리하였고; L5.1-96은 5 회의 연속적인 생장 주기(각 주기가 3 주이다) 동안에 린드 TAD 토양에서 자란 밀의 뿌리로부터 분리하였고; 그리고 ML4.9-96은 4 회의 연속적인 생장 주기(각 주기가 3 주이다) 동안에 모세 레이크 TAD 토양에서 자란 밀의 뿌리로부터 분리하였다.
다음은 토양, 분리주 및 특성화 방법에 대하여 상세히 설명하기로 한다.
토 양
맥류마름병 감퇴(TAD) 상태에 있던 미국 워싱턴주의 퀸시, 린드 및 모세 레이크 근처의 농경지에서 세 가지 토양을 채취하였다. 이들 토양은 모두 밀의 맥류마름병에 대하여 억제성이 있다. 1995년에는 린드 TAD 밭에서 28년 동안 연속으로 밀을 수확하였다. 1980년에는 퀸시와 모세 레이크의 TAD 밭에서 22년 동안 연속으로 밀을 수확하였고, 1980년과 1995년 사이에는 밀 이외에도 다른 곡물을 재배하였다. 1995년 3월에 토양의 상부 30 ㎝를 채취하여 1 주일 동안에 공기 건조시키고 사용하기 전에 0.5㎝ 망상 스크린으로 걸렀다. 토양의 물리 화학적인 특성은 아이다호 대학의 분석 과학 실험실에서 측정하였다.
단계 1: pH1 생성 유전자를 증가시키기 위한 밀의 연속 재배.
피티움(Pythium) 뿌리 부패병을 억제하기 위한 활성 성분을 2.5 ㎎/㎖ 함유하는 체질한 중성 토양(퀸시, 린드, 모세 레이크) 200 g와 메탈라실(Novartis, Greensboro, NC)을 보충한 물 50 ㎖를 담은 정방형 PVC 화분(높이 8 ㎝, 폭 7.5 ㎝)에 12 개의 밀 종자를 파종하였다. 슈도모나스(Pseudomonas)는 이 살균제의 영향을 받지 않는다. 토양 1 ㎝ 층을 종자 상부에 뿌려 주었다. 그리고, 12 시간의 광주기로 16 ℃의 환경 통제실 내에서 식물을 재배하였다. 일주일에 두 번 화분에 희석(2:3 v/v) 호글랜드액(거대 원소만) 50 ㎖를 주었다. 재배한지 3주 내지 4주가 되어 토양 표면에서 싹이 올라올 때, 토양과 관련 뿌리계를 플라스틱 백으로 옮겨서 세게 흔들어 통풍시키고 섞어 주었다. 이렇게 '배양된' 토양을 15 ℃에서 1주일 동안 두었다가 같은 화분으로 옮긴 후, 12 개의 밀 종자를 다시 파종하였다. 이와 같은 재배와 수확의 과정을 적어도 네 번 내지 8 번 연속으로 반복하였다. 이 때마다 무작위로 네 개의 식물을 채취하고, 항생제를 생성하는 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종의 개체 크기를 결정하기 위하여 뿌리 샘플을 마련하였다.
단계 2: TAD 토양에서 재배한 밀의 뿌리로부터 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 분리.
단계 1에서 재배한 식물을 무작위로 4 개씩 각 생장 주기마다 수확하고 가볍게 흔들어 뿌리에 붙은 흙을 떼어 내었다. 뿌리와 관련 근권 토양 1.0 g를 0.5 ㎖의 멸균수에 넣고 보텍스 혼합기에서 1분 동안 세게 흔들었다. 그런 다음, 초음파 세정 장치에서 1분 동안 시료를 초음파 처리하고, 뿌리를 씻은 물을 시클로헥시미드(100 ㎍/㎖)와 클로로암페니콜(13 ㎍/㎖)과 암피실린(40 ㎍/㎖)으로 보충한 킹스 배지 B[kmb] 한천(프로테오스 펩톤 20 g; 글리세롤 10 ㎖; K2HPO41.5 g; MgSO41.5 g; 한천 15 g; H2O 1000 ㎖) [KMB+] 위에 부었다. 플레이트를 25 ℃에서 배양하여 48시간 후에 콜로니의 수를 세었다. 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 콜로니를 자외선(파장 366 ㎚)을 복사하여 비형광성 콜로니와 구별하였다.
단계 3: 특수 프로브를 이용한 콜로니 혼성화에 의한 Ph1 생성 유전자 검출.
Ph1 생성 유전자를 갖는 형광성 슈도모나스(Pseudomonas)의 개수는 콜로니 혼성화를 이용하여 결정하였다. 표준 방법에 의해 박테리아 콜로니를 하이본드-N+나일론막(Amersham)으로 옮겼다. 공기 건조를 실시한 막을 진공 오븐에서 80 ℃로 1 시간 동안 구웠다. 박테리아 세포 잔해물을 제거하기 위하여, 막을 2 x SSPE(20 nM NaH2PO4[pH 7.4], 0.36 M NaCl, 2 mM EDTA)와 0.1% 데도실황산나트륨(SDS)과 프로나아제(100 ㎍/㎖)를 함유하는 용액으로 42 ℃에서 1.5 시간 동안 세척하고 다시 2 x SSPE와 0.1% SDS로 56 ℃에서 1 시간 동안 세척하였다. 혼성화는 표준 방법으로 실행하였다. 혼성화 조건은 전혼성화를 65 ℃에서 1.5 시간 동안 수행하고, 혼성화를 65 ℃에서 12 분 동안 수행하고, 실온에서 막세척을 2 x SSC와 0.1% SDS로 5 분 동안 두 번 수행하고, 다시 65 ℃에서 0.1 x SSC와 0.1% SDS로 30 분간 막세척을 두 번 수행하는 것을 포함한다.
프로브는 2,4-디아세틸플로로글루시놀의 합성 유전자 자리 내의 시퀀스(유전자은행 취득 번호 U41818)로부터 발생시켰다. 비방사선 DIG 시스템(보링거 만하임; Boehringer Mannheim)을 이용하여 PCR 단편을 표지함으로써 Q2-87의 Ph1 D의 시퀀스로부터 프로브를 얻었다. 이렇게 해서 얻은 혼성 프로브를 항-디곡시제닌-AP-Fab 단편으로 면역 검출하고, 제조자가 제공한 절차에 따라 비색 기질 니트로블루 테트라졸륨염과 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴인산으로 처리하여 가시화하였다.
Ph1 생성 유전자를 분리하기 위하여, 막상의 신호를 한천 배지의 콜로니와 연계시켰다. 막 위에 신호를 나타낸 각 콜로니를 채취하여 스트리킹하고 안정하고 순수한 균주가 될 때까지, 즉 생물학적으로 순수한 배양균이 될 때까지 다시 스트리킹하였다. 균주를 안정한 상태로 유지하기 위하여 -80 ℃에서 글리세롤에 보관하였다.
단계 3a (선택적): PCR에 의한 Ph1 생성 유전자 확정.
이 선택 단계는 분석에서 잘못 나타난 양성 반응을 콜로니 혼성물로부터 제외시키는 것이다.
