JPH11508763A - 新規なバチルスセレウス菌株ａｓ４−１２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 AS4-12と命名した新規バチルスセレウス菌株を環境から単離した。この菌株AS4-12は、野外穀類植物における菌類による立ち枯れ病を撲滅するための生物防除剤として有用であり、また菌株AS4-12は、米国アッパーミッドウエスタン地域において、通常の野外条件下で、アルファルファ植物の出芽および成長を促進する上で、多数の自然の単離体の中で、最も良好な性能を発揮する。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なバチルスセレウス菌株AS4-12 技術分野 本発明は、一般的な分野、細菌学に関連し、特に野外用途における生物防除剤 として有用なバクテリアの新規な菌株に関するものである。 発明の背景 近年、農業の生産性および効率を高めるための生物学的な薬物の使用に関して 多大な研究がなされている。植物の害虫を抑制しもしくは植物の成長を補うため の、微生物の利用による生物防除は、化学的殺虫剤に変わる魅力ある代替品を与 える。該化学的殺虫剤は、ヒトの健康並びに環境特性に係わることから、以前程 には奨励、賛同されていない。研究室においてまたは野外において、害虫を駆除 し、もしくは植物の成育を容易にするのに有効な、生物学的薬物を単離する前に は、幾つかのスクリーニングプログラムが利用されている。 かなりの科学的および経済的進展が見られた、生物防除薬物の１例は、バチル スサリンジエンシス(Bacillus thuringiensis)の利用である。B.サリンジエンシ ス菌株は有毒タンパクを生成することが知られており、該タンパクはある種の昆 虫を特異的に殺す能力をもち、またその初期の探索は、多数の研究を導き、該研 究は、有効性における変化およびターゲット範囲を有する多数のB.サリンジエン シス菌株を同定するに及んだ。更に、このような毒素、または該毒素をもつ菌株 を安定化しおよび広範な野外作物の状況に対して適用する方法が、研究されてい る。同様に、生物防除に必要な該毒素および野外で使用するための接種物の調製 方法は、菌株間で一般的に類似しているので、B.サリンジエンシス菌株に関する 知見は、新たな菌株に対して殆ど援用可能であることも見出された。 以前、バチルスセレウス(Bacillus cereus)の特定の菌株（これはUW85およびA TCC承認番号53522 両者で表示されている）が、多くの用途において生物防除効 率をもつことが見出されている。このUW85B.セレウス菌株は、フィトプトーラメ ディカギニス(Phytopthora medicaginis)に起因する立ち枯れ病から、アルファ ルファ幼苗を保護し、フィトプトーラニコチアナエ(Phytopthora nicotianae)か らタバコ幼苗を保護し、ピチウムアファニデルマタム(Pythium aphanidermatum) に起因する腐れから胡瓜果実を保護し、かつスクレロチニアミノア(Sclerotinia minor)からピーナッツを保護することが分かった。UW85は、また米国特許第4,8 77,738 号においても、そのATCC承認番号を参照して、記載されている。後に、U W85は、その防黴活性および抗菌活性のために、菌類による立ち枯れを防止する のに独立に寄与する、２種の防黴性化合物を生成することが見出された。これら 化合物のうちのより高い効率のもの、即ち新規なアミノポリオールを、ツイッタ ーマイシンＡ(zwittermicin A)と命名し、一方未だ十分に特徴付けされていない 第二の化合物は、一時的に抗生物質Ｂと命名されている。 「生物防除(biological control)」とは、第二の生物を利用した病原体の抑制 （制御）として定義される。生物防除のメカニズムは、多岐に渡る。例えば、あ る腸管内バクテリアが、アルファルファにおける根腐れ病の生物防除における有 用性について検討されている。防除は、該腸管内バクテリアと該菌類との間の、 該アルファルファの根の表面上のスペースについての競合により達成されると考 えられている。これとは対照的に、バクテリアの一方の種により生成される毒素 は、病原体と思われるバクテリアの他方の種を防除するのに利用できる。