JPH02503510A - アセテート選択バチルス・ツリンギエンシスおよび使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アセテート選択バチルス・ツリンギエンシスおよび使用法 技術分野 本発明は、新規の生物学的殺虫剤に関する。より詳細には、本発明は、鱗翅目の 昆虫種、特にトリコブルシア・−＝−（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）、「 イラクサキンウワバ」およびアルトゲイア・ラバエ（Ａｒｔｏｇｅｌａ　ｒａｐ ａｅ）、「モンシロチョウの幼虫」を制御するための生物学的殺虫剤としてのバ チルスツリンギエンシス（ＢａｃｉｌｌｕｓＴｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、「 Ｂ、ツリンギエンシス」の新規菌株、その製法およびその使用法に関する。

背景技術 微生物Ｂ、ツリンギエンシスを形成する胞子は、８０年以上前に単離され且つそ れ以来生物学的制御用に商業上有名になっている。Ｂ、ツリンギエンシスの胞子 形成細胞は、各々胞子（内性胞子）およびダイヤモンド状タンパク質結晶（バラ 胞子または封入体）を産生ずる。殺昆虫性は、単にバラ胞子結晶の主成分である δ−内毒素に帰着している。結晶が昆虫の消化管中で溶解する時には、タンパク 分解消化によって活性化されるプロトキシンを生ずる。

鱗翅類の昆虫および成る蝿および蚊に全く特異性であるが、Ｂ、ツリンギエンシ スは、非感受性口の昆虫、動物およびヒトに無害である。現在米国においては、 Ｂ。

ツリンギエンシス・パル・クルスタキ（ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｖａｒ　ｋ ｕｒｓｔａｋｉ）は、これらの害虫の制御のために最も広く使用されているＢ、 ツリンギエンシス殺虫物を構成する。しかしながら、これらの殺虫物は、応用の 経済的水準での有効な制御を欠いている。

一方、合成ビレトロイドは、鱗翅類の害虫の制御のために最も広く使用されてい る化学殺虫剤である。ビレトロイドは、高度に有効であり且つ現在使用されてい るＢ。

ツリンギエンシス殺生物以上の増大された制御を提供する。しかしながら、ビレ トロイドの使用に関連づけられる不利な特徴は、ビレトロイドが標的ではない無 を推動物に毒性であり、それによって水生生物に対して環境問題を提示するとい う事実にある。従って、環境上安全でコスト上有効であり且つ合成ビレトロイド の効能に比肩する有効な鱗翅類活性殺虫剤のニーズが存在する。

発明の開示 本発明の目的は、鱗翅目の昆虫の生物学的制御に高度に有効である微生物、Ｂ、 ツリンギエンシスの新規の菌株を提供することにある。

本発明の別の目的は、合成ビレトロイドに等しいか従来使用されているＢ、ツリ ンギエンシス殺虫物よりも大きい毒素生成活性を有するＢ、ツリンギエンシスの 新規の菌株を提供することにある。

なお別の目的は、イラクサキンウワバおよびモンシロチョウの幼虫を生物学的に 制御する方法を提供することにある。

Ｂ、ツリンギエンシスの新規の菌株の生育可能な培養物は、イリノイ州ベオリア ６１６０４のＵ、Ｓ、デパートメント・オブ・アグリカルチャーのノーザン・レ ジョナル・リサーチ・センターに培養物捕集で寄託されており且つそれらの受入 れ番号はＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１９５、ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１９６、およびＮ ＲＲＬＢ−１８１９７である。これらの菌株の子孫は、３７ＣＦＲ１，１４およ び３５ＵＳＣ１２２で権利を与えるべきコミッショナー・オブ・パテンツ・エン ド・トレードマークスによって決定されるものに特許出願の係属時に入手できる であろう。これらの菌株の子孫の公衆への入手性についてのすべての制限は、菌 株が主題である特許の認可時に最終的に除去されるであろう。