25 ℃에서 48 시간 동안에 MMB 배지에서 배양한 배양균으로부터 PCR 분석에 사용한 열용균 현탁액을 마련하였다. 두 개의 박테리아 콜로니(직경 2 ㎜)를 100 ㎕의 용균액(0.05 M NaOH, 0.25% SDS)에 띄우고 100 ℃에서 15 분 동안 배양시켰다. 현탁액을 12,000 rpm으로 1 분 동안 원심분리하고 멸균 증류수에 50 배로 희석하였다. 희석 현탁액 5 ㎕를 각 반응에 사용하였다.
프라이머와 PCR 분석
P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Q2-87의 2,4-디아세틸플로로글루시놀 합성 유전자 자리 내의 시퀀스(유전자은행 취득 번호 U41818)로부터 PCR에 사용하는 올리고누클레오티드 프라이머를 얻었다. 프라이머는 오페론 테크놀러지사(Alameda, CA)가 합성한 것이다. 프라이머 Ph12a(시퀀스: GAGGACGTCGAAGACCACCA)와 Ph12b(시퀀스: ACCGCAGCATCGTGTATGAG)를 ph1D 내의 시퀀스로부터 얻었다. ph1D는 식물에서 추출한 캘콘 합성 효소와 동형인 349 아미노산을 가진 단백질이다.
희석한 열용균 세포 현탁액 5 ㎕와 1 x GeneAmp PCR 완충액(Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT)과 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP(Perkin Elmer) 각 200 μM과, 각 프라이머 20 pmole과 AmpliTaq DNA 폴리메라아제(Perkin Elmer) 2.0 U를 함유하는 반응 혼합물 25 ㎕로 PCR 증폭을 수행하였다. 각 혼합물에 미네랄유 한 방울을 떨어뜨렸다. 증폭은 Perkin Elmer Thermal Cycler 480에서 수행하였다. PCR 절차는 94 ℃에서 2분 동안 초기 변성한 후, 94 ℃에서 60초 동안, 67 ℃에서 45초 동안, 72 ℃에서 60초 동안 30 번 변성시키는 방식으로 하였다. PCR 생성물의 시료 9 ㎕를 3 시간 동안에 75 V로 1 x TBE 완충액(90 mM 삼중붕산염, 2 mM EDTA (pH 8.3))에 담근 1.2% 한천 겔에서 분리시켰다. 한천 겔에 브롬화에티듐으로 30분 동안 착색하고 UV 투시기로 PCR 생성물을 가시화하였다.
단계 4: RAPD 분석을 이용하여 소정의 띠모양을 나타내는 Ph1 생성 유전자 확인.
퀸시, 린드 및 모세 레이크 TAD 토양에서 자란 밀의 뿌리로부터 분리한 서로 다른 Ph1 생성 슈도모나스(Pseudomonas) 균주들을 무리 분석하기 위하여 프라이머 M13을 이용한 RAPD(랜덤 증폭 다형성 DNA) 분석을 수행하였다.
희석한 열용균 세포 현탁액 5 ㎕와 1 x GeneAmp PCR 완충액(Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT)과 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP(Perkin Elmer) 각 200 μM과, 프라이머 M13 20 pmole과 AmpliTaq DNA 폴리메라아제(Perkin Elmer) 2.0 U를 함유하는 반응 혼합물 25 ㎕로 PCR 증폭을 수행하였다. 각 혼합물에 미네랄유 한 방울을 떨어뜨렸다. 증폭은 Perkin Elmer Thermal Cycler 480에서 수행하였다. PCR 절차는 초기 변성을 94 ℃에서 1분 30초 동안 수행한 후, 94 ℃에서 30초, 36 ℃에서 30초, 72 ℃에서 2분 동안 두 번, 94 ℃에서 20초, 36 ℃에서 15초, 45 ℃에서 15초, 72 ℃에서 1분 30초 동안 40 번, 그리고 72 ℃에서 10분 동안 한 번 수행하였다. PCR 생성물의 시료 9 ㎕를 5 시간 동안에 75 V로 1 x TBE 완충액(90 mM 삼중붕산염, 2 mM EDTA (pH 8.3))에 담근 2.5% 한천 겔에서 분리시켰다. 한천 겔에 브롬화에티듐으로 60분 동안 착색하고 UV 투시기로 PCR 생성물을 가시화하였다.
프라이머 M13을 이용한 RAPD 분석을 수행한 결과, 발명에 따른 생물학적으로 순수한 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 균주는 고유의 띠모양을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 도 1은 본 발명에 따른 균주인 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Q8r1-96, ML4.9-96, 및 L5.1-96의 띠모양(RAPD)을 보여주고 있다. 1번 레인은 기준선으로서 1-kb 래더를 나타낸다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 균주에 공통적인 밴드는 330 ±20 bp; 600 ±50 bp; 700 ±50 bp; 800 ±50 bp; 900 ±50 bp; 및 1100 ±60 bp이다.
[실시예 2]
다음은 본 발명의 제 1 실시예에 따른 생조절 균주를 이용한 TAD 재현을 설명하는 것이다.
실시예 1에서 설명한 바와 같이 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 8r1-96을 분리하여 증식시켰다. 박테리아를 0.5% 메틸셀룰로오스에 떨어뜨리고 밀 종자(cv. Penawawa)와 섞어서 종자 당 104CFU의 양이 되도록 하였다. 대조군으로 사용된 종자에는 메틸셀룰로오스만이 주어졌다. 퀸시 버진, 퀸시 TAD, 풀만 전파성 토양 및 풀만 TAD 토양을 맥류마름병 병원균의 귀리 접종물(크기 0.25-0.5 ㎜) 0.5%(w/w)로 처리하였다. 피티움(Pythium) 뿌리 부패병을 억제하기 위한 활성 성분을 2.5 ㎎/㎖ 함유하는 체질한 중성 토양 50 g와 메탈라실(Novartis, Greensboro, NC)로 보충한 물로 적신 정방형 플라스틱 화분(높이 3 ㎝, 폭 3 ㎝)에 4 개의 처리 종자를 파종하였다. 그리고, 12 시간의 광주기로 16 ℃의 환경 통제실 내에서 식물을 재배하였다. 일주일에 두 번 화분에 희석(2:3 v/v) 호글랜드액(거대 원소)을 주었다. 생장기 4주가 된 식물을 채취하여 뿌리 질병을 평가하고 발아의 측량하여 측정하였다.
그 결과는 아래의 표와 같으며, 퀸시 버진 토양이나 풀만 전파성 토양에 도입된 균주 Q8r1-96이 퀸시 TAD 및 풀만 TAD 토양과, 풀만 전파성 토양에 전이된 퀸시 TAD에서 나타난 것과 같은 정도의 질병 억제성을 보였다. 균주 Q8r1-96은 풀만 TAD 토양의 억제 능력을 향상시키지 못하였다.
표 1: Ph1 생성 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Q8r1-96과 전이된 퀸시 TAD 토양이 천연 토양의 맥류마름병의 정도에 미치는 영향.
