KR20210001996A - 브레비바실러스 브레비스 hk544 균주를 이용한 식물병 방제용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액, 상기 배양여액의 분획물 또는 이데인 B1(edeine B1)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공하기 위한 것으로, 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 고추 탄저병 등 다양한 식물병에 대하여 우수한 방제효과를 나타내므로, 식물병 방제 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

브레비바실러스 브레비스 HK544 균주를 이용한 식물병 방제용 조성물{Composition for controlling plant diseases using Brevibacillus brevis HK544}
본 발명은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액, 상기 배양여액의 분획물 또는 이데인 B1(edeine B1)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.
과학기술과 산업의 발전에도 불구하고, 현대농업의 가장 큰 숙제는 여전히 식량문제 해결에 있다. 세계 인구는 가파르게 증가하고 있고, 기후 변화로 미래의 안정적인 식량수급에 적신호가 켜진 상황이다. 식물병원균은 농작물에 다양한 병을 일으켜, 작물의 수량을 감소시키는데, 만약 여기에 적절히 대처하지 못하여 식물병이 대발생하게 되면, 1846년 아일랜드 대기근과 같은 심각한 사회문제가 발생할 수 있다. 식물병을 방제하기 위한 주요 수단으로서 화학 농약을 사용해 왔으나, 지나친 화학 농약의 사용은 생태계 교란, 환경오염, 인축독성, 약제저항성 문제 등을 가져왔다. 따라서 화학 농약의 사용을 줄이거나 이를 대체하기 위한 새로운 친환경 식물병 방제수단의 개발이 요구되어지고 있고, 식물추출물, 미생물, 또는 미생물이차대사산물 등의 천연소재를 이용한 친환경 무독성 식물병 방제기술 개발 필요성이 커지고 있다.
브레비바실러스(Brevibacillus spp.)는 막대형상의 그람양성세균으로 16S rRNA 유전자 염기서열을 바탕으로 한 계통분석을 통하여 1996년 바실러스 브레비스(Bacillus brevis) 클러스터로부터 브레비바실러스(Brevibacillus) 속으로 재분류되었다. 브레비바실러스 아그리(Brevibaciilus agri), 브레비바실러스 보르스테렌시스(Brevibacillus borstelensis), 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis), 브레비바실러스 센트로스포루스(Brevibacillus centrosporus), 브레비바실러스 조시넨시스(Brevibacillus choshinensis), 브레비바실러스 포르모수스(Brevibacillus formosus), 브레비바실러스 라테로스포루스(Brevibacillus laterosporus), 브레비바실러스 파라브레비스(Brevibacillus parabrevis), 브레비바실러스 레우스제리(Brevibacillus reuszeri), 브레비바실러스 서모루버(Brevibacillus thermoruber) 등 현재 20여종의 브레비바실러스가 존재한다. 임상 항생물질인 선형 펩타이드 그라미시딘 A(gramicidin A)와 환형 펩타이드 그라미시딘 S(gramicidin S)를 포함한 다양한 항미생물 펩타이드(e.g., tostadin, edeine, spergualin, tauramamide, brevistin, Bac-GM100, laterosporulin, laterosporulin 10)이 브레비바실러스(Brevibacillus spp.)에서 발견되었다.
브레비바실러스(Brevibacillus spp.)는 신규항생물질을 탐색하는 연구에 주요 소재로 이용되고 있다. 토마토시들음병균(Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici)과 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) 균주를 동시에 토마토 식물에 처리했을 때, 토마토 시들음병의 진전이 크게 감소했고, 식물생장촉진효과가 나타났다는 연구결과가 있다(J Phytopathol 2010, 158: 470-478). 또한 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) 균주와 이 균주가 생산하는 항생물질 그라미시딘(gramicidin S)는 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)의 포자발아와 균사생장을 억제하는 우수한 활성을 나타낸 바 있지만, 식물병 방제효과는 제시하지 않고 있다(Journal of Applied Microbiology 2001, 91, 652-659). 또한, 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) FJAT-0809-GLX 균주는 항균활성물질 에틸파라벤(ethylparaben)을 생산하는 균주로 에틸파라벤을 함유하는 배양여액을 식물병원균(Lasiodiplodia theobromae)과 같이 식물에 처리했을 때, 사과나무의 식물병 발생을 크게 감소시켰다는 결과가 보고된 바 있다. 상기 언급된 항균활성 효과들은 모든 브레비바실러스(Brevibacillus spp.)에서 나타나는 것은 아니며, 브레비바실러스(Brevibacillus spp.) 균주의 특성에 따라 서로 다른 항균활성 효과를 나타낸다.