新規の菌株は、環境上単離されたＢ、ツリンギエンシスの胞子形成性結晶形成性 突然変異菌株であり且つ毒性タンパク質からなるパイピラミッド状結晶を製造す る能力を有し且つ成長、胞子形成および結晶製造のためにロイシン／バリンアミ ノ酸複合体を必要とする栄養素要求性を有する点で独特である。対照的に、Ｂ、 ツリンギエンシスの従来観察された菌株は、アミノ酸なしで満足できる栄養素要 求性を示していた。Ｋ、Ｗ、ニツカーソン等、Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ 、２旦：１２４−１２８（１９７４）。

発明を実施するための最良の形態 本発明の目的で、「栄養素要求性」なる用語は、微生物の成長、胞子形成および 結晶製造に必要な栄養要件を意味するとここでは定義される。

「複雑なアミノ酸培地」なる句は、２種以上のアミノ酸の組み合わせからなる培 地を示すとここでは定義される。

新規の菌株ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１９５、ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１９６およびＮ ＲＲＬ　　Ｂ−１８１９７は、非古典的酢酸ナトリウムー熱選択法を使用して土 壌から発生する。この方法によれば、水性栄養培地は、酢酸ナトリウムで約０． ２５Ｍに緩衝して、環境土壌試料に存在する望ましくない胞子形成生物の発芽の みを可能にする。

次いで、試料中の植生胞子形成生物および非胞子形成生物は、熱処理によって殺 す。その後、生き残っている胞子は、好適な寒天培地上にプレート化し、成長さ せて本発明の新規の菌株を得る。特定の理論によって限定されるものではないが 、本発明の新規の菌株は、酢酸ナトリウムおよび熱の逐次処理での天然産４．ツ リンギエンシス菌株の突然変異生成の結果として選択プロセス時に産生されると 信じられる。

選択法の例は、次の通りである：土壌０，５ｇを１２５ｍ１の邪魔板付きフラス コ中のＬ−ブイヨン１０ｍ１（Ｈ２０１００ｍｌ、トリプトン１ｇ：酵母抽出物 ０．５ｇ、、ＮａＣ１０，５ｇ）に加えた。Ｌ−ブイヨンを酢酸ナトリウムで０ ．２５Ｍに緩衝した。混合物を２５Ｏｒｐｍで３０℃において４時間振とうした 。次いで、流通殺菌熱処理機を使用して、混合物を８０℃で３分間加熱した。熱 処理された混合物をＬ−寒天（寒天１．５％で凝固されたし一ブイヨン）上にプ レート化し、３０℃で一晩中（１６時間）培養した。

菌株ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１９５、ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１９６およびＮＲＲＬ 　　Ｂ−１８１９７は、下記特性を有する：コロニーは円形であり、金縁であり 、凸状であり且つクリーム色であり、２４時間後の栄養寒天上のコロニー直径は ２７ｍ＋ｓである。栄養細胞は、１μｍ〜１．２μｍＸ３μｍ〜５μｍの好気性 グラム陽性運動性ロッドである。栄養細胞の末端胞子は、胞子層を膨張せず且つ 栄養ロッドの３３％〜５０％である。細胞は、カタラーゼ陽性であり、グルコー スを発酵し、カゼインを加水分解するが、従来観察さｄたＢ、ツリンギエンシス 菌株の中毒説明と異なり、本発明の菌株は、サイトレートを利用しない。また、 新規の菌株は、マンニトール、アラビノースおよびキシロースを発酵しない。

更に、菌株ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１９５は、デンプンを加水分解し、スクロース を発酵し、レシチナーゼを生成した。細胞は、ニスキュリンを利用せず、ウレア ーゼを生成せず且つサリシンおよびマンノースを発酵した。菌株ＮＲＲＬ　　Ｂ −１８１９６は、デンプンを加水分解し、サリシン、マンノースおよびスクロー スを発酵した。細胞は、ニスキュリンを利用せず、ウレアーゼまたはレシチナー ゼを生成しなかった。菌株ＮＲＲＬＢ−１８１９７は、デンプンを加水分解し、 ニスキュリンを利用し、レシチナーゼを生成し、サリシンを発酵した。細胞は、 ウレアーゼを生成せず且つマンノースまたはスクロースを発酵しなかった。すべ ての３種の菌株は、ナフシリン、アンピシリン、メチシリンなどのペニシリン型 抗生物質に対して抵抗性であり且つ少量、即ち、約１０ｇ／ｍｌのネオマイシン 、カナマイシンおよびエチジウムブロマイドに対して抵抗性である。

