KR100505789B1

KR100505789B1 - 버섯 재배지 토양으로부터 분리된 바실러스 투린지엔시스６５６－３ 균주 및 이를 함유하는 해충 방제용 조성물

Info

Publication number: KR100505789B1
Application number: KR10-2003-0003628A
Authority: KR
Inventors: 진병래; 손흥대; 최용수; 제연호
Original assignee: 진병래
Priority date: 2003-01-20
Filing date: 2003-01-20
Publication date: 2005-08-03
Also published as: KR20040066540A

Abstract

본 발명은 버섯재배지 토양으로부터 분리된 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis; 이하 '비티'라고 약칭함) 656-3 균주 및 이를 함유하는 해충 방제용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 국내 버섯재배지에서 채취한 토양으로부터 분리한 바실러스 속 균주로서, 버섯파리류 해충에 대하여 강한 살충력을 나타내는 신규한 비티 656-3 균주에 관한 것이다. 이와 같은 비티 656-3 균주는 작물의 해충을 방제하기 위한 농약제학적 성분 또는 비료 성분의 조성물로서 유용하게 이용할 수 있다.

Description

버섯 재배지 토양으로부터 분리된 바실러스 투린지엔시스 ６５６－３ 균주 및 이를 함유하는 해충 방제용 조성물 {Bacillus thuringiensis 656-3 isolated from the soil of mushroom houses and a composition for the prevention of insects containing the same}

본 발명은 버섯재배지 토양으로부터 분리된 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis; 이하 '비티'라고 약칭함) 656-3 균주 및 이를 함유하는 해충 방제용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 국내 버섯재배지에서 채취한 토양으로부터 분리한 바실러스 속 균주로서, 버섯파리류 해충에 대하여 강한 살충력을 나타내는 신규한 비티 656-3 균주에 관한 것이다.

비티는 그람 양성의 토양세균으로 농작물, 산림 및 위생해충의 방제에 유용한 생물농약으로 이용되고 있다. 비티는 성장조건이 악화되면 포자와 내독소단백질을 생산하는데, 비티의 내독소단백질은 나비목, 파리목, 딱정벌레목 등의 곤충에 강력한 독성을 나타내어 비티 균주 그 자체가 미생물 살충제로 이용되고 있다.

비티를 이용한 미생물 살충제는 이미 오래 전부터 미국을 포함한 선진국에서 연구 개발되어 상품화되었다. 우리나라에서도 이미 투리사이드(산도스사, 미국), 센타리(에보트사, 미국) 등이 수입되어 시판되고 있는 실정이다. 이외에도 다양한 비티 균주들이 미생물 살충제로 이용되고 있는데, 투린지엔시스(thuringiensis), 쿠르스타키(kurstaki), 덴드로리무스(dendrolimus), 갈레리에(galleriae), 이스라엘렌시스(israelensis), 아이자와이(aizawai), 테네브리오니스(tenebrionis) 등이 나비목, 파리목, 딱정벌레목 등의 해충의 방제에 도입되고 있다. 우리나라의 경우에도 2002년에 동부한농화학사에서 국내 토양으로부터 분리한 비티 NT0423 균주를 해충 방제용 제재로 상품화한 바 있다.

비티는 균주에 따라 몇 가지 곤충목에 대하여 특이적으로 독성을 나타내는 내독소단백질을 생산하는 특성이 있다. 내독소단백질은 보통 세포 하나당 하나의 결정을 형성하며 주로 나비목 곤충의 장내 소화액에 의해 분해되어 매우 강력한 독성을 발휘한다. 미생물 살충제로 가장 널리 이용되고 있는 비티 균주로는 쿠르스타키를 들 수 있는데, 2000년도 현재 127 품목이 미생물 살충제로 등록되어 있다. 이 비티 쿠르스타키 균주는 특히 나비목 곤충에 강한 독성을 나타내는 것으로 보고되었다(Bai et al., J. Invertebr. Pathol., vol 62, p211-215, 1993). 비티 이스라엘렌시스와 모리소니 피지-14(morrisoni PG-14)는 파리목에 속하는 모기 또는 검정파리에 높은 독성을 나타내는 내독소단백질을 생산하는 것으로 보고되었다 (Goldberg & Margalit, Mosq. News, vol 37, p355-358, 1977; Padua et al., J. Invertebr. Pathol., vol 36, p180-186, 1980).