バクテ リアにより生成された抗生物質が、このような毒素の一例である。該毒素は、こ れを生産する該種から単離して、ペニシリンについて一般的手順であるように、 直接投与するか、あるいは該種自体を適当な状況の下で投与して、該毒素をその 場 で生成することも可能である。一旦単離された、このような土壌棲息バクテリ アは、種々の他の領域において、防黴剤または抗生物剤としての有用性をもつ可 能性がある。 発明の概要 本発明は、要約すれば、本明細書においてAS4-12と命名した、新規なバチルス セレウス菌株ATCC No．55609を環境から単離した点にある。菌株AS4-12は、米国 のアッパーミッドウエスタンの野外環境における、アルファルファ植物の育成並 びに定着を促進する上で高い効果をもつことが見出された。 本発明は、更に活性成分として、AS4-12と命名した、新規なバチルスセレウス 単離菌株、ATCC No．55609を含有する接種物を適用することによって、アルファ ルファ立毛(stands)の成育を促進する方法を記載することによって特徴付けられ る。 本発明のその他の目的、利点並びに特徴は以下の明細書の記載から明らかとな ろう。 発明の詳細な説明 土壌から単離した、元のバクテリア菌株は、植物の立ち枯れ病および根腐れ病 の原因となる菌類の種に対して、生物防除作用を及ぼす。この菌株は、アメリカ ンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)に寄託さ れ、ATCC 55609なる承認番号が付与されているので、以下菌株AS4-12またはATCC 55609と呼ぶ。 更に、AS4-12の幾つかの変異体も、AS4-12により達成されるものに匹敵する、 生物防除能を与えることが予想される。これらのバクテリア菌株は、実質的に純 粋な培養物中で得ることができる。「実質的に純粋な」培養物とは、該培養物の 複製を妨害せず、あるいは通常の微生物学的技術によって検出するのに十分な量 で、他のバクテリア種を含まない、バクテリア培養物を意味するものとする。更 に、該生物防除作用は、原理的には該バクテリア菌株により生成される１以上の 毒素により及ぼされることが見出されている。 菌株AS4-12は、一連のバチルスセレウス(Bacillus cereus)菌株の一種であっ て、該バチルスセレウス菌株は、少なくとも部分的には、自然に抗生物性薬物、 特に同時−継続中の特許出願の課題である抗生物質を合成するという事実によっ て、有用な生物防除薬物である。該抗生物質または毒素は、上澄液および他のバ クテリアを含まない流体中に見出され、またAS4-12またはその防除性変異体の培 養により得られる培養培地は、以下に定義するように「防除性毒素(protecting toxin)」であることが分かっている。この毒素は、その起源のいかんによらず、 バチルスセレウスの培養物中で同定可能なものとして、特徴付けられており、ま た造語「ツイッターマイシン(zwittermicin)Ａ」として知られている。B.セレウ スATCC 53522の培養物から得た上澄液のもう一つの画分は、生物学的に活性であ って、フィトプトーラメディカギニス(Phytopthora medicaginis: Pmm)の遊走子 形成を行うズーリシン能(zoolysin capability)を有することが分かっている。 しかしながら、以下で明らかになるように、このズーリシン活性画分は、該抗生 物質の防黴活性をもたない。バチルスセレウス抗生物性ツイッターマイシンＡは 約396 ダルトンの高度に水溶性の分子であることが分かっている。この分子は両 性イオンであり、従って酸および塩基基両者を含み、２つのアミノ基を含有し、 かつポリアルコールである。 前章において言及した該生物防除の存在を立証する該方法は、以下に詳述する 「植物防禦アッセイ」である。立ち枯れ病および根腐れ病を引き起こす、菌類の 「生物防除」は、AS4-12、生物防禦を発揮するその変異株、これらにより生成さ れる防黴性毒素または任意の他の化合物または分子の有効量が、土壌または防禦 すべき植物の極近傍における他の成育媒体に置かれた場合に、これら立ち枯れ病 および根腐れ病を引き起こす１種以上の病原体の存在下で、これら諸疾患の症状 における、統計的に有意な減少が生じた場合に、存在すると見做される。