이처럼 브레비바실러스는 항균활성을 가진 다양한 종류의 펩타이드 항생물질을 생산하기 때문에 새로운 작물보호제를 개발하는데 적극적으로 이용될 수 있다. 본 발명자들은 주요 식물병에 대하여 방제 효과를 나타내는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주를 발굴하여 동정하였으며, 배양액으로부터 식물병원균에 항균활성을 나타내는 물질을 동정하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 수탁번호 KACC 81093BP로 기탁된 식물병 방제 활성을 나타내는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 이데인 B1을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 또는 이데인 B1을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제 조성물을 식물 또는 식물을 재배하는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 목적은 수탁번호 KACC 81093BP로 기탁된 식물병 방제 활성을 나타내는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주를 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 이데인 B1을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 또는 이데인 B1을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제제 조성물을 식물 또는 식물을 재배하는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주를 이용한 식물병 방제용 조성물은 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 고추 탄저병 등 다양한 식물병에 대하여 우수한 방제효과를 나타내므로, 식물병 방제 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 콩(tryptic soy agar) 배지에 배양한 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주의 균총을 나타낸 도이다.
도 2는 16S rRNA 유전자 염기서열 기반으로 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주를 근연종과 비교하여 작성된 계통수를 나타낸 도이다.
도 3은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주 배양액과 배양여액의 고추 탄저병 방제효과를 확인한 사진이다.
(A) 좌측부터 무처리구, HK544 배양액 10%처리구, HK544 배양액 20%처리구, HK544 배양액 30%처리구, 합성농약 다이티아논(dithianon; 50μg/ml)의 처리구
(B) 좌측부터 무처리구, HK544 배양여액 10%처리구, HK544 배양여액 20%처리구, HK544 배양여액 30%처리구, 합성농약 다이티아논(dithianon; 50μg/ml)의 처리구
도 4는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주로부터 항균활성물질 이데인 B1(edeine B1)를 분리하는 과정을 나타낸 도이다.
도 5는 이데인 B1(edeine B1)의 ESI-MS 양이온 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 이데인 B1(edeine B1)의 화학구조를 나타낸 도이다.
본 명세서 중에서 "방제"라고 하는 것은 병이나 해충의 예방, 기피 뿐만 아니라 제거, 사멸의 의미를 포함한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KACC 81093BP로 기탁된 식물병 방제 활성을 나타내는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주를 제공한다.
상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다.
상기 균주는 토양으로부터 분리된 것일 수 있고, 구체적으로 한국화학연구원 실험포장의 토양으로부터 분리된 것일 수 있다.
상기 균주는 식물병 방제 활성을 가질 수 있다.
상기 식물병은 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes), 토마토잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 배추 검은무늬병(원인균: Alternaria brassicicola), 호접란 세균성갈색점무늬병(원인균: Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 복숭아 세균성구멍병(원인균: Xanthomonas arboricola pv. pruni), 키위 궤양병(원인균: Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 과수 화상병(원인균: Erwinia amylovora)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
또한 본 발명은 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
상기 균주는 수탁번호 KACC 81093BP로 기탁된 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주로 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 것일 수 있고, 상기 배양여액은 균주를 배양한 배양액을 물리적으로 여과한 것일 수 있다.
상기 식물병은 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes), 토마토잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 배추 검은무늬병(원인균: Alternaria brassicicola), 호접란 세균성갈색점무늬병(원인균: Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 복숭아 세균성구멍병(원인균: Xanthomonas arboricola pv. pruni), 키위 궤양병(원인균: Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 과수 화상병(원인균: Erwinia amylovora)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 식물은 벼, 토마토, 보리, 밀, 고추, 호접란, 복숭아, 키위, 배추, 사과나무 및 배나무로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주, 이의 배양액 또는 이의 배양여액에서 분리한 활성 물질의 단순 혼합물일 수 있다. 대안적으로는, 식물병 방제용 조성물은 상기 배양액 또는 상기 배양여액에서 분리한 활성 물질과 불활성 담체를 혼합하고, 상기 혼합물이 유제, 유액, 유동화제, 습윤성 분말, 과립화 습윤성 분말, 분말제, 과립제 등으로 제형화될 수 있도록 혼합물에 계면활성제 및 필요한 기타 보조제를 첨가함으로써 제조된다. 상기 언급된 식물병 방제용 조성물은 그 자체로서 또는 다른 불활성 성분을 첨가하여 본 발명은 종자 처리제로도 사용될 수 있다.