前記のように、ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１９５、ＮＲＲＬＢ−１８１９６およびＮ ＲＲＬ　　Ｂ−１８１９７の特性を有するＢ、ツリンギエンシス菌株の胞子およ びタンパク質結晶の製造は、ロイシン−バリンアミノ酸複合体を含有する水性栄 養培地を必要とする。本細菌の最適の結晶製造のためには、特に好ましい培地組 成物は、次の通りであるニドリブトン０．３％、トリプトース０．２％、オート クレーブ処理後１０　　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４および１０Ｍ　ｎ　Ｓ　０４の添加に よってｐＨ６，８のリン酸ナトリウム緩衝液中で０．ＯＩＭにされた酵母抽出物 ０，４５％。

所要アミノ酸複合体を有する他の適当な培地は、本発明の細菌の成長に使用して もよい。しかしながら、好ましい培地以外の使用培地は、減少された結晶製造を 生ずることがある。

細胞の産生は、本発明の生物の成長に満足な温度、即ち、約１０℃〜４０℃にお いて好気性条件下で行う。好ましい温度範囲は、約２７℃〜３２℃である。Ｂ、 ツリンギエンシス培養物を成長するのに好適な栄養培地のｐＨは、大体中性、即 ち、ｐＨ６，７〜７．２である。

培養時間は、完全な胞子および結晶ａ離に必要な時間であり、好ましくは約１８ 〜２４時間である。細胞は、通常の邪魔板付き振とうフラスコ中で小さいランで 成長してもよい。大規模の操作の場合には、タンク中での培養を実施し、攪拌を 適用し、接種された液体培地に曝気することが好都合である。培養後、細胞は、 遠心分離、濾過などの通常の沈降法によって収穫する。細胞は、そのまま使用し てもよく、または後の使用のために凍結してもよい。

突然変異体Ｂ、ツリンギエンシス菌株ＮＲＲＬＢ−１８１９５、ＮＲＲＬ　　Ｂ −１８１９６およびＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１９７は、高度に有効な殺虫剤であり 且つ鱗翅目の昆虫、特にイラクサキンウワバおよびモンシロチョウの幼虫を制御 するために所定プログラムで使用してもよい。菌株は、水などの不活性液体担体 を有する処方物で使用してもよい。場合によって、菌株処方物は、粘着剤、展着 剤、乳化剤、界面活性剤、増量剤などの通常の添加剤を含有していてもよい。菌 株処方物は、通常の噴霧技術および装置を使用して噴霧してもよい。

また、新規の菌株は、有機重合体などの好適なカプセル化材料中にカプセル化ま たはトラップし、粉末形態で適用できる。また、本発明の新規のＢ、ツリンギエ ンシス菌株の６−内毒素用遺伝物質は、組換ＤＮＡ技術を使用して他の細菌およ び植物に転移して、増大された昆虫制御を与えてもよい。

新規の菌株を単独または他の制御剤、例えば、殺虫剤および誘引剤との組み合わ せで使用することは、本発明の範囲内である。使用する時には、これらの薬剤は 、当業者によって容易に決定されるように、本発明の生物学的殺虫材料の有効性 を妨げないであろう量で使用すべきである。

下記例は、本発明を更に例示しようとするものであって、請求の範囲に規定のよ うな本発明の範囲を限定するものではない。

例Ｉ 第一試験において、イラクサキンウワバおよびモンシロチョウの幼虫に対するＢ 、ツリンギエンシス菌株ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１９５、ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１ ９６およびＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１９７の有効性を合成ビレトロイド含有殺虫物 、「ビドリン（Ｐｙｄｒｌｎ）　ＪおよびＢ。

ツリンギエンシス・パル・クルスタキ殺虫物、「ジベル（Ｄｉｐｅｌ）Ｊの有効 性と比較した。「ピドリン」は、シェル・コーポレーションによって販売されて いる製品の商品名であり且つシアノ（３−フェノキシフェニル）メチル−４−ク ロロ−α（１−メチルエチル）ベンゼンアセテート３０％および不活性成分７０ ％を含有する。「ジベル」は、アボット・ラボラトリーズによって販売されてい る製品の商品名であり且っＢ、ツリンギエンシス・パル・クルスタキ３．２％お よび不活性成分９８，８％を含有する。