立ち枯 れ病および根腐れ病を撲滅するための「有効量」とは、症状のかかる肉眼的に有 意な減少を与えるのに十分な量である。明らかに、バクテリア、任意の毒素また は他の化合物の如何なる量も、このように定義した有効量でない場合、バクテリ ア、毒素、または化合物は、立ち枯れ病および根腐れ病を引き起こす該菌類に対 して、生物防除作用を及ぼすことはできない。 このような生物防除作用を発揮できるAS4-12およびその変異株は、しばしば包 括的に「防除性(protecting)」バクテリアと呼ばれる。このような生物防除作用 を発揮できるバチルスセレウス抗生物質および他の毒素は、しばしば「防除性(p rotecting)」化合物または毒素と呼ばれる。このような有効量の防除性バクテリ ア、その毒素またはバチルスセレウス抗生物質で処理された、種子、幼苗、およ び成熟植物を包含する植物は、立ち枯れ病および根腐れ病から「防禦された(pro tected)」と言われる。 以下の記載は、該植物の防禦アッセイについての説明であり、該アッセイによ り、バクテリア、毒素等のテスト物質を、立ち枯れ病および根腐れ病の症状を引 き起こす可能性のある菌類に対して、生物防除作用を及ぼす能力についてテスト することができる。防禦すべき植物の種子または幼苗を、立ち枯れ病および根腐 れ病を引き起こす菌類の存在下で、植栽培地中で栽培する。この植栽培地は、こ のような菌類を含有する立ち枯れ発生土壌、バーミキュライト水性分散体（ここ で、該菌類は該バーミキュライトおよび水中または種子または幼苗上またはその 中に存在する）、寒天を主成分とする処方物、または任意の他の植栽培地（該種 子または幼苗が成育し、かつ該菌類が自由に発芽する）であり得る。これらのバ クテリア、毒素または他のテスト物質は、少なくとも該種子または幼苗の極近傍 部分に配置される。かかる配置は、該種子の「極近傍部分」または任意の可溶性 テスト物質またはテスト中のバクテリアの任意の可溶性滲出物が、実際に発芽中 の幼苗と接触している場合には、幼苗の「極近傍部分」であると理解される。 好ましくは、種子を使用した場合、該種子は該テスト物質で被覆され、また該 テスト物質が種子に関して、このように使用された場合には、以下これを「種子 接種物(seed inoculum)」という。種子接種物で種子を被覆する方法は、一般的に 当業者には周知であり、バクテリアを殺し、該種子に有害であり、あるいは該種 子接種物中に含まれる毒素または他の物質を破壊するのに十分な程に苛酷な条件 を必要としない、公知の任意の方法で十分である。容易かつ好ましい方法の一つ は、該テスト物質を、メチルセルロースの1.5%水性溶液に懸濁または溶解するこ とである。便宜的に、該種子接種物はメチルセルロース中に懸濁されたバクテリ アであるが、バクテリア毒素等の溶解性の物質を同様な方法で、または同様な効 果を達成する異なる方法で取り扱うことができる。防禦すべき該植物種子を、該 懸濁液に添加し、これと激しく攪拌して、該種子の表面を該懸濁液で被覆する。 次いで、該種子を、好ましくは滅菌したペトリ皿等の無菌表面上の、層流フード 内に配置することにより、乾燥することができる。かくして、乾燥した種子接種 物−被覆種子が得られる。該被覆種子を、該植栽培地中で育成する場合、該テス ト物質は、該種子の極近傍部分に配置される。 幼苗の成育および立ち枯れ病の症状の発現のために十分な時間の経過後、該播 種された種子から発芽した幼苗を、コントロールと比較して、防禦の証拠につい て肉眼で評価することができる。立ち枯れ病に攻撃されやすいことが知られてい る、アルファルファ、大豆およびインゲンの株においては、光周期12時間で、温 度24℃にて、成育チャンバー内での１〜２週間の成育期間が、立ち枯れ病の症状 を発現するのに十分な期間であることが分かった。該期間中、幼苗は試験管中で 成育され、該試験管にはPmm のおよそ10³個の遊走子またはこれに匹敵する立ち 枯れ病−誘発菌類が含まれていた。幼苗にまで発育した防禦された種子は、肉眼 的には非−感染種子とは識別できず、一方未防禦種子から発育したコントロール 幼苗は、立ち枯れるか、あるいはインゲンの場合には、根および茎上に褐色の病 巣、矮化した根、腐食された根、および肉眼的に明らかな他の根腐れ病の症状を 呈した。 AS4-12の防禦性変異株は天然産のおよび人為的な変異株両者を包含する。