주)
u: 퀸시 토양과 풀만 코드 토양은 모두 밀의 맥류마름병에 전파성이지만, TAD 토양은 맥류마름병을 억제한다. 퀸시 버진 토양과 퀸시 TAD 토양은 이전 각 4주씩 6번 연속으로 밀을 경작하여 미생물을 활성화시킨다. 풀만 콘드와 풀만 TAD 토양은 밀을 재배한 밭에서 직접 채취하였다. 모든 토양에 맥류마름병 병원균의 귀리 접종물을 0.5%(w/w) 처리하였다. Q8r1-97로 처리한 밀 종자는 종자당 104CFU를 나타냈다.
v: 도입된 균주 Q8r1-97이나 자연발생적인 Ph1 생성 형광성 슈도모나스종의 개체 크기, 질병의 정도, 식물 무게, 및 발아 높이를 식물 생장한 지 4 주 후에 측정하였다. 두 개의 식물의 여섯 세대의 평균값으로 나타내었다. 처리군간에 Ph1 생성 형광성 슈도모나스종의 개체 크기, 질병의 정도, 식물 무게, 및 발아 높이의 차이는 터키의 범위 시험에 따라 변량의 분석하여 결정하였다. 질병 정도의 차이는 윌코손 랭크 섬 테스트에 의해 평가하였다. 각 실험과 파라미터에 대하여, 서로 다른 문자의 평균값은 통계적으로 유의차가 큰 것을 나타낸다(α=0.05).
w: 맥류마름병의 정도는 0에서 8까지의 등급으로 나누었다(0급: 질병없음, 8급:고사).
x: 검출 하한값 104CFU/g(뿌리) 이하.
y: 풀만 콘드와 풀만 TAD 토양을 각자 퀸시 TAD 토양과 9:1의 비율(w/w)로 혼합하였다.
[실시예 3]
다음은 밭에서 경작한 밀에서 맥류마름병의 생조절에 관한 설명이다.
P. 플루오레센스(P. fluorescens) Q8r1-96을 워싱턴주 알모토의 일반 밭에서 시험하였다. 사용한 밭에서는 이전 해에 밀을 재배하였으며 자연발생적으로 맥류마름병에 전염되었다.
실 험
겨울밀을 재배한 밭에 봄밀(cv. Alpowa)의 종자를 직파하였다. 실시예 1에서 설명한 바와 같이 분리하여 1.5% 메틸셀룰로오스에서 증식시킨 P. 플루오레센스(P. fluorescens) 균주 Q8기-96을 종자 당 1 ×105CFU 내지 1 ×106CFU의 양만큼 봄밀(cv. Alpowa)에 접종하였다. 그리고, 대조군은 처리하지 않은 종자이다. 표 2에서 ″훈증소독″이라고 명시한 대조군의 경우, 브롬화메틸로 훈증하여 병원균을 제거한 토양에 비처리 종자를 파종하여 ″건강한″ 대조군을 마련하였다. ″대조군″이라고 명시한 다른 대조군은, 비처리 종자를 천연 토양에 파종하여 ″병든″ 대조군을 마련하였다. 종자는 25 피이트 길이로 서로 1 피이트씩 떨어진 여덟 개의 줄로 나누어 심었다. 밀은 파종한 지 135일 후에 수확하였다.
결 과
실험 결과는 하기의 표 2에 나타내었다. 표의 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 균주 8r1-96은 식물의 발병율을 20% 감소시켰다.
표 2
주) a: 같은 문자로 이어지는 평균값은 크게 차이가 나지 않는다.
P = 0.1, LSD = 21.1
[실시예 4]
다음은 본 발명에 따른 균주의 우수한 군집력을 증명하고자 한다.
본 발명에 따른 균주인 P. 플루오레센스(P. fluorescens) Q8r1-96을 (본 발
표 3
군집력을 평가함에 있어서, 각 균주들을 토양의 단위 그램당 100 CFU(박테리아 세포)의 양만큼 퀸시 버진 토양, 린드 버진 토양 및 모세 버진 토양에 접종하였다. 이 때, 화분 크기는 높이 8 ㎝, 폭 7.5 ㎝이었다. 각 토양에서 3 주 동안에 밀(cv. Penawawa)을 재배하여 수확하고, 희석 배양을 통하여 뿌리에 서식하는 세균 개체수를 결정하였다.
토양과 관련 뿌리계를 플라스틱 백으로 옮겨서 세게 흔들어 통풍시키고 섞어 주었다. 채취한 지 일주일 후, 각 토양을 같은 화분으로 옮기고 밀 종자를 다시 파종하였다. 따라서, 각 생장 주기는 4주이다.
결 과
도 2는 9 회의 생장 주기 후에 퀸시 버진 토양에서 서식하는 세 가지 균주들의 개체 밀도(CFU/g(뿌리))를 보여준다. 도면의 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 9 회의 생장 주기 후에 균주 Q8r1-96은 105CFU/g(뿌리) 이상의 개체 밀도를 나타냈다. 이와 대조적으로, 균주 M1-96 및 Q2-87(본 발명과 무관함)은 102CFU/g(뿌리)로 감소하였다. 도면의 데이터를 보면, 본 발명의 균주가 다른 생조절 균주보다 군집력이 우수함을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 균주는 훨씬 많이 뿌리에 군집을 이루며 군집력의 향상을 나타냈다.
퀸시 버진 토양에서 생조절 활성 비교
9 번 째 주기에서, Ggt의 접종물을 귀리 작물을 재배하는 토양에 접종하였다. 접종물을 분쇄하여 체에 걸러서 크기가 0.25 내지 0.50 ㎜의 입자를 0.5%(w/w)의 농도로 토양과 섞었다. 그리고, 하기와 같이 맥류마름병의 정도를 0에서 8까지 등급을 매겼다. 박테리아를 토양에 박테리아를 접종시키지 않은 대조군과 비교하였다. 식물을 4주 동안에 화분(길이 8 ㎝, 폭 7.5 ㎝)에서 재배하였다. 결과 데이터는 하기 표 4에 나타내었다. 표에서 알 수 있는 바와 같이, Q8r1-96(발명의 균주)만이 맥류마름병을 억제하였다. 본 발명과 무관한 균주로 처리한 식물은 대조군(비처리 식물)과 같은 발병율을 나타냈다. (9 번 째 주기에서) 발명 균주 Q8r1-96이 질병에 대한 우수한 억제 능력을 나타내는 것은 본 발명의 균주가 뿌리 군집력이 우수하며 잔존율도 높기 때문이며, 생조절제로서의 유용성을 보여주는 것이다.
표 4
주)1: 맥류마름병을 0에서 8까지 등급을 매겼다(Ownley et al., Phytopathology 82:178-184 (1992)):
0급: 질병이 나타나지 않음.
1급: 뿌리 면적의 10% 미만에 검은 병반 발생.
2급: 뿌리 면적의 10-25%에 검은 병반 발생.
3급: 뿌리 면적의 25% 이상에 검은 병반이 발생하고, 병반이 줄기 기부에 나타나는 뿌리가 한 개임.
4급: 병반이 줄기 기부에 나타나는 뿌리가 한 개 이상임.
5급: 뿌리 다섯 개 모두 병반이 줄기 기부에 나타나고, 적어도 한 개의 병반은 줄기 아래에 있지만 잎의 백화 현상은 없음.
6급: 뿌리 여섯 개에서 병반이 줄기에 나타나고, 첫 번째 본옆에 백화 현상이 있음.
7급: 모든 잎에 백화 현상이 나타나고, 식물의 발육이 부진함.