우리나라 농가의 고소득 작목으로서 확고한 위치를 차지하고 있는 느타리버섯은 매년 재배 농가와 생산량 및 시장 규모가 급증하고 있다. 이러한 느타리버섯 재배에 있어서 큰 문제점으로 대두되고 있는 것 중의 하나로 버섯파리류 해충의 직·간접적인 피해를 들 수 있다. 우리나라 느타리버섯 재배지에서 대발생하는 주요 버섯파리류 해충으로는 리코리엘라 말리(Lycoriella mali)와 코볼디아푸시페스 (Coboldia fuscipes)를 들 수 있는데(Kim et al., Korean J. Appl. Entomol., vol 38, p41-46, 1999), 이들은 느타리버섯 재배 시설 특성상 동일장소에서 연작되며, 버섯 재배사의 환경조건이 버섯파리류 해충이 연중발생할 수 있는 호조건을 제공하기 때문에 그 발생속도가 빠르고 피해가 급증하고 있는 실정이다. 특히 중요한 것은 버섯파리류가 해충으로서 유충의 직접적인 가해뿐만 아니라 성충에 의한 느타리버섯의 주요 병해인 세균성 갈반병 및 푸른곰팡이병 등을 전염시키는 중요한 매개체로 작용하고 있다는 것이다(전창성, 농민저널 월간버섯, p56-61, 1998; 유승현, 한국버섯연구회 버섯, vol 3, p141-149, 1999).

그러나, 이와같이 버섯재배시 항상 발생하는 버섯파리류 해충에 대하여 효과적이고 적절한 방제대책이 없는 게 사실이고, 약해 문제뿐만 아니라 무공해 농산물로 잘 알려진 버섯에 적절한 화학적인 방제대책이 세워지기 힘든 형편이다. 특히, 버섯파리류 해충 방제를 위한 효과적인 비티 균주 및 미생물 살충제에 관한 보고는 아직까지 없는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 버섯파리류 해충의 방제에 효과적인 천연 미생물 살충제를 개발하기 위하여 연구한 결과, 국내 느타리 버섯 재배지에서 채취한 토양으로부터 기존에 알려진 비티 균주와는 다른 특성을 가지는 신규한 비티 656-3 균주를 분리할 수 있었으며, 상기 비티 656-3 균주의 버섯파리류 해충에 대한 강력한 살충성을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 버섯재배지 토양으로부터 분리된 신규한 비티 656-3 균주를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 비티 656-3 균주의 미생물 살충제로서의 이용가능성을 제공하는데 있다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 비티 656-3 균주를 함유하는 미생물 살충제 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 적용은 하기 발명의 상세한 설명란에 의해 당업자에게 명백하게 드러날 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기존에 알려져 있는 바실러스속 균주와는 다른 특성의 비티(Bacillus thuringiensis; 이하 '비티'라고 약칭함) 656-3 균주를 국내 버섯재배지 토양으로부터 분리하고, 이 균주의 버섯파리류 해충에 대한 강력한 살충력을 확인함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에 따른 비티 656-3 균주는 국내 버섯재배지 토양으로부터 분리된 것이다. 본 발명 비티 656-3 균주는 비티 모리소니 균주와 동일한 편모항원성을 나타낸다.

본 발명 비티 656-3 균주는 다른 종류의 비티 균주와 마찬가지로 포자와 내독소단백질을 생산한다. 본 발명 비티 656-3 균주는 비티 모리소니 피지-14 균주와 동일한 편모항원성을 나타낸다. 그러나, 비티 모리소니 피지-14의 내독소단백질이 구형인 데 비해, 본 발명 비티 656-3 균주의 내독소단백질은 뚜렷한 이중 피라미드 형의 결정체이다.

또한, 비티 모리소니 피지-14의 내독소단백질이 cry4A, 4B, 4C 및 4D의 네 종류의 내독소단백질 유전자로 구성되어 있는데 비하여, 본 발명 비티 656-3 균주는 상기 유전자 외에 추가적으로 cry1Ac 내독소단백질 유전자 부위를 더 포함하고 있는 것이 특징이다. 특히, 본 발명 비티 656-3 균주의 cry1Ac 내독소단백질 유전자는 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주의 cry1Ac 내독소단백질 유전자 서열에 있어서 제 1751번 염기 T가 C로 변이(서열목록 1의 46번 위치의 염기)된 단일염기다형성(SNP; Single Nucleotide Polymorphism) 부위이다.

본 발명에 따른 비티 656-3 균주는 버섯파리류 해충, 특히 코볼디아 푸시페스(Coboldia fuscipes)와 리코리엘라 말리(Lycoriella mali)에 대하여 강한 살충력을 나타낸다. 즉, 버섯파리류 해충에 대해 동일한 편모항원성을 보이는 모리소니 피지-14에 비하여 약 10배 이상의 강력한 살충력을 갖는다.