例え ば、AS4-12は、一般的に抗生物質リファンピシンおよびネオマイシンに対して敏 感である。しかしながら、AS4-12の天然産の変異株から、これらの抗生物質の一 方または両者に対して抵抗性を示すものを単離することができる。これら変異株 の幾つか並びにコロニーの外観により親AS4-12株から識別可能な、天然産の一つ は、植物防禦アッセイにおいてアルファルファ植物を防禦することが分かるであ ろう。AS4-12の他の変異株は、AS4-12を、公知の条件下で、変異誘発物質として のN-メチル−ニトロソグアニジンの作用に付すことにより人為的に誘発できる。 同様な変異株は、他の有用なB.セレウス株、例えば米国特許第4,877,738(その開 示事項を本発明の参考とする)に記載されているようなUW85(ATCC 53522)から調 製された。 公知の微生物学的形態学およびコロニー分析技術によって、菌株AS4-12ATCC N o．55609を、UW85(ATCC 53522)から識別することは不可能である。これら菌株間 の識別は、以下に報告するような実際の野外性能条件における統計的な差異に大 いに関連している。本質的に菌株AS4-12は、UW85よりも統計的に有意に高いレベ ルの病原体阻害性を与える。 実施例１：菌株の起源 本研究で使用した土壌サンプルの地理的起源および物理化学的諸特性を、以下 の第１表に掲載した。全てのサンプルは表面層位から採取した。土壌のpH、有機 物質、および粒径の測定は、ウイスコンシン大学、ソイル＆プラントアナリシス ラボラトリー(University of Wisconsin Soil & Plant Analysis Laboratory)(W I 州マディソン)により行われた。 B. セレウス単離体の単離および同定 該バクテリア菌株および単離体並びにその起源を第２表に掲載した。大豆の根 から収集したバクテリアは、WI州マジソンの穀物畑で育成した植物から、以前に 記載したように単離した（第２表）。本研究において収集した残りのバクテリア は、全アルファルファの根または土壌１ｇの何れかを、９mlの水を含有する試験 管に入れ、モデル(Model)2200浴超音波発振器(CT州ダンバリーのブランソンウル トラソニックス社(Branson Ultrasonics Corp.))中で超音波処理することにより 単離した。懸濁液の、水による連続的な10−倍希釈物を生成し、10^-1〜10^-5の範 囲の希釈物0.1 mlを、1/10−濃度のトリプチケース(trypticase)大豆寒天(1/10- 濃度TSA)(MD 州コッキースビルのベクトンディッキンソンマイクロバイオロジー システムズ(Becton Dickinson Microbiology Systems))またはMinIC 培地上に展 開した。プレートを、室温または28℃にて、１〜３日間インキュベートした。単 離されたコロニーを含むプレートを、更なる研究で使用した。B.セレウスに典型 的な形態学的特徴（平坦、ブロード、かつクリーム色）をもつコロニーを採取し て、単離のために画線培養した。B.セレウスについての部分的選別として、初期 平板培養またはその後の画線培養中に、該培地にポリミキシン(polymyxin)(25μ g/ml)、シクロヘキシミド(cycloheximide)(100 μg/ml)およびアンピシリン(50 μg/ml)を補充した。全ての単離体を、血液寒天の溶血（これはB.セレウスの診 断法である）についてテストし、非−溶血性であるものを該収集群から取り出し た。血液寒天は、WI州マディソンのウイスコンシンステートハイジェンラブ(Wis consin State Hygiene Lab.)から入手した。単離体は、1/2-濃度のトリプチケー ス大豆寒天(1/2- 濃度TSA)斜面培地上に保存した。アルファルファ植物を、12時 間の光周期にて、光の強度244 マイクロアインシュタイン/m²/s で、24℃にて成 育チャンバー内で21日間、WI州アーリントン由来の土壌中で、種子から成長させ た。大豆植物は、WI州マディソンの穀物畑で種子から成育させた。 ファイブスターラボラトリーズ(five Star Labs)(CT 州ブランフォード)およ びマイクロバイアル(Microbial)ID(DE ニュワーク)により分析された、47個の単 離体からの脂肪酸のプロフィールに基づいて、該単離体の全てを、該B.