8급: 식물이 고사하였거나 거의 고사 상태임.
3: 본 발명에 따르지 않은 비교예이다.
도 3과 도 4는 7 회의 생장 주기 후에 린드 및 모세 레이트 버진 토양에서 서식하는 세 가지 균주들의 개체 밀도(CFU/g(뿌리))를 보여준다. 도면의 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 7 회의 생장 주기 후에 균주 Q8r1-96은 105CFU/g(뿌리) 이상의 개체 밀도를 나타냈다. 이와 대조적으로, 균주 M1-96 및 Q2-87(본 발명과 무관함)은 102CFU/g(뿌리)로 감소하였다. 도면의 데이터를 보면, 본 발명의 균주가 다른 생조절 균주보다 군집력이 우수함을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 균주는 훨씬 많이 뿌리에 군집을 이루며 군집력의 향상을 나타냈다.
도 5는 퀸시 버진 토양, 린드 버진 토양, 및 모세 레이트 버진 토양에서 서식하는 본 발명의 균주 P. 플루오레센스(P. fluorescens) Q8r1-96의 군집력을 보여준다. 도면의 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 발명의 균주는 토양의 종류에는 영향을 받지 않는다.
[실시예 5]
다음은 형광성 슈도모나스의 유전자 변이 페나진 생성 균주의 구성을 설명하기 위한 것이다.
하기의 모든 실험에서, 플라스미드 DNA 분리, 제한 효소 소화, 한천겔 전동법, DNA 결찰, 및 형질전환에 표준 방법을 사용하였다(Ausubel, F.M., R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, and K. Struhl (ed.), 1995. Short Protocols in Molecular Biology. J. Wiley and Sons, N.Y.). 하기 실험을 수행하기 위해 필요한 모든 효소(제한 핵산중간분해효소, T4 DNA 리가아제, DNA 폴리메라아제 I의 Klenow 단편 포함)와 시약은 라이프 테크놀러지(게이터스버그, MD)에서 구입한다. 한천겔에서 DNA를 추출하는 데에는 QIAGEN사(챗워스, CA)에서 시판하는 QIAEX II 겔 추출 키트를 사용하였다. 모든 DNA 복제 실험에 사용되는 대장군 균주 JM109는 프로메가사(매디슨, WI)에서 구입한다. 모든 박테리아 균주들은 LB 배지(박토 트립톤(디프코 연구소, 디트로이트, MI) 10g; 효모 추출물(디프코 연구소, 디트로이트, MI) 5g; NaCl 5g; 및 H2O 1000 ㎖)에서 증식시켰다.
단계 1: tac 프로모터의 조절하에 phz 유전자의 복제.
P. 플루오레센스(P. fluorescens) 2-79에서 얻은 phzA, -B, -C, -D, -E, -F 및 -G 유전자를 갖는 6.8-kb Bg1II-XbaI DNA 단편을 pALTER-Ex1 클로닝 벡터의 BamHI 및 XbaI 클로닝 위치에 삽입하였다. 여기서, pALTER-Ex1 클로닝 벡터는 복제 유전자의 체외 및 체내 발현을 위한 강력한 tac 프로모터와 결합된 가변성 다중연결자를 갖는다. pALTER-Ex1 클로닝 벡터는 프로메가사(메디슨, WI)에서 시판하고 있다. DNA 결찰 후, DNA 시료를 E. coli JM109의 콤피텐트균에 형질전환시키고, 형질전환체는 12 ㎍/㎖의 테트라사이클린으로 처리한 LB 한천에서 선택하였다. 테트라사이클린을 함유한 LB 영양 배지에서 몇 개의 콜로니를 배양한 후 플라스미드 DNA를 정화시키는 데에 사용하였다. 제한 핵산중간분해효소의 소화를 통하여 phz 생합성 유전자 자리의 삽입을 확정하였다.
단계 2: 페나진 생합성 유전자 자리의 전치 복제물 구성.
phz 유전자를 갖는 pALTER-Ex1의 DNA를 ScaI, XbaI 및 HindIII 제한 핵산중간분해효소로 처리하여 6.8-kb, 4.3-kb 및 1.4-kb DNA 단편을 생성하였다. tac 프로모터에 연결된 phz 유전자를 갖는 6.8-kb HindIII-XbaI DNA 단편(도 6)을 겔 전동법을 이용하여 다른 단편으로부터 분리한 후, 한천겔로부터 정화시키고, DNA 폴리메라아제 I의 Klenow 단편으로 말단을 둔화시켰다. 이 단편을 pUC18Sfi 클로닝 벡터의 DNA와 결찰시켰다(M. Herrero, V. de Lorenzo, K. Timmis, Journal of Bacteriology 172:6557-6567 (1990)). 여기서, 사용한 클로닝 벡터는 EcoRI 제한 핵산중간분해효소로 미리 절단하여 DNA 폴리메라아제 I의 Klenow 단편으로 처리하였다. 결철 혼합물을 E. coli JM109에 형질전환시키고, phz 유전자 자리가 삽입된 형질전환체는 40 ㎍/㎖의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드(X-gal) 및 80 ㎍/㎖의 암피실린으로 보충한 LB 한천에서 콜로니 색깔로 스크리닝하였다. 흰색의 콜로니를 갖는 형질전환체로부터 얻은 플라스미드 DNA 시료는 상기에 설명한 바와 같이 phz 유전자의 존재를 알아내기 위하여 스크리닝하였다.
phz 유전자 자리를 갖는 혼성 pUC18Sfi 플라스미드를 SfiI 제한 핵산중간분해효소로 처리하여 SfiI에 개방된 pUTKm 플라스미드(참조: Herrero et al.)와 결철시켰다. E. coli S17-1(λpir)의 콤피텐트균을 결철 혼합물로 형질전환시키고, 형질전환체는 각각 100 ㎍/㎖의 카나마이신과 암피실린으로 처리한 LB 한천에서 선택하였다. 몇 개의 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 정화하여 제한 핵산중간분해효소 EcoRI 및 HindIII로 절단시켜 phz 유전자의 존재를 확인하기 위해 스크리닝을 실시하였다. 그 결과로 얻은 플라스미드 pUTKm::phz의 유전자 지도는 도 6에 나타내었다. pUTKm::phz를 갖는 E. coli S17-1(λpir)은 슈도모나스균과의 접합을 위한 공여체로 사용하였다.
단계 3: E. coli S17-1(λpir)과 슈도모나스의 접합.