본 발명에 따른 비티 656-3 균주는 버섯파리류 해충을 살충하여 제거하기 위한 해충 방제용 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다. 이러한 비티 656-3 균주를 함유하는 해충 방제용 조성물은 비티 656-3 균주의 포자(spore) 또는 내독소단백질(endotoxin)을 포함한다. 이때의 농도는 사용목적 또는 용도에 알맞은 농도로 적의 선정하여 사용할 수 있다. 또한, 비티 656-3 균주는 본 발명 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 미생물 살충제의 제조방법 또는 미생물 살충제의 이용방법에 따라 이용할 수 있다. 예를 들면, 비티 656-3 균주를 배양한 배양액을 직접 조성물에 첨가한 다음 이를 작물에 직접 살포하는 방식으로 이용될 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 비티 656-3 균주를 함유하는 해충 방제용 조성물은 버섯 등의 작물 재배시 살포하는 비료 제형 또는 농약제학적 제형의 성분 조성물로서 이용될 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예 및 시험예를 들어 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

〔실시예 1〕비티 656-3 균주의 분리

이미 보고된 오바와 아이자와의 방법 등(Ohba & Aizawa, J. Invertebr. Pathol., vol 32, p303-309, 1978; Park et al., Korean J. Appl. Microbiol. Biotechnol., vol 25, p159-165, 1997)에 따라 비티 균주의 분리를 수행하였다.

대한민국 경상남도 김해시의 느타리버섯 재배지에서 채취한 토양시료 1 g을 멸균 증류수 10 ㎖에 현탁한 다음 5분 동안 강하게 섞어 주었다. 현탁된 시료를 80 ℃에서 10분간 열처리한 다음 1,000 배로 희석하여 영양평판배지(nutrient agar plate) 위에 도말한 후 30 ℃에서 5일 동안 배양하였다. 생성된 콜로니를 위상차현미경으로 관찰하여 포자와 내독소단백질을 형성하는 비티 균주를 선발하였다.

선발된 비티 균주를 하기 실시예서와 같이 편모항원성에 따라 동정하고 특성을 밝힌 후, 바실러스 투린지엔시스 656-3(Bacillus thuringiensis, 이하 '비티 656-3'라 함)이라 명명하고 농촌진흥청 농업생명공학연구원 유전자은행에 2002년 9월 6일자로 기탁번호 제 KACC 91009호로 기탁하였다.

〔실시예 2〕비티 656-3 균주의 편모항원성 검정

상기 실시예 1에서 분리한 비티 656-3 균주를 일차적으로 분류하기 위하여, 33개의 비티 편모항체에 대한 편모항원성을 오바와 아이자와의 방법(Ohba & Aizawa, J. Invertebr. Pathol., vol 32, p303-309, 1978)에 따라 검정하였다.

비티 656-3 균주를 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물 및 1% 염화나트륨)에 접종하고 30 ℃, 100 rpm으로 16시간 동안 배양한 후, 이 배양액에 멸균된 증류수로 100 배 희석된 비티 편모항체 희석액(서울대학교 농생대 곤충병리유전공학연구실로부터 분양; Roh et al., Lett. Appl. Microbiol., vol 23, p249-252, 1996)을 동량으로 가하고 37 ℃에서 1시간 동안 반응시키고 응집 반응 여부를 조사하였다.

그 결과는 하기 표 1과 같다. 표 1에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 비티 656-3 균주는 비티 모리소니 균주와 편모응집 반응을 나타내어 동일한 편모항원성을 가지고 있는 것으로 동정되었다.

편모 항원성	아종	응집 반응
1	thuringiensis	-
2	finitimus	-
3a, 3c	alesti	-
3a, 3b, 3c	kurstaki	-
3a, 3d	sumiyoshiensis	-
3a, 3d, 3e	fukuokaensis	-
-4a, 4b	sotto	-
-4a, 4c	kenyae	-
5a, 5b	galleriae	-
6	entomocidus	-
7	aizawai	-
8a, 8b	*morrisoni*	+
8a, 8c	ostriniae	-
8b, 8d	nigeriensis	-
9	tolworthi	-
10a, 10b	darmstadiensis	-
11a, 11b	toumpsoni	-
11a, 11c	kyushuensis	-
12	thompsoni	-
13	pakistani	-
14	israelensis	-
15	dakota	-
16	indiana	-
17	tohokuensis	-
18a, 18b	kumamotoensis	-
19	tochigiensis	-
20a, 20b	yunnanensis	-
20a, 20c	pondicheriensis	-
21	colmeri	-
22	shangdongiensis	-
23	japonensis	-
24a, 24b	neoleonensis	-
25	coreanensis	-
26	silo	-
27	mexicanensis	-

〔실시예 3〕비티 656-3 균주의 내독소단백질 관찰

상기 실시예 1에서 분리된 비티 656-3 균주의 포자와 내독소단백질을 위상차현미경과 투과전자현미경으로 관찰하였다.