セレウス 群の構成員として分類した。該B.セレウス群は、B.マイコイデス(mycoides)、B. アンスラシス(anthracis)およびB.サリンジエンシス(thuringiensis)種を包含す る。B.マイコイデス菌株の固有の仮根形態学的特徴は、B.セレウスからの識別を 可能とし、この収集体中の該単離体の何れも、B.マイコイデス−様の形態学的特 徴を示さない。B.アンスラシスは、溶血性ではなく、通常はアンピシリンに対し て感受性であり、従って恐らくこの収集体群から排除された。B.セレウスとB.サ リンジエンシスとの間の識別は、標準的方法では困難である。従って、通常の推 奨に従って、本研究において収集された単離体の全てを、B.セレウスと見做した 。菌株BGSC4A9 、BGSC4B1 、BGSC4C3 、HD1 、BGSC4E1 、BGSC4F1 、BGSC4G1 、 BGSC4H1 、BTSC4I1 、BGSC4J1 およびBGSC4S2 は以前他の者によってB.サリンジ エンシスとして分類され、この種の命名がこれら菌株に対して保持されていた。 ファージP7に対する感受性についてのアッセイ 該ファージP7(ATCC 75237)およびPBを、該菌株の特徴付けの補助のために使用 した。B.セレウス菌株のファージP7に対する感染し易さは、該菌株が、生物防除 および抗生物質生産に対して強力な相関をもつことを明らかにした。これらファ ージを増殖させるために、我々は、約10⁶ PFU のファージと過剰のB.セレウス菌 株UW85と溶融した軟質寒天(4g寒天/l)との混合物を、1/2-濃度のTSA プレート上 に展開させた。プレートを28℃にて一夜インキュベートし、次いで該軟質寒天を 該プレートから掻き落とし、1/2-濃度のトリプチケース大豆ブロス(1/2- 濃度の TSB)(1 ml/プレート)中に懸濁させた。寒天および細胞を遠心処理により除去し 、得られた上澄液を0.2 μｍのフィルタに通した。ファージの力価は、典型的に は１×10¹⁰PFU/mlであった。 多数の単離体をP7感受性につきスクリーニングするために、48個の単離体のグ リッドを1/10−濃度のTSA 上で成育させ、次いで細胞を1/10−濃度のTSA プレー ト上に金属リプリケータを使用して移した。該プレートは、P7の希釈物が、約10⁸ 、10⁴および10³ PFU/プレートを含むように展開されていた。ファージを含まな い1/10−濃度のTSA をコントロールとして使用した。P7を含有するプレート上に プラークまたは成長性の低いパッチを形成すると思われる単離体を、軟寒天重層 アッセイ（以下で説明する）でテストして、これらがP7^sであるか否かを決定し た。初期スクリーニングにおいてP7^rであった多くの単離体は、再テストには付 されなかった。 バクテリア単離体のP7に対する感受性に関する、該第二のテストにおいて、各 単離体を1/2-濃度のTSA 上で成長させ、細胞をプレートから掻き出し、軟寒天重 層内に混合して、新たな1/2-濃度のTSA プレート上に菌叢を形成した。P7の10− 倍希釈物を該プレート上に5-μｌの滴として配置し、次いで該滴を28℃にてイン キュベートした。プラークが出現した場合には、その菌株をP7−感受性（P7^s） と命名した。２種の単離体の菌叢ARL8およびHS23-11 を、P7の未希釈の液滴によ り透明化したが、P7は低濃度において、これらプレート上に孤立したプラークを 形成することはなかった。この高力価の液滴による透明化は、UW85溶解物中に存 在する化学物質というよりも寧ろP7によるものと思われた。というのは、UW85上 に濁ったプラークを形成する、PBの溶解物の高力価の液滴は、ARL8およびHS23-1 1 の菌叢上で透明化を生じなかったからである。従って、これらの菌株も、P7^s であると評価された。P7に影響されずに菌叢を生じた単離体はP7^rであると評価 された。 エルウィニアハービコラ(Erwinia herbicola)の阻害アッセイ E.ハービコラLS005 の阻害アッセイを、シロ−スー(Silo-Suh)等，Appl．Envi ron．Microbiol.，1994，60:2023-2030 に記載されたように、但し以下の変更を 行って実施した。1/2-濃度のTSB 内で成育させた、各B.