Herrero 등이 설명한 접합 기술을 이용하여 플라스미드 pUTKm::phz를 E. coli S17-1(λpir)에서 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas. fluorescens) Q8r1-96으로 옮겼다. 암피실린과 카나마이신을 모두 100 ㎍/㎖의 양으로 처리한 LB 영양 배지 10 ㎖에 넣고 37 ℃에서 흔들어 주면서 pUTKm::phz를 갖고 있는 공여균주 E. coli S17-1(λpir)을 하룻밤 동안에 배양하였다. 공여균주와 수용균주의 배양균들을 6,000 rpm으로 5분 동안 각각 원심분리하여 세로를 신선한 LB 영양 배지 1 ㎖에 가하였다. 공여체 E. coli S17-1(λpir) 균주의 세포 현탁액 30 ㎕를 LB 배지에 놓은 한 조각(2 ㎝ x 2 ㎝)의 니트로셀룰로오스막에 적가한 후, 수용균주의 세포 현탁액 20 ㎕를 공여체 위에 떨어뜨렸다. 순수한 니트로셀룰로오스막(0.45 미크론)은 바이오-레드 연구소(허큘리스, CA)에서 시판하고 있다. 막을 가진 배지를 27 ℃에서 밤새동안 배양시키고, 막으로부터 분리한 세포를 1 ㎖의 멸균수에 넣었다. 세포를 6,000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후, 1 ㎖의 멸균수에 넣었다. 세포의 현탁액을 10배로 희석시키고, 희석한 현탁액 100 ㎕를 100 ㎍/㎖의 카나마이신으로 보충한 M9 미네랄 배지(Na2HPO4x 7H2O, 21 g; KH2PO 3g; NaCl 0.5 g; NH4Cl 1.0 g; 1M CaCl20.1 ㎖; 1M MgSO42 ㎖; 20% 글루코스 20 ㎖; H2O 1000 ㎖)에 첨가하고 27 ℃에서 3 일 동안 배양하였다. M9-카나마이신 배지 위에서 배양된 Q8r1-96 수용균주의 콜로니를 카나마이신(100 ㎍/㎖)으로 보충한 킹스 배지(프로테오스 펩톤(디프코 연구소, 디트로이트, MI) 20 g; 글리세롤 10 ㎖; K2HPO41.5 g; MgSO41.5 g; 박토 한천(디프코 연구소, 디트로이트, MI) 15 g; H2O 1000 ㎖) 위에 넣고 형광 염료를 생성하는지를 확인하였다. 이와 같은 스크리닝을 마친 후, 클론을 LB 영양 배지에서 밤새동안 배양하고 다음 연구를 위하여 50%(v/v) 글리세롤에 -℃에 보관하였다.
[실시예 6]
다음은 균류의 체내 억제 능력을 분석하고자 한다.
실시예 5에서 마련한 Q8r1-96 수용균주(형질전환 균주)에 의한 세 가지 뿌리 병원균의 생장 억제를 페트리 플레이트에 설치한 감자 덱스트로즈 한천(PDA) 위에서 실시하였다. 사용한 방법은 다음을 제외하고는 Thomashow와 Weller가 설명한 것과 같다(Journal of Bacteriology 170:3499-3508 (1988). 박테리아 균주를 밤새동안 배양한 LB 영양 배지 3 ㎕를 PDA 플레이트의 표면에 떨어뜨렸다. 이 때, 플레이트 당 두 개의 점이 서로 대향하도록 하고, 플레이트 가장자리에서 약 1 ㎝ 떨어져 위치하도록 하였다. PDA 배지에서 배양한 병원균의 배지 선단으로부터 0.5 ㎝의 플러그를 플레이트 중앙에 오도록 하였다. 그리고, 플레이트를 28 ℃에서 배양하고 박테리아 콜로니와 균사체의 가장자리간의 거리를 측정하여 점수를 매겼다.
게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시(Gaeumannomyces graminis var. tritici)를 억제하기 위하여, 균사 플러그를 첨가한지 24 시간 후에 박테리아 영양 배지를 플레이트에 떨어뜨리고, 박테리아를 접종한지 5 일 후에 억제성을 측정하였다. 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG8을 억제하기 위하여, 균사 플러그를 첨가한 것과 동시에 박테리아 영양 배지를 플레이트에 떨어뜨리고 5일 후에 억제 정도를 측정하였다. 피티움 이레귤라레(Pythium irregulare)의 억제에는, 균사 플러그를 첨가하기 48 시간 전에 박테리아 영양 배지를 플레이트에 떨어뜨리고 균사체를 접종한지 2일 후에 억제 정도를 측정하였다.
결 과
실험 결과는 하기 표 5에 나타내었다. 도면의 데이터로 알 수 있는 바와 같이, 유전자 변이주 Z30-97, Z32-97, Z33-97 및 Z34-97의 억제 영역이 Q8R1-96보다 훨씬 넓었다.
표 5. 감자 덱스트로즈 한천에서 모균주 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens) Q8r1-96과 유전자 변이주 Z30-97, Z32-97, Z33-97 및 Z34-97에 의한 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시(Gaeumannomyces graminis var. tritici), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG8, 및 피티움 이레귤라레(Pythium irregulare)의 체내 억제.
억제 영역의 크기
주) 같은 문자로 이어지는 평균값은 크게 차이가 나지 않는다. P = 0.05.
[실시예 7]
다음은 온실 스크리닝 생분석을 설명하고자 한다.
(재료와 방법)
종자 처리법
봄밀(Penawawa)의 종자를 KMB(슈도모나스 종의 경우)나 NBY(바실러스 종의 경우)에서 배양한 여러 가지 농도의 박테리아 균주로 피복하여 0.5% 메틸셀룰로오스에 현탁시켰다. 박테리아 현탁액을 플레이트 전체에 고르게 분산시키고 27 ℃에서 3일 동안 배양하였다. 이렇게 해서 균주마다 세 개씩의 플레이트를 마련하였다. 박테리아 세포를 챙이 있는 원심분리관으로 긁어 넣고 40 ㎖ 멸균 증류수로 두 번 세척하였다. 박테리아 세포를 다시 0.5% 메틸셀룰로오스 15 ㎖에 현탁시키고 0.5% 메틸셀룰로오스로 10배 희석한 현탁액을 만들었다. 밀 종자 25 g를 박테리아-메틸셀룰로오스 현탁액 9 ㎖와 완전하게 섞은 후, 밤새동안 공기 건조시켰다. 각 종자에 접종한 박테리아 세포의 양은 희석 플레이트 개수로 결정하였다.