위상차현미경 관찰을 위하여, 비티 656-3 균주의 단일 콜로니를 100 ㎖의 GYS 배지(0.1% 글루코스, 0.2% 효모 추출물, 0.05% 인산제일칼륨, 0.2% 황산암모늄, 0.002% 황산마그네슘, 0.005% 황산망간, 0.008% 염화칼슘)에 접종하고 30 ℃, 150 rpm으로 진탕배양하여 시료로 사용하였다(Nickerson et al., Appl. Environ. Microbiol., vol 28, p124-128, 1974). 멸균된 증류수로 현탁된 시료를 슬라이드 글라스 위에 떨어뜨린 후 커버글라스를 덮고 에멀젼 오일(emulsion oil) 처리하여 위상차현미경(Nikon Optiphot-2)에서 1,000 배의 배율로 관찰하였다.

투과전자현미경(Phillips SEM 515) 관찰을 위하여, 비티 656-3 균주를 상기 GYS 배지에서 5일 동안 배양하여 침전시킨 침전물을 시료로 사용하였다. 상기 비티 656-3 균주의 침전물을 0.01% 트리톤 엑스-100(Triton X-100)을 포함하는 1 M 염화나트륨 용액으로 3회 세척한 다음 초음파 교반기를 사용하여 교반한 후, 67%, 72%, 79%, 87% 농도의 설탕 불연속 밀도 구배에 가하고 4 ℃, 80,000×g에서 14시간 동안 초원심분리하였다. 79%와 87% 설탕 농도에서 형성된 내독소단백질층을 회수하고 3회 이상 증류수로 세척하여 설탕을 제거한 후, 내독소단백질 침전물을 회수하였다. 회수한 침전물을 250 ㎕의 아가(agar)에 넣어 잘 풀어준 뒤, 3% 글루타알데히드(glutaraldehyde)로 고정하고, 0.5% 소디움 카코딜레이트(sodium cacodylate) 완충액으로 세척한 후, 동 완충액으로 만든 1% 오스미움 테트옥사이드 (osmium tetoxide)로 2차 고정하였다. 그 다음, 50%, 70%, 90%, 100%의 에탄올 및 100% 아세톤으로 탈수하여 Epon 수지(Epon812)에 포매하고 LKB-Ultratome(MT-5000)으로 초박절편을 만들어 7% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)와 0.1% 리드 사이트레이트(lead citrate)로 염색하여 투과전자현미경(Hitachi HU-II)으로 관찰하였다.

그 결과를 각각 도 1 및 도 2에 나타내었다. 도 1은 비티 656-3 균주의 위상차현미경 관찰 사진으로, A는 자가분해(autolysis) 전, B는 자가분해 후의 사진이다. 도 1에서 포자는 S로, 내독소단백질은 C로 표시하였다.

도 2는 비티 656-3 균주의 투과전자현미경 관찰 사진으로, 도 1에서와 마찬가지로 C는 내독소단백질을 나타낸다. 도 2를 통하여, 비티 656-3 균주 유래의 내독소단백질은 뚜렷한 이중 피라미드형의 결정체임을 알 수 있다. 이러한 비티 656-3 균주의 내독소단백질의 형태는 상기 실시예 2에서 동일 편모항원성을 보이는 것으로 밝혀진 비티 모리소니 피지-14의 구형의 내독소단백질과 뚜렷하게 구분되는 것이다.

〔실시예 4〕비티 656-3 균주의 내독소단백질의 전기영동 분석

상기 실시예 3에서 분리된 내독소단백질을 전기영동(SDS-PAGE) 방법으로 분석하였다(Laemmli, Nature, vol 227, p680-685, 1970).

준비된 비티 656-3 균주의 내독소단백질 시료 일정량에 2배의 시료 완충용액 [1 M Tris-HCl (pH 6.8) 0.6 ㎖, 50% 글리세롤 5 ㎖, 10% SDS 2 ㎖, 2-머캅토에탄올 0.5 ㎖, 1% 브로모페놀 블루 1 ㎖, 증류수 0.9 ㎖]을 가하고, 100 ℃에서 5분간 끓인 후 상등액을 10% SDS-전기영동하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 레인 M은 단백질 표준분자량 표지, 레인 1은 모리소니 피지-14 균주의 내독소단백질, 레인 2는 비티 656-3 균주의 내독소단백질의 전기영동 결과를 나타낸다. 이상과 같은 내독소단백질의 SDS-전기영동 결과에서 비티 656-3 균주는 모리소니 피지-14와 유사한 패턴을 나타내고 있다. 따라서, 내독소단백질 구성에는 큰 차이가 없음을 알 수 있다.

〔실시예 5〕비티 656-3 균주의 플라스미드 분석

개량된 알칼리 용해 방법(Birnboim et al., Nucleic Acids Res., vol 7, p1513-1523, 1979)에 따라 비티 656-3 균주와 모리소니 피지-14 균주로부터 플라스미드 DNA를 추출하였다.