セレウス単離体の３日培 養物をテストして、これらが1/1000−濃度のTSA プレート上で、E.ハービコラを 阻害するか否かを決定した。E.ハービコラ阻害の可視性の領域を生成した単離体 を、再テストした。両テストで可視性の阻害領域を生成した単離体をEh⁺として 評価した。２つの初期テスト各々において、顕著にE.ハービコラを阻害しなかっ た単離体は、Eh^-として評価した。幾つかのB.セレウス単離体は、初期テストに おいてE.ハービコラを阻害しなかったが、-20 ℃にて保存した後には阻害し、か つ幾つかの単離体(ALF115，HD1 BGSC4S2)は、阻害の小さな領域を生成するか、 または後のテストで阻害領域を全く生成しない、変動性の表現型を有していた。 これらはEh^-として評価した。 ツイッターマイシンＡおよび抗生物質Ｂについてのアッセイ ツイッターマイシンＡおよび抗生物質Ｂは、CMSEP-PAK カートリッジ（MA州ミ ルフォードのミリポア(Millipore)社）を使用したカチオン交換クロマトグラフ ィーおよび引き続いて実施される高電圧ペーパー電気泳動(HVPE)により、培養上 澄中で同定された。４ml培養上澄等価物からのカチオン画分を該ペーパーに適用 し、これを電気泳動後に、シロ−スー等の上記文献に記載のように硝酸銀で染色 した。HVPE中の真正のツイッターマイシンＡまたは真正の抗生物質Ｂから識別し 得ない物質を生成する単離体を、それぞれツイッターマイシンＡ産生体または抗 生物質Ｂ産生体と命名した。該単離体の集団の代表的な９種により生成されるツ イッターマイシンＡの構造上の同一性を明らかにするために、推定−ツイッター マイシンＡをこれら単離体から精製し、プロトン核磁気共鳴スペクトル分析(¹H- NMR)および高速原子衝撃質量スペクトル分析にかけた。 アルファルファ立ち枯れ病の阻害に関するアッセイ バクテリア単離体を、1/2-濃度のTSB 内で３日間育成し、立ち枯れ病に関する アッセイにおいてテストした。各単離体は、以下の例外を除き、７種の別々の実 験において、15種の植物についてテストした。菌株ATCC12826 は実験１および２ から省き、菌株BAR78 は実験４から省き、また菌株WX8-8 およびLS2-12は実験５ から省いた。統計的解析（分散解析、ダネッツ(Dunnet's)の比較テスト、最小二 乗平均の標準誤差）を、SAS コンピュータプログラム(N.C．ラレイのSAS インス ティチュート(Institute) 社)を使用して実施した。７つの実験から得たデータ をプールし、７ブロックの単一の実験として解析した。 菌株のテスト多様性 ツイッターマイシンA-および抗生物質B-産生体の多様性を評価するために、我 々の収集物における固有のツイッターマイシンA-および／または抗生物質B-産生 菌株の最小数の決定を試みた。我々は、菌株間の表現型の差異を示すことができ た場合にのみ、単離体が別々の菌株であると考えた。そこで、単離体を一連の表 現型テストにかけた。全ての特徴付けは、1/2-濃度のTSA 上で精製されたコロニ ーである単離体についてのみ実施した。抗生物質耐性をテストするために、単離 体を、テトラサイクリン(5μg/ml)、ネオマイシン(5μg/ml)またはクロラムフェ ニコール(1μg/ml)を含有する1/2-濃度のTSA 上に画線接種し、28℃にて一夜イ ンキュベートした。抗生物質の存在下または不在下で画線培養した場合に、同様 に成育した単離体を、抗生物質耐性のあるものとして分類した。顔料産生につい て単離体をテストするために、MES 最小培地上で28℃にて、７日間成育させ、次 いで肉眼観察により評価した。該MES 最小培地は、9.76g/l の2-[N- モルホリン ]エタン−スルホン酸(MES)、2g/lの(NH₄)₂SO₄ 、0.2g/lのMgSO₄・7H₂O、0.25mg/ lのMnSO₄・7H₂O、1.25g/l のK₂HPO₄・3H₂O 、2g/lのL-グルタミン酸、10mg/lのチ アミン、15 g/lの寒天、40mg/lのFeCl₃・6H₂O、6g/lのスクロースおよび1 mMの アミノ酸類、即ちスレオニン、セリン、ロイシン、バリンおよびアラニンを含有 し、またpH6.1 に調節されていた。MES-Thr 培地は、スレオニンに欠けるMES 最 小培地であった。