질병 억제성에 대한 온실 분석
실험관 분석(Ownley et al., Phytopathology 82:178-184 (1992); Weller et al., Plant Disease 69:710-713 (1985))을 이용하여 유전자 변이주가 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시(Gaeumannomyces graminis var. tritici (Ggt))에 의해 유발되는) 맥류마름병, (라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG8에 의해 유발되는) 라이족토이아 뿌리 부패병, 및 (피티움 이레귤라레(Pythium irregulare)를 포함하는 피티움 종에 의해 유발되는) 피티움 뿌리 부패병을 억제하는 능력을 시험하였다. 이들 세 가지 병원균을 가압멸균한 귀리에서 4주 동안 배양시켜 각각의 접종물을 마련하였다(참조: 본 발명의 인용 발명인 미국 특허 제 4,456,584). 접종물은 사용할 때까지 냉장실에 보관하였다. 분석에는 바닥에 구멍이 뚫려 있는 끝이 가는 플라스틱관(직경 2.5 ㎝, 길이 20 ㎝)을 사용하였다. 플라스틱관을 플라스틱 걸이에 걸어 놓았다. 각 플라스틱관을 솜으로 막은 후, 고운 질석으로 반을 채우고 나머지는 귀리 접종물이 있거나 없는 생토양 13 g를 채웠다. 맥류마름병과 라이족토니아 뿌리 부패병에 대한 시험을 실시하기 위하여, 토양을 1%(w/w) 신선한 귀리를 배양한 접종물(입자 크기: 0.25-0.50 ㎜)과 혼합하였다. 피티움 뿌리 부패병에 대하여 시험하기 위해서는, 토양에 피티움 이레귤라레(Pythium irregulare)가 배양된 한 개의 귀리를 넣어TEk. 그런 다음, 피티움으로 오염된 토양이 담긴 시험관에는 10 ㎖의 물을 붓고, 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시(Gaeumannomyces graminis var. tritici (Ggt)와 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG8로 오염된 각 흙이 담긴 시험관에는 메탈락실(리도밀 0.075 g/ℓ; 노르바티스, 그린보로, NC)을 함유하는 물 10 ㎖를 부었다. 물을 부은 다음, 파종하기 전에 피티움 이레귤라레와 라이족토니아 솔라니로 오염된 흙이 담긴 시험관을 48 시간 동안 실온에서 배양시켰다. 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시(Gaeumannomyces graminis var. tritici (Ggt)로 오염된 흙이 담긴 시험관은 물을 부은 후, 즉시 파종하였다. 각 시험관에 두 개의 밀 종자를 심고, 소량의 미세 질석으로 덮은 후, 피티움 시험관에는 3 ㎖의 물을 붓고, Ggt와 라이족토니아 시험관에는 메탈락실을 함유한 물을 3 ㎖ 부었다. 그런 다음, 시험관을 3일 동안 플라스틱 뚜껑으로 덮어서 토양에 발아에 필요한 수분을 보습하고, 온실에서 12 시간의 광주기로 16 ℃의 일정한 온도에서 4주 내지 5주 동안을 방치하였다. 밀의 모종이 발생한 후(3-4 일), 일주일에 두 번 시험관에 1/3 호글랜드액을 5 ㎖ 주었다. 모든 실험은 워싱턴주의 퀸시에서 얻은 퀸시 버진 토양에서 수행하였으며, 실험은 5 번 내지 6 번 수행하고, 각 반복 회수마다 5 개의 시험관을 사용하였다. 뿌리를 세척하여 배지를 제거한 후, 뿌리 질병의 정도를 검사하였다. 라이족토니아 뿌리 부패병의 정도는 감염된 뿌리의 비율로 평가하였다. 피티움 오염도는 모종의 출아와 키로 평가하였다. 그리고, 맥류마름병의 정도는 1992년에 Ownley 등이 실시한 바와 같이 0급에서 8급으로 등급을 나누어 평가하였다.
통계 분석
실험 결과를 통계 소프트웨어 SAS(SAS 연구소, 캐리, NC)를 가지고 분석하였다. 출아율은 데이터를 역사인 변환시켜 분석하였다. 맥류마름병의 질병 등급 데이터는 비변수 통계에 의하여 평가하였다. 측정치의 평균값은 P=0.05에서 피셔의 최소 유의차(LSD)로 분리하였다.
결 과
실험 결과는 하기 표 6 내지 표 10에 나타내었다. 표 6에서, 종자당 102내지 103CFU의 형질전환 균주 Z30-97, Z32-97 및 Z34-97은 같은 농도의 모균 Q8R1-96과, P. 플루오레센스(P. fluorescens) 2-79(페나진-1-카르복시산 유전자의 자원)와 두 개의 비처리 대조군에 비하여 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG-8에 오염된 밀의 뿌리 비율을 감소시켰다. 모균주 Q8r1-96은 높은 농도로 처리하였을 때에만 라이족토니아(Rhizoctonia)의 억제에 있어서 Z30-97과 Z32-97과 유사하다. 하기 표 7에 나타낸 바와 같이, 피티움(Pythium) 억제에 있어서는 102CFU/종자의 균주 Z34-97은 103CFU/종자의 모균주 Q8r1-96과 마찬가지로 효과적이다. 하기 표 8에 나타낸 바와 같이, 균주 Z34-97은 게우만노마이세스 그라미니스 변종 트리티시(Gaeumannomyces graminis var. tritici)(Ggt)를 크게 억제한다. 하기 표 5 내지 표 8에 나타낸 바와 같이, Z34-97은 이들 세 가지 뿌리 질병 모두를 억제할 수 있다.
표 6. 야생 유전자 변이 박테리아 생조절제의 종자 처리에 의한 밀의 라이족토니아(Rhizoctonia) 뿌리 부패병(Rhizoctonia solani AG-8) 억제 효과.
주)
1: 종자를 0.5% 메틸셀룰로오스로 현탁시킨 박테리아로 처리하여 종자당 표기한 수치의 개체 밀도를 얻었다.
2: 파종 후 4 주일이 지났을 때, 일반적인 라이족토니아(Rhizoctonia) 병반을 갖는 뿌리의 비율을 측정하였다.
3: 메틸셀룰로오스 처리 종자는 0.5% 메틸셀룰로오스로만 처리한 것이다. 비처리 종자를 처리하지 않은 것이다.
4: 같은 문자로 이어지는 평균값은 크게 차이가 나지 않는다(P = 0.05).
5: 본 발명에 따르지 않은 비교예이다.
6: 모균주.
표 7. 야생 유전자 변이 박테리아 생조절제의 종자 처리에 의한 밀의 피티움(Pythium) 뿌리 부패병(Pythium irregulare) 억제 효과.
주)
1: 종자를 0.5% 메틸셀룰로오스로 현탁시킨 박테리아로 처리하여 종자당 표기 수치의 개체 밀도를 얻었다.
2: 파종 후 4 주일이 지났을 때, 발아수를 측정하였다.
3: 메틸셀룰로오스 처리 종자는 0.5% 메틸셀룰로오스로만 처리한 것이다. 비처리 종자를 처리하지 않은 것이다.
4: 같은 문자로 이어지는 평균값은 크게 차이가 나지 않는다(P = 0.05).
5: 본 발명에 따르지 않은 비교예이다.
6: 모균주.
표 8. 야생 유전자 변이 박테리아 생조절제의 종자 처리에 의한 밀의 맥류마름병(Gaeumannomyces graminis var. tritici) 억제 효과.
주)
1: 종자를 0.5% 메틸셀룰로오스로 현탁시킨 박테리아로 처리하여 종자당 표기 수치의 개체 밀도를 얻었다.
2: 맥류마름병을 0에서 8까지 등급을 매겼다(Ownley et al., 1992):
0급: 질병이 나타나지 않음.
1급: 뿌리 면적의 10% 미만에 검은 병반 발생.
2급: 뿌리 면적의 10-25%에 검은 병반 발생.
3급: 뿌리 면적의 25% 이상에 검은 병반이 발생하고, 병반이 줄기 기부에 나타나는 뿌리가 한 개임.
4급: 병반이 줄기 기부에 나타나는 뿌리가 한 개 이상임.
5급: 뿌리 다섯 개 모두 병반이 줄기 기부에 나타나고, 적어도 한 개의 병반은 줄기 아래에 있지만 잎의 백화 현상은 없음.
6급: 뿌리 여섯 개에서 병반이 줄기에 나타나고, 첫 번째 본옆에 백화 현상이 있음.
7급: 모든 잎에 백화 현상이 나타나고, 식물의 발육이 부진함.
8급: 식물이 고사하였거나 거의 고사 상태임.