비티 균주를 LB 배지 50 ㎖에 접종하고 27 ℃에서 12시간 동안 배양한 후, 이 배양액 2.5 ㎖을 SPY 배지(0.2% 황산암모늄, 1.4% 인산제일칼륨, 0.6% 인산제이칼륨, 0.1% 구연산 나트륨, 0.2% 황산마그네슘, 0.1% 효모 추출물, 0.1% 포도당) 250 ㎖에 다시 접종하고, 27 ℃에서 600 nm에서의 흡광도 값이 0.7이 될 때까지 배양하였다. 배양 후, 배양액을 5,000 ×g에서 5분간 원심분리하여 균체를 수거하고, 여기에 용액 I[50 mM 글루코오스, 25 mM Tris-HCl(pH 8.0), 10 mM EDTA] 10 ㎖을 가하고 잘 섞었다. 여기에 라이소자임(lysozyme, Sigma 사 구입)을 최종농도 50 ㎎/㎖로 가하여 혼합한 후 실온에서 20분간 정치하였다. 사용 직전에 제조한 용액 Ⅱ(0.2 N 수산화나트륨, 1% SDS) 20 ㎖을 첨가하여 용액을 균질화시킨 다음 얼음 속에서 10분간 정치하였다. 여기에 용액 Ⅲ(5 M 초산 칼륨 60 ㎖, 빙초산 11.5 ㎖, 멸균 증류수 28.5 ㎖)를 15 ㎖ 가하고 천천히 혼합하여 10분간 정치한 다음, 상온에서 10,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 원심분리한 상등액에 2배 부피의 99% 에탄올을 가하고 -70 ℃에서 20분간 정치시킨 뒤, 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 침전물을 얻고 건조시켰다. 건조된 침전물에 TE 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) 8 ㎖을 가하고 잘 녹인 후, RNase A(Sigma 사 구입)를 최종농도 10 ㎍/㎖로 첨가하고 37 ℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액에 페놀 용액을 처리하여 단백질을 제거하고, 상등액에 클로로포름(chloroform)과 이소아밀알콜(isoamylalcohol)이 24:1로 혼합된 용액을 동량으로 처리하고 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이 상등액에 두배 부피의 99% 에탄올을 가하고 -70 ℃에서 20분간 정치한 후, 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하였다. 침전물을 70% 에탄올로 3회 세척한 후 건조시켰다. 침전물에 TE 완충액 100 ㎕를 가하고 잘 녹인 후, 260 nm에서 흡광도를 측정하여 플라스미드 DNA의 순수도와 농도를 측정하였다. 각 플라스미드 DNA 1 ㎍을 0.7% 아가로스겔 전기영동으로 분석하여 플라스미드 DNA의 패턴을 관찰하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 레인 M은 람다(Lambda) DNA를 HindIII 제한효소로 절단한 DNA 마커(marker), 레인 2는 비티 모리소니 피지-14 균주의 플라스미드 패턴, 레인 2는 비티 656-3 균주의 플라스미드 패턴을 각각 나타낸다. 도 4에 나타난 바와 같이, 비티 656-3 균주의 플라스미드 패턴은 상기 실시예 2에서 입증된 바와 같이 본 발명에 따른 비티 656-3 균주와 동일한 편모항원성을 보이는 비티 모리소니 피지-14 균주의 경우와 고분자량의 플라스미드 DNA 구성은 상당히 유사하였으나, 저분자량의 플라스미드 DNA 패턴에서는 차이를 나타내었다.

〔실시예 6〕비티 656-3 균주의 내독소단백질 유전자 조성 분석

비티 656-3 균주 유래의 비티 내독소단백질 유전자의 조성을 PCR 방법을 통하여 분석하였다. PCR 방법은 비티 균주 내에 독성을 결정하는 내독소단백질 유전자를 확인하는 방법으로, 현재 가장 용이하게 사용되고 있는 방법이다. 아울러, 비티의 내독소단백질 유전자 조성에 따라 유사 균주간의 분류 및 동정에도 이용되고 있다.