メリーランド州のイースタン・ショア上に、コラードを１９８６年７月７日に長 さ２０フイートの４うねのプロットで直まきした。植物をうねで２インチ離間し 、うね間で３６インチ離間した。処理剤をランダム化した完全なブロックデザイ ンで４回配置した。各うねをガードうねによって緩衝した。土壌は、ノルフォー ク（Ｎｏｒｆｏｌｋ）　ｒＡＪローム砂であった。すべての噴霧処理剤は、液体 洗剤０．０１％を展着剤として加えた水０．５ｇ当たり胞子当ｆｆ１５．５Ｘ１ ０９であった。噴霧処理剤を処方物３０ガロン／ニーカーを与えるように校正さ れたトロンポーン型底スプレーで適用した。

うねを８月１１日、１８日および２５日および９月２日および８日に適用して処 理した。９月１５日に、茎葉損傷評価および昆虫計数を！２−５だ。イラクサキ ンウワバおよびモンシロチョウの幼虫の自然に起こる発生からの昆虫圧力は、中 位であった。茎葉損傷評価は１〜５であり且つ次の通り番号を付けた＝　（１） 被害０〜３％−一葉の上の時たまの穴；　（２）被害４〜１０％−一穴を有する 若干の葉；　（３）被害１１〜２５％−一穴を有する中位の数の葉；　（４）被 害２６〜５０％−一穴を有する大部分の葉；　（５）被害５１〜１００％−一樹 冠被害および／または穴を有するすべての葉。

データを分散分析によって分析し、平均値をＰ−０，０５水準でダンカンの多重 範囲試験（ＤＭＲＴ）によって分離した（ダンカン、１９５１年）。結果を以下 の表に記録する。

表は、イラクサキンウワバおよびモンシロチョウの幼虫に対する本発明の新規の 菌株の優秀な殺虫性を明示する。Ｂ、ツリンギエンシスｉ株ＮＲＲＬＢ−１８１ ９７は、コラードに対して「ビドリン」と統計的に同じ保護を与えた。明らかに 、菌株ＮＲＲＬＢ−１８１９５およびＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１９６は、平均茎葉 被害に関して同一水準の保護を示し、両方とも「ビドリン」よりも統計的に劣っ ていた。しかしながら、これらの新規の菌株は、市販のＢ、ツリンギエンシス製 品、「ジベル」の１０倍の活性増大を与えた。かかる増大は、「ジベル」処理剤 が１：１０希釈度で菌株ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１９５と同一水準の制御（被害１ ０％未満）を示した場合によく実証された。

本発明の精神および範囲から逸脱せずに修正および変更を前記開示に施すことが できることが理解される。

平均ｋＴ、ｎｊ／　　平均塙、ｒａｐａｅ／　　平均茎葉損１処理剤および薬量 ／ニーカー　　　植物１０１　　植物１０１　　　評価１゛２°３９月１５日　 　９月１５日　　　９月１５日ビドリン２．４ＥＣ ０，２１１ｂ（ＡＩ）／Ｘ−カー　　　　　　　　　　　　　　　０．０ａ　　 　　　　　　　　　　Ｏ，Ｏａ　　　　　　　　　　　　　@１．ｏＯａ ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８１９７Ｂ、　　ツリンギエンシス５　　　　０．５０ａｂ ｃ　　　　　　　　１．Ｑａｂｃ　　　　　　　　　　　　P．２５ａ ＮＩ？Ｉ？Ｌ　　Ｂ−１８１９５Ｂ、　　ツリンギエンシス”　　　　　　１． ２５ａｂｃ　　　　　　　’　１．２５ａｂｃ　　　　　　@　　　　２．０Ｏ ｂ ）１’ＲＲＬ　Ｂ−１８１９６Ｂ、　　ツリンギエンシス”　　　　　　０．２ ５ａｂ　　　　　　　　　１．０ａｂｃ　　　　　　　　　@　２．０Ｏｂ Ｌ／１０　　Ｂ−１８１９５Ｂ、　　ツリンギエンシス５　　　　０．７５ａｂ ｃ　　　　　　　　３．Ｏｅ　　　　　　　　　　　　　２D７５ｅｄｅ ジベル１．０１　ｌｂ　’　　　　　　　　２．２５ｅｄｅ　　　　２．２５ｄ ｅ　　　　　　２．５Ｏｂｅｄ未処理チエツク　　　　　　　　４．７５ｇ　　 　　　４．５０ｇ　　　　　　４．０ｇ１同じ文字によってフォローされる同じ 横巾０２つの番号は有意には異ならない（Ｐ−０，０５）ＤＭＲＴ。