我々は、単離体の、MES-Thr 培地上での成育能を、該単離体を MES-Thr プレートに画線接種し、28℃にて４日間インキュベートし、各菌株につ いてコロニーの出現割合を記録した。ファージ#ATCC 7064および#ATCC 27877 は 、アメリカンタイプカルチャーコレクションから入手し、それぞれバクテリア菌 株ATCC 7064 およびATCC 27877上で増殖させた。ファージ#63 は菌株Bt-1上で増 殖させ、#63 およびBt-1はR.ランデン(Landen)から入手した。単離体のファージ #63 、#ATCC 7064および#ATCC 27877 に対する感受性は、P7について上記した軟 寒天重層法によって測定し、感受性の指標としてプラーク形成を使用した。 ツイッターマイシンＡ産生と、P7^s およびEh⁺ 単離体との関連性 B.セレウス菌株UW85が２種の抗生物質、即ちアルファルファ植物幼苗の立ち枯 れを抑制するのに寄与する、新規なアミノポリオール、ツイッターマイシンＡ、 および抗生物質Ｂを生産することが分かった。UW85は、元々、生物防除活性につ き労力を要するスクリーニングにおいて同定された。上で実施した研究は、P7(P 7^s)に対する感受性およびE.ハービコラ阻害能(Eh⁺)が、ツイッターマイシンＡ産 生体を同定するのに利用できる表現型であるか否かおよび有用な生物防除性菌株 であるか否かを、調べるためのものであった。 4,307 B.セレウスおよびB.サリンジエンシス単離体をP7^sおよび／またはEh⁺表 現型についてスクリーニングした。これらの単離体は、合計５カ国における全体 で16箇所において、地理的に多様な土壌サンプル（上記第１表）から、アルファ ルファおよび大豆根から、および保存培養収集体（上記第２表）から得た。各源 から同定されたP7^sまたはP7^r Eh⁺単離体の数およびテストした単離体の数を表に 掲載した。P7^s単離体は、調べられた16土壌中の14サンプル中並びにアルファル ファおよび大豆根由来のサンプル中に同定された。87P7^s単離体のうちの全てが 、SNY73 およびLN100 を除きEh⁺であった。P7^r Eh⁺単離体は、該土壌各々並びに アルファルファの根から同定された。テストした全単離体のうちの約2%(85/4,30 7)の単離体がP7^s Eh⁺であり、かつその7%(132/1,876)がP7^r Eh⁺であった。 アルファルファの野外立毛研究 次に、最も顕著な菌株の幾つかを、ウイスコンシン州アーリントン、ハンコッ ク、マーシュフィールドおよびウエストマディソンにて成育された、アルファル ファ畑における、生物防除接種物として使用した。これら野外試験の結果を、以 下の第３、４、５および６表に示す。 これらデータから、菌株AS4-12は、全体的に、米国のアッパーミッドウエスタ ン地域における通常の栽培条件下で、アルファルファ畑の立毛を増強する上で、 最良の野外性能をもつことが分かった。 a: 出現カウント数：列１ｍ当たりの幼苗数 b: 飼料収量：列１ｍ当たりの飼料新鮮重 c: 立毛カウント：列１ｍ当たりの植物の数 d: DAP = 植付け後の日数 畑の数： 248 土壌の型： プラノ(Plano)シルトローム 実験設計： ５回の反復によるランダマイズドコンプリートブロック (Randomized Complete Block) 栽培品種： イロカス(Iroquois) 植付け日： 5-09-93 植付け割合： １エーカー当たり20ポンド（６インチ列を想定） 防黴剤割合： 100 ポンドの種子当たり４オンス バクテリア割合： 60ポンドの種子当たり12液体オンス(fluid oz)(10⁸細胞 ／ml培養液) a: 出現カウント数：列１ｍ当たりの幼苗数 b: 飼料収量：列１ｍ当たりの飼料新鮮重 c: 立毛カウント：列１ｍ当たりの植物の数 d: DAP = 植付け後の日数 畑の数： V-21 土壌の型： プレンフィールド(Plaindfield)ローム状砂 実験設計： ５回の反復によるランダマイズドコンプリートブロック (Randomized Complete Block) 栽培品種： イロカス(Iroquois) 植付け日： 5-26-93 植付け割合： １エーカー当たり20ポンド（６インチ列を想定） 防黴剤割合： 100 ポンドの種子当たり４オンス バクテリア割合： 60ポンドの種子当たり12液体オンス(10⁸細胞／ml培養液) a: 