비티 내독소단백질의 유전자형을 결정하기 위한 PCR 프라이머(primer)로는 지금까지 밝혀진 내독소단백질 유전자 cry1, 2, 3, 4, 5에 이르는 모든 유전자형의 프라이머(Chang et al., Lett. Appl. Microbiol., vol 26, p387-390, 1998)를 사용하여 PCR을 실시하였다(표 2). 표 2의 각 프라이머들은 해당 내독소단백질 유전자의 보존영역(conserved region)으로 다른 유전자와 구별되는 영역을 나타낸다. PCR을 위한 비티 시료를 준비하기 위하여, 균주를 영양평판 배지에 접종한 후, 30 ℃에서 12∼18시간 동안 배양하여 생성된 콜로니를 100 ㎕의 멸균 증류수가 들어 있는 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 옮기고 10분간 끓여서 비티를 용해시켰다. 그 다음, 10,000 rpm에서 10초간 원심분리하여 얻어진 상층액을 새로운 튜브에 옮겨서 PCR 시료로 4 ℃에 보관하면서 사용하였다. PCR은 Pre-Mix(Bioneer 사 구입, 한국 소재)에 비티 플라스미드 시료와 각 프라이머 0.1∼0.5 ??M을 넣은 다음 DNA Thermal Cycler(Bioneer 사)로 94 ℃에서 1분, 45 ℃에서 1분 그리고 72 ℃에서 1분씩 35회 반복조건을 설정하여 수행하였다.

내독소단백질 유전자 (cry)	프라이머	PCR 산물 크기 (bp)
cry1Aa cry1Ab cry1Ac cry1B cry1C cry1D cry1E cry1F cry13'	5'GAGCCAAGCGACTGGAGCAGTTTACACC 5'TCGAATTGAATTTGTTCC 5'TCACTTCCCATCGACATCTACC 5'GTCCAACCTTATGAGTCACCTGGGCTTC 5'CAACCCTATTTGGTGCAGGTTC 5'GGTACATTTAGATGTTCACAGCCAC 5'CTTAGGGATAAATGTAAGTACAG 5'CCGGTGACCCATTAACATTCCAATC 5'ATCACTGAGTCGCTTCGCATCTTTGACTTTCTC	782238487902288465961383-
cry1G5' cry1G3'	5'ATATGGAGTGAATAGGGGG 5'TGAACGGCGATTACATGC	235
cry25' cry23' cry3ABD5' cry3A3' cry3B3' cry3D3' cry3C5' cry3uni3'	5'CAGATACCCTTGCTGGTGTAA 5'ATAGGCCCGTGCTCCACCAGG 5'CCGAACAATCGAAGTGAA 5'ATAGATGGTCCTACT 5'ATTGTTGAACGGCAACAA 5'ATTGTTGACGGCAACAA 5'CCTGAAAATTGCAGGCC 5'AATTGATCAATAGAATC	1073 -1964135911351074
cry4A5' cry4A3' cry4B5' cry4B3' cry4B5' cry4B3' cry4C5' cry4C3' cry4D5' cry4D3'	5'CGAGGTGAATTTGCTCC 5'ATGGCTTGTTTCGCTACATC 5'GGTGCTTCCTATTCTTTGGC 5'TGACCAGGTCCCTTGATTAC 5'GGTGCTTCCTATTCTTTGGC 5'TGACCAGGTCCCTTGATTAC 5'ATGAATCCATATCAAAATAAG 5'AAGAACTTTGTTTTAATTAAC 5'ATGGAGATAGTTCTTTAGAT 5'CTACTTTAGTAACGGATT	1032 2610 1393 2040 1932
cry55' cry53'	5'ATGAAACTAAAGAATCAA 5'GGTAGATTTTAATTCTAC	2174

그 결과는 도 5와 같다. 도 5에서 레인 M은 DNA 표준 마커로서 1 kb DNA ladder이다. 레인 1은 cry1Ac 프라이머를 이용한 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주의 내독소단백질 유전자 PCR 산물이고, 레인 2는 비티 656-3 균주의 내독소단백질 유전자 PCR 산물로, 그 크기는 두 균주 모두 487 bp이다. 레인 3은 cry4A 프라이머를 이용한 모리소니 피지-14 균주의 내독소단백질 유전자 PCR 산물이고, 레인 4는 비티 656-3 균주의 내독소단백질 유전자 PCR 산물로 공히 1032 bp를 나타낸다. 레인 5는 cry4B 프라이머를 이용한 모리소니 피지-14 균주의 내독소단백질 유전자 PCR 산물이고, 레인 6은 비티 656-3 균주의 내독소단백질 유전자 PCR 산물로 공히 2610 bp를 나타낸다. 레인 7은 cry4B 내독소유전자의 종류가 다른 프라이머를 이용한 모리소니 피지-14 균주의 내독소단백질 유전자 PCR 산물이고, 레인 8은 비티 656-3 균주의 내독소단백질 유전자 PCR 산물로 공히 1390 bp 크기를 나타낸다. 레인 9는 cry4C 프라이머를 이용한 모리소니 피지-14 균주의 내독소단백질 유전자 PCR 산물이고, 레인 10은 비티 656-3 균주의 내독소단백질 유전자 PCR 산물로 공히 2040 bp를 나타낸다. 레인 11은 cry4D 프라이머를 이용한 모리소니 피지-14 균주의 내독소단백질 유전자 PCR 산물이고, 레인 12는 비티 656-3 균주의 내독소단백질 유전자 PCR 산물로 공히 1932 bp를 나타낸다.