２８月１１日、１８日、２５日、９月２日、８日にＩＩＪＩ霧。

３被害は主としてイラクサキンウワバおよびモンシロチョウの幼虫によって生じ た。

４ジベル−７２，６億国際単位／ポンド。

５７２．６億国際単位／ボンドを生ずるように校正。

ｉ傷　　　　　　　　　国際調査報告 Ｍ〒／τＩＥＲＦＩ／ｎｉ’ｙ６０

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１９５、ＮＲＲＬＢ−１８１９６およびＮＲＲＬ　Ｂ− １８１９７からなる群から選ばれる菌株の同定特性を有するバチルス・ツリンギ エンシスの胞子形成性結晶形成性突然変異体の培養物であって、前記菌株は毒性 タンパク質からなるバイピラミッド状結晶を製造する能力を有し且つ成長、胞子 形成および結晶製造のためにロイシンおよびバリンを含有する栄養培地を必要と することを特徴とする培養物。
2. ２．前記菌株が、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１９５の同定特性を有する、請求項１に記 載の培養物。
3. ３．前記菌株が、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１９６の同定特性を有する、請求項１に記 載の培養物。
4. ４．前記菌株が、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１９７の同定特性を有する、請求項１に記 載の培養物。
5. ５．ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１９５、ＮＲＲＬＢ−１８１９６およびＮＲＲＬ　Ｂ− １８１９７からなる群から選ばれる菌株の同定特性を有するバチルス・ツリンギ エンシスの胞子形成性結晶形成性突然変異体の培養物（前記菌株は毒性タンパク 質からなるバイピラミッド状結晶を製造する能力を有し且つ成長、胞子形成およ び結晶製造のためにロイシンおよびバリンを含有する栄養培地を必要とすること を特徴とする）を含むことを特徴とする鱗翅類の昆虫を制御するための生物制御 剤。
6. ６．前記菌株が、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１９５の同定特性を有する、請求項５に記 載の生物学的制御剤。
7. ７．前記菌株が、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１９６の同定特性を有する、請求項５に記 載の生物学的制御剤。
8. ８．前記菌株が、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１９７の同定特性を有する、請求項５に記 載の生物学的制御剤。
9. ９．昆虫をＮＲＲＬ　Ｂ−１８１９５、ＮＲＲＬＢ−１８１９６およびＮＲＲＬ 　Ｂ−１８１９７からなる群から選ばれる菌株の同定特性を有するバチルス・ツ リンギエンシスの胞子形成性結晶形成性突然変異体（前記菌株は毒性タンパク質 からなるバイピラミッド状結晶を製造する能力を有し且つ成長、胞子形成および 結晶製造のためにロイシンおよびバリンを含有する栄養培地を必要とすることを 特徴とする）の有効量に付すことを特徴とする鱗翅類の昆虫の制御法。
10. １０．前記菌株が、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１９５の同定特性を有する、請求項９に 記載の方法。
11. １１．前記菌株が、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１９６の同定特性を有する、請求項９に 記載の方法。
12. １２．前記菌株が、ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１９７の同定特注を有する、請求項９に 記載の方法。
13. １３．前記菌株が、不活性液体担体に含有されている、請求項９に記載の方法。
14. １４．前記鱗翅類の昆虫が、トリコブルシア・ニおよびアルトゲイア・ラパエか らなる群から選ばれる、請求項９に記載の方法。