3: 메틸셀룰로오스 처리 종자는 0.5% 메틸셀룰로오스로만 처리한 것이다. 비처리 종자를 처리하지 않은 것이다.
4: 같은 문자로 이어지는 평균값은 크게 차이가 나지 않는다(P = 0.05).
5: 본 발명에 따르지 않은 비교예이다.
6: 모균주.
[실시예 8]
다음은 야생 균주와 유전자 변이주에 의한 밀 뿌리 군집력을 설명하기 위한 것이다.
근권 배양
상기 질병 억제 분석의 설명에서 밝힌 바와 같이 시험관 생분석을 통하여 유전자 변이주의 근권 배양을 분석할 수 있다. 103CFU/종자의 시험 균주의 박테리아 세포로 피복된 밀의 종자를 파종하였다. 파종한 지 1주일 후에, 각각 100 ㎍/㎖의 리팜피신과 사이클로헥시미드로 처리한 KMB 배지에서 희석하여 종자에 존재하는 CFU 개수를 결정하였다.
결 과
실험 결과는 표 9에 나타내었다. 표의 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 발명의 유전자 변이주는 처리 종자를 파종한 후 66시간과 일주일이 지났을 때 모균주와 같은 개체 밀도를 나타냈다.
표 9
파종 후 날짜수
주)
a: 밀 종자를 103CFU/종자의 농도로 피복하였다.
b: 피셔의 최소 유의 검정(LSD)에 따라, 다음에 이어지는 문자가 같으면 유의차가 크지 않은 것이다(P = 0.05).
[실시예 9]
다음은 생리학적 특성과 기질 이용 패턴을 설명하기 위한 것이다.
모균주 P. 플루오레센스(P. fluorescens) Q8r1-96을 P. 플루오레센스(P. fluorescens) Q2-87(항생성 2,4-디아세틸프로로글루시놀의 생성 유전자 자리를 갖는다)과 비교하였다. 균주는 베르게이의 매뉴얼에 설명된 것과 같은 P. 플루오레센스(P. fluorescens)의 특징적인 생리학적 특성과 기질 이용 패턴을 나타낸다.
표 10
[실시예 10]
이 실시예는 특징적인 띠무늬를 나타내는 형질전환주를 확인하기 위한 RAPD 분석을 설명하기 위한 것이다.
프라이머 M13을 이용하는 RAPD 분석을 실시하여 형질전환주와 모균주 Q8r1-96을 비교하였다. 희석한 열용균 세포 현탁액 5 ㎕와 1 x GeneAmp PCR 완충액(Perkin Elmer Corp., Norwalk, CT)과, dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP(Perkin Elmer) 각 200 μM과, 각 프라이머 80 pmole과 AmpliTaq DNA 폴리메라아제(Perkin Elmer) 2.0 U를 함유하는 반응 혼합물 25 ㎕로 PCR 증폭을 수행하였다. 각 혼합물에 미네랄유 한 방울을 떨어뜨렸다. 증폭은 Perkin Elmer Thermal Cycler 480에서 수행하였다. PCR 절차는 초기 변성을 94 ℃에서 1분 30초 동안 수행한 후, 94 ℃에서 30초, 36 ℃에서 30초, 72 ℃에서 2분 동안 두 번, 94 ℃에서 20초, 36 ℃에서 15초, 45 ℃에서 15초, 72 ℃에서 1분 30초 동안 40 번, 그리고 72 ℃에서 10분 동안 한 번 수행하였다. PCR 생성물의 시료 9 ㎕를 5 시간 동안에 75 V로 1 x TBE 완충액(90 mM 삼중붕산염, 2 mM EDTA (pH 8.3))에 담근 2.5% 한천 겔에서 분리시켰다. 한천 겔에 브롬화에티듐으로 60분 동안 착색하고 UV 투시기로 PCR 생성물을 가시화하였다.
프라이머 M13을 이용한 RAPD 분석을 수행한 결과, 유전자 변이주 Z32-97, Z33-97 및 Z34-97은 모균주 P. 플루오레센스(P. fluorescens) Q8r1-96과 330 ±20 bp; 600 ±50 bp; 700 ±50 bp; 800 ±50 bp; 900 ±50 bp; 및 1100 ±60 bp에서 공통적으로 밴드를 나타냈다. 유전자 변이주 Z30-97은 모균주 P. 플루오레센스(P. fluorescens) Q8r1-96과 600 ±50 bp; 700 ±50 bp; 800 ±50 bp; 및 900 ±50 bp에서 공통적으로 밴드를 나타냈다.
한편, 본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서 여러 가지 변형이 가능함은 물론이다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안되며 후술하는 특허 청구의 범위뿐만 아니라 이 특허 청구의 범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

Claims (28)

  1. 2,4-디아세틸플로로글루시놀의 생성을 암호화하는 생조절 유전자 자리를 갖는 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종균의 생물학적 순수 배양균.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종균이 그 게놈에 안정하게 도입된 페나진-1-카르복시산 생성을 암호화하는 생조절 유전자 자리를 갖는 생물학적 순수 배양균.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 프라이머 M13을 이용한 랜덤 증폭 다형성 DNA(RAPD) 분석에서 상기 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종균이 600 ±50 bp; 700 ±50 bp; 800 ±50 bp; 및 900 ±50 bp에서 밴드를 나타내는 생물학적 순수 배양균.
  4. 제 3 항에 있어서, 330 ±20 bp와 1100 ±60 bp에서 밴드를 갖는 생물학적 순수 배양균.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 균주가 밭에서 자란 소형 곡류작물이나 잔디에서 균류 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)(Gg)가 유발하는 질병을 억제하는 능력을 갖고, 상기 억제 능력이 상기 소형 곡류작물이 맥류마름병 감퇴 상태에 있는 토양에서 재배되었을 때의 생조절 수준과 같은 생물학적 순수 배양균.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 균주가 균류 라이족토니아 (Rhizoctonia)가 유발하는 식물의 뿌리 질병을 억제하는 능력을 갖는 생물학적 순수 배양균.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 균주가 균류 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)(Gg)나 피티움(Pythium)이 유발하는 식물의 뿌리 질병을 억제하는 능력을 갖는 생물학적 순수 배양균.
  8. 제 1 항 내지 제 4 항 중에서 어느 한 항에 있어서, 상기 균주가 적어도 5 번의 연속 생장 주기 동안에 관련 근권 토양을 포함하여 뿌리의 그램당 적어도 약 105콜로니 형성 단위(CFU)의 평균 개체 밀도로 뿌리 군집력을 갖는 생물학적 순수 배양균.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 균주의 뿌리 군집력이 토양의 종류에 영향을 받지 않는 생물학적 순수 배양균.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 균주가 P. 플루오레센스(P. fluorescens) NRRL B-21806, NRRL B-21807, NRRL B-21808, NRRL B-21905, NRRL B-21906, NRRL B-21907, 또는 NRRL B-21908의 확인 특성을 갖는 생물학적 순수 배양균.
  11. 제 1 항에 있어서, 농학상의 매개체를 부가적으로 포함하는 생물학적 순수 배양균.