도 5에서 확인하는 바와 같이, 실시예 2를 통하여 본 발명에 따른 비티 656-3 균주와 동일 편모항원성을 가지고 있는 것으로 밝혀진 대조균주 비티 모리소니 피지-14 균주는 이미 알려진 바와 같이 cry4A, 4B, 4C, 4D의 네 내독소단백질 유전자로 구성되어 있었다. 이에 대하여, 본 발명 비티 656-3 균주는 모리소니 피지-14 균주와 동일하게 cry4A, 4B, 4C, 4D 타입의 내독소단백질 유전자를 함유할 뿐만 아니라 추가로 cry1Ac 내독소단백질 유전자를 가지고 있었다. 즉, 비티 656-3 균주로부터의 cry1Ac 내독소단백질 유전자를 확인하기 위하여, cry1Ac 내독소단백질 유전자를 함유하는 대조균주로 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주와 함께 PCR 분석을 수행한 결과, 도 5의 레인 1과 2에서 보여지는 것처럼 동일한 크기의 487 bp 밴드가 확인되었다.

비티 656-3 균주로부터의 cry1Ac 내독소단백질 유전자를 보다 구체적으로 확인하기 위하여, 상기 도 5의 레인 2의 PCR 산물을 DNA 염기서열 분석을 통하여 그 서열을 결정하였다. 염기서열 분석은 자동염기서열 분석 장치(model 310 Genetic analyzer; Perkin-Elmer Applied Biosystems 사)에 의해 수행하였다.

그 염기서열 분석 결과를 도 6 및 서열목록 1에 나타내었다. 비티 656-3 균주로부터의 cry1Ac 내독소단백질 유전자 PCR 산물의 염기서열과 대조균주인 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주의 cry1Ac 내독소단백질 유전자의 해당부위를 비교하였다. 그 결과, 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주의 cry1Ac 내독소단백질 유전자의 1751번 염기서열 T가 비티 656-3 균주의 cry1Ac 내독소단백질 유전자에서는 C로 변이(서열목록 1의 46번 위치)가 일어났다. 그러나, 아미노산의 치환은 일어나지 않았다.

이상의 결과에 따라, 비티 656-3 균주 유래의 내독소단백질 유전자 조성은 기존에 보고되어 있는 비티 모리소니 피지-14 균주의 유전자 조성에 cry1Ac 유전자가 부가되어 있는 형태이고, cry1Ac 유전자는 그 서열상 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주의 cry1Ac 유전자의 1751번 염기서열 T가 C로 변이된 단일염기다형성(SNP) 서열임을 알 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 비티 656-3 균주는 기존의 비티 균주에서는 볼 수 없는 새로운 형태의 조성을 갖는 새로운 균주임을 확인하였다.

〔시험예〕비티 656-3 균주의 살충효과

본 발명에 따른 비티 656-3 균주의 살충성을 버섯파리류 해충인 코볼디아 푸시페스(Coboldia fuscipes)와 리코리엘라 말리(Lycoriella mali)에 대하여 검정하였다.

비티 656-3 균주를 GYS 배지에 접종하여 포자와 내독소단백질이 형성되고 자가분해(autolysis)될 때까지 30 ℃에서 5일간 배양하였다. 배양액을 수거한 후 포자의 농도가 10⁷ spore/㎖가 되도록 희석하고, 이 접종원을 15일 동안 배양된 팽이버섯 균사가 자라고 있는 PDA(potato dextrose agar) 배지를 1 ㎝ ×1 ㎝ 크기로 잘라 그 위에 도말하였다. 버섯파리류 해충인 코볼리아 푸시페스와 리코리엘라 말리 유충 20마리를 처리구에 각각 3회 반복하여 접종하고, 24 ℃에서 사육하면서 24시간 동안 치사율을 각각 조사하였다. 대조구로는 동일 농도의 비티 모리소니 피지-14 균주와 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주 및 무처리구를 함께 검정하였다.

그 결과는 하기 표 3과 같다.

비티 균주	코볼디아 푸시페스		리코리엘라 말리
비티 균주	독성 (LC₅₀)^a	Limits^b	독성 (LC₅₀)^a	Limits^b
비티 모리소니 피지-14	1.29	0.80-2.09	5.21	3.90-13.89
비티 656-3	0.12	0.063-0.19	0.49	0.25-1.26
비티 쿠르스타키 에이치디-1	ND^c	ND^c	ND^c	ND^c
^a50% lethal concentration (×10¹⁰ CFU/㎖). ^bConfidence limit. ^cNot detected.