出現カウント数：列１ｍ当たりの幼苗数 b: 飼料収量：列１ｍ当たりの飼料新鮮重 c: 立毛カウント：列１ｍ当たりの植物の数 d: DAP = 植付け後の日数 畑の数： W-9 土壌の型： ウイズィー(Withee)シルトローム 実験設計： ５回の反復によるランダマイズドコンプリートブロック (Randomized Complete Block) 栽培品種： イロカス(Iroquois) 植付け日： 6-29-93 植付け割合： １エーカー当たり20ポンド（６インチ列を想定） 防黴剤割合： 100 ポンドの種子当たり４オンス バクテリア割合： 60ポンドの種子当たり12液体オンス(10⁸細胞／ml培養液) a: 出現カウント数：列１ｍ当たりの幼苗数 b: 飼料収量：列１ｍ当たりの飼料新鮮重 c: 立毛カウント：列１ｍ当たりの植物の数 d: DAP = 植付け後の日数 畑の数： P-11 土壌の型： プラノ(Plano)シルトローム 実験設計： ５回の反復によるランダマイズドコンプリートブロック (Randomized Complete Block) 栽培品種： イロカス(Iroquois) 植付け日： 5-21-93 植付け割合： １エーカー当たり20ポンド（６インチ列を想定） 防黴剤割合： 100 ポンドの種子当たり４オンス バクテリア割合： 60ポンドの種子当たり12液体オンス(10⁸細胞／ml培養液)

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，Ｋ Ｚ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，Ａ Ｕ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ， ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ジェイコブソン リン エム アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53711 マディソン モンロー ストリー ト 2417 (72)発明者 ジョンソン ディヴィッド ダブリュー アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53706 マディソン レイクウッド ガー デンス レーン 56 (72)発明者 スミス ケヴィン ピー アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53711 マディソン グラント ストリー ト 1005−＃３ (72)発明者 グッドマン ロバート エム アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53705 マディソン ユニヴァーシティー ベイ ドライヴ 939 (72)発明者 スタッブ エリック ヴィー アメリカ合衆国 ウィスコンシン州 53715 マディソン サウス ミルズ ス トリート 415

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．AS4-12，ATCC 55609の同定特性を有する、バチルスセレウスの生物学的に純 粋な培養物。 ２．ツイッターマイシンＡ産生能力およびアルファルファ植物を、野外条件の下 にて、立ち枯れ病から防禦する能力を保持することを特徴とする、バチルスセレ ウス菌株AS4-12，ATCC 55609から誘導される、変異体菌株の生物学的に純粋な培 養物。 ３．アルファルファ植物に適用される接種物であって、担体と、有効量の、ツイ ッターマイシンＡ産生能力およびアルファルファ植物を、立ち枯れ病から防禦す る能力を保持する、バチルスセレウスAS4-12，ATCC 55609、バチルスセレウスAS 4-12，ATCC 55609の変異体並びにその混合物からなる群から選ばれるバクテリア を含有することを特徴とする、上記接種物。 ４．育成培地中で、植物を立ち枯れ病から防禦する方法であって、該防禦すべき 植物の近傍に、ツイッターマイシンＡ産生能力およびアルファルファ植物を、立 ち枯れ病から防禦する能力を保持する、バチルスセレウスAS4-12，ATCC 55609お よびその変異体からなる群から選ばれるバクテリアを、その有効量で配置する工 程を含む、上記方法。