  12. (1) (a) 적어도 3주 동안에 소형 곡류작물이나 잔디의 모종을 얻을 수 있도록 상기 식물의 생장을 돕는 데에 효과적인 조건하에 온실의 맥류마름병 감퇴 상태에 있는 토양(TAD 토양)에서 소형 곡류작물이나 잔디의 종자를 재배하고; (b) 상기 토양에서 자란 소형 곡류작물이나 잔디 모종의 생장 토양과 뿌리를 채집하여 혼합하고; 그리고 (c) 상기 단계 (a)와 (b)의 과정을 적어도 4 회의 연속 주기 동안에 반복하고, 다음 주기에 종자를 자라게 하는 데에 상기 단계 (b)의 혼합물을 사용하는 것을 포함하여, 여러 주기에 거쳐 자연발생적인 맥류마름병 억제성 토양에서 소형 곡류작물이나 잔디를 연속으로 재배하여 형광성 슈도모나스(Pseudomonas)를 증가시키는 단계;
    (2) 슈도모나스의 생장에 효과적인 조건하에 일정한 시기에 슈도모나스 선택적인 배지에서 상기 균주를 배양함으로써 단계 (1)에서 연속으로 재배한 상기 소형 곡류작물이나 잔디의 뿌리와 관련 근권 토양으로부터 잠재 억제성의 형광성 슈도모나스(Pseudomonas)의 균주를 분리하는 단계;
    (3) 상기 종균의 콜로니를 2,4-디아세틸플로로글루시놀에 특이적인 프로브와 혼성화하고 상기 프로브에 혼성화되는 균주들을 선택함으로써 단계 (2)에서 분리한 상기 균주를 스크리닝하여 2,4-디아세틸플로로글루시놀(Ph1)의 생성을 암호화하는 생합성 유전자 자리를 갖는 균주를 선택하는 단계; 및
    (4) 프라이머 M13을 이용한 랜덤 증폭 다형성 DNA(RAPD) 분석을 실시하고, 600 ±50 bp; 700 ±50 bp; 800 ±50 bp; 및 900 ±50 bp에서 밴드를 나타내는 균주를 Gg 억제성 균주로 선택하는 단계를 포함하는 제 1 항 또는 제 3 항의 특성을 갖는 종균을 선택하기 위한 박테리아 스크리닝 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, Ph1 생합성 유전자 자리를 갖는 시퀀스를 증폭하는 프라이머를 이용하여 Ph1 생성 균주를 확정하고 양성 PCR 반응을 나타내는 균주들을 선택하는 단계를 단계 (3)와 단계 (4) 사이에 부가적으로 포함하는 방법.
  14. 라이족토니아(Rhizoctonia), 피티움(Pythium), 및 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)(Gg)에 의해 유발되는 뿌리 질병에 걸리기 쉬운 식물을 제 1 항 내지 제 4 항 중에서 어느 한 항에 따른 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 배양균의 유효 생조절량의 존재하에 재배하여 상기 뿌리 질병을 억제하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 식물이 소형 곡류작물, 잔디, 식용 식물, 섬유성 식물, 또는 관상 식물로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 소형 곡류작물이나 잔디를 재배하기 전에, 상기 식물을 재배하기 위한 토양이나 경작지를 유효 Gg 생조절량의 상기 균주로 처리하는 방법.
  17. 제 14 항에 있어서, 유효 Gg 생조절량의 상기 균주와 적당한 액상 매개체를 포함하는 박테리아 처리액으로 상기 잔디를 처리하는 방법.
  18. 제 14 항에 있어서, 상기 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 균주가 NRRL B-21806, NRRL B-21807, NRRL B-21808, NRRL B-21905, NRRL B-21906, NRRL B-21907, 또는 NRRL B-21908의 확인 특성을 갖는 방법.
  19. 제 15 항에 있어서, 상기 종자가 종자당 약 102내지 106CFU의 농도를 갖는 방법.
  20. 제 17 항에 있어서, 상기 처리액이 처리액 ㎖ 당 약 108내지 1010CFU의 농도를 갖는 방법.
  21. 제 14 항에 있어서, 상기 식물의 뿌리를 현탁액 ㎖ 당 약 102내지 105CFU의 세균성 현탁액에 담그는 방법.
  22. 적당한 매개체와 유효 생조절량의 제 1 항 내지 제 4 항 중에 어느 한 항에 따른 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 균주의 생물학적 순수 배양균을 포함하고, 라이족토니아(Rhizoctonia), 피티움(Pythium), 및 게우만노마이세스 그라미니스(Gaeumannomyces graminis)(Gg)에 의해 유발되는 뿌리 질병에 걸리기 쉬운 식물에서 상기 뿌리 질병을 억제하기 위한 농업 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 매개체가 물, 완충액, 메틸셀룰로오스, 이탄, 및 질석으로 이루어진 군에서 선택되는 농업 조성물.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 균주가 액상 매개체 ㎖ 당 약 108내지 1010CFU, 또는 고체 매개체 그램당 약 107내지 109CFU의 농도를 갖는 농업 조성물.
  25. 제 22 항에 있어서, 상기 슈도모나스(Pseudomonas) 균주가 NRRL B-21806, NRRL B-21807, NRRL B-21808, NRRL B-21905, NRRL B-21906, NRRL B-21907, 또는 NRRL B-21908의 확인 특성을 갖는 P. 플루오레센스(P. fluorescens)인 농업 조성물.
  26. 유효 생조절량의 제 1 항 내지 제 3 항 중에서 어느 한 항에 따른 생물학적 순수 배양균을 처리한 소형 곡류작물의 종자.
  27. 제 26 항에 있어서, 종자당 약 102내지 105CFU의 농도를 갖는 종자.
  28. (1) 프로모터의 조절하에, 페나진-1-카르복시산의 생성을 암호화하는 페나진-1-카르복시산 유전자 자리를 포함하는 유전자를 복제하는 단계;
    (2) 상기 페나진-1-카르복시산 유전자 자리를 수용균주인 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 균주에 안정하게 삽입할 수 있는 전달 시스템에서 상기 복제된 페나진-1-카르복시산 유전자 자리의 전치 복제물을 구성하고, 상기 전달 시스템을 박테리아 공여균주에 도입하는 단계; 및
    (3) 박테리아 접합을 통하여, 상기 박테리아 공여균주로부터 상기 전달 시스템을 수용균주인 슈도모나스(Pseudomonas) 모주로 안정하게 삽입하여 페나진-1-카르복시산의 생성을 암호화하는 생합성 유전자 자리가 그 게놈에 안정하게 삽입되어 있고 2,4-디아세틸플로로글리시놀의 생성을 암호화하는 생합성 유전자 자리를 갖는 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 박테리아의 형질전환주를 얻는 단계를 포함하고,
    상기 슈도모나스(Pseudomonas) 모균주가 2,4-디아세틸플로로글리시놀의 생성을 암호화하는 생합성 유전자 자리를 갖고 프라이머 M13을 이용한 랜덤 증폭 다형성 DNA(RAPD) 분석에서 상기 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 종균이 600 ±50 bp; 700 ±50 bp; 800 ±50 bp; 및 900 ±50 bp에서 밴드를 나타내는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 또는 제 2 항의 특성을 갖는 형광성 슈도모나스(Pseudomonas) 유전자 변이주를 얻기 위한 방법.
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