표 2에 나타난 바와 같이, 버섯파리류 해충에 대한 살충성 검정 결과 비티 656-3 균주의 10¹⁰ CFU/㎖ 농도에서의 LC₅₀ 값은 동일 편모항원성을 보이는 모리소니 피지-14에 비해 코볼디아 푸시페스의 경우에서는 약 10.8배, 리코리엘러 말리의 경우에서는 약 10.6배 정도 낮게 나타났다. 이는 버섯파리류 해충에 대해 동일 편모항원성을 보이는 모리소니 피지-14보다 비티 656-3 균주가 10배 이상의 강력한 살충성을 나타낸다는 것을 보여주는 결과이다. 한편, 비티 쿠르스타키 에이치디-1은 본 실시예의 버섯파리류 해충에 대해 독성을 나타내지 않았다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 비티 656-3 균주는 비티 모리소니 피지-14 균주와 동일한 편모항원성을 가지면서, 내독소단백질 유전자 구성상 비티 모리소니 피지-14 균주의 내독소단백질 유전자 타입인 cry4A, 4B, 4C 및 4D를 포함할 뿐만 아니라, 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주의 내독소단백질 유전자 타입인 cry1Ac의 유전자 서열에서 1775번 염기가 단일변이한 내독소단백질 유전자 타입을 더 포함하는 전혀 새로운 균주로써, 버섯파리류 해충, 특히 코볼디아 푸시페스(Coboldia fuscipes)와 리코리엘라 말리(Lycoriella mali)에 대하여 강한 살충력을 보이는 뛰어난 효과가 있으므로, 무공해성 해충 방제용 제재의 개발 등에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 비티 656-3 균주의 자가분해(autolysis) 전(A)과 후(B)의 모습을 위상차현미경으로 관찰한 사진이다.

도 2는 비티 656-3 균주 유래 내독소단백질의 투과전자현미경 사진이다.

도 3은 비티 656-3 균주 및 비티 모리소니 피지-14 균주 유래 내독소단백질의 SDS-PAGE 전기영동 사진이다.

도 4는 비티 656-3 균주 및 비티 모리소니 피지-14 균주의 플라스미드 패턴을 나타내는 아가로스 겔 전기영동 사진이다.

도 5는 비티 656-3 균주, 비티 쿠르스타키 에이치디-1 균주 및 비티 모리소니 피지-14 균주의 내독소단백질 유전자 조성을 각각의 프라이머를 이용한 PCR을 통하여 확인한 아가로스 겔 전기영동 사진이다.

도 6은 비티 656-3 균주 유래의 cry1Ac 내독소단백질 유전자 보전영역(487 bp)의 염기서열을 나타낸다.

<110> JIN, Byung-Rae <120> Bacillus thuringiensis 656-3 isolated from the soil of mushroom houses and a composition for the prevention of insects containing the same <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 487 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis 656-3 <400> 1 tcacttccca tcgacatcta ccagatatcg agttcgtgta cggtacgctt ctgtaacccc 60 gattcacctc aacgttaatt ggggtaattc atccattttt tccaatacag taccagctac 120 agctacgtca ttagataatc tacaatcaag tgattttggt tattttgaaa gtgccaatgt 180 ttttacatct tcattaggta atatagtagg tgttagaaat tttagtggga ctgcaggagt 240 gataatagac agatttgaat ttattccagt tactgcaaca ctcgaggctg aatataatct 300 ggaaagagcg cagaaggcgg tgaatgcgct gtttacgtct acaaaccaac tagggctaaa 360 aacaaatgta acggattatc atattgatca agtgtccaat ttagttacgt atttatcgga 420 tgaattttgt ctggatgaaa agcgagaatt gtccgagaaa gtcaaacatg cgaagcgact 480 cagtgat 487

Claims

버섯재배지 토양으로부터 분리된 바실러스 투린지엔시스 656-3 (Bacillus thuringiensis 656-3) 균주 (KACC 91009).
제 1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 균주임을 특징으로 하는 바실러스 투린지엔시스 656-3 균주.
바실러스 투린지엔시스 656-3 균주 (KACC 91009)를 함유함을 특징으로 하는 해충 방제용 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 조성물은 바실러스 투린지엔시스 656-3 균주의 포자또는 내독소단백질을 함유함을 특징으로 하는 해충 방제용 조성물.
제 3항 또는 제 4항에 있어서, 상기 해충은 버섯파리류 해충인 것을 특징으로 하는 해충 방제용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 해충 방제용 조성물은 비료 제형 또는 농약제학적 제형의 성분 조성물임을 특징으로 하는 해충 방제용 조성물.
바실러스 투린지엔시스 656-3 균주 (KACC 91009)를 농작물에 살포하거나 또는 농작물을 경작하는 토양에 첨가하는 것을 특징으로 하는 해충 방제 방법.
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