제형에서 사용될 수 있는 액체 담체의 예는 물; 알콜, 예로 메탄올 및 에탄올; 케톤, 예로 아세톤 및 메틸 에틸 케톤; 방향족 탄화수소, 예로 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 에틸벤젠 및 메틸타프탈렌; 지방족 탄화수소, 예로 헥산, 시클로헥산, 케로신 및 라이트 오일; 에스테르, 예로 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트; 니트릴, 예로 아세토니트릴 및 이소부티르니트릴; 에테르, 예로 디이소프로필에테르 및 디옥산; 산 아미드, 예로 N,N-디메틸 포름 아미드 및 N,N-디메틸아세트아미드; 할로겐화 탄화수소, 예로 디클로로메탄, 트리클로로에탄 및 사염화탄소; 디메틸 술폭시드; 및 식물성 오일, 예로 대두유 및 면실유가 포함될 수 있다.
제형에서 사용될 수 있는 고체 담체의 예는 미세 분말 또는 과립 예컨대 광물 예컨대 카올린 점토, 애터펄자이트 점토, 벤토나이트, 몬트모릴로나이트, 애시드 화이트 점토, 필로필라이트, 탈크, 규조토 및 탈사이트; 천연 유기 물질 예컨대 옥수수 잎대 분말 및 월넛 껍질 분말; 합성 유기 물질 예컨대 우레아; 염 예컨대 탄산 칼슘 및 황산 암모늄; 합성 무기 물질 예컨대 합성 수화 산화 규소를 포함하며; 액체 담체로서, 방향족 탄화수소 예컨대 자일렌, 알킬벤젠 및 메틸나프탈렌; 알코올 예컨대 2-프로판올, 에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 및 에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르; 케톤 예컨대 아세톤, 시클로헥사논 및 이소포론; 식물성 오일 예컨대 대두유 및 면실유; 석유 지방족 탄화수소, 에스테르, 디메틸술폭시드, 아세토니트릴 및 물을 포함할 수 있다.
계면활성제의 예는 음이온성 계면활성제 예컨대 알킬 술페이트 에스테르 염, 알킬아릴 술포네이트 염, 디알킬술포숙시네이트 염, 폴리옥시에틸렌 알킬아릴 에테르 포스페이트 에스테르 염, 리그노술포네이트 염 및 나프탈렌 술포네이트 포름알데히드 중축합물; 및 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬폴리옥시프로필렌 블럭 공중합체 및 소르비탄 지방산 에스테르 및 양이온성 계면활성제 예컨대 알킬트리메틸암모늄 염을 포함할 수 있다.
다른 제형 보조제의 예는 수용성 중합체 예컨대 폴리비닐 알코올 및 폴리비닐피롤리돈, 다당류 예컨대 아라비아 고무, 알길산 및 이의 염, CMC(카르복시메틸-셀룰로오스), 잔탄 고무, 무기 물질 예컨대 알루미늄 마그네슘 실리케이트 및 알루미나 졸(alumina sol), 보존제, 착색제 및 안정화제 예컨대 PAP(산 포스페이트 이소프로필) 및 BHT(부틸하이드록리톨루엔)를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 수탁번호 KACC 81093BP로 기탁된 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주, 이의 배양액 및 이의 배양여액으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상을 식물, 이의 종자 또는 이의 서식지에 처리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 식물병 방제 방법을 제공한다.
상기 처리는 조성물을 식물체에 직접 살포하거나, 식물체가 자라고 있는 토양에 살포하거나 식물체의 배양용 매개체에 살포하는 간접 살포일 수 있다.
본 발명의 방제 방법은 식물의 줄기 및 잎의 처리, 식물이 성장하는 장소(예를 들어 토양)의 처리, 종자 멸균/종자 코팅과 같은 종자의 처리 및 뿌리의 처리를 포함한다.
본 발명의 방제 방법으로의 줄기 및 잎의 처리로서, 특히, 예를 들어 줄기 및 잎에 분무하는 것과 같은 식물 표면 상의 적용이 포함될 수 있다. 본 발명의 방제 방법 가운데 토양의 처리로서, 예를 들어 토양 상 분무, 토양과의 혼합, 액체 처리계의 토양 내로의 살포 (액체 처리계의 관개, 토양 내로의 주입, 액체 처리제의 적하)가 포함될 수 있으며, 처리되는 장소의 예는 재식혈(planting hole), 고랑, 재식혈 주변, 심을골(planting furrow)주변, 성장 부위의 전체 표면, 토양과 식물 사이 부분, 뿌리 사이 부분, 식물체의 줄기 밑 부위, 주 고랑, 성장 토양, 못자리, 모 재배용 상자, 모 재배용 트레이, 모판을 포함한다. 처리는 살포 전, 살포 시, 살포 직후, 모의 재배 기간 동안, 재배 정착 전, 재배 정착시 및 재배 정착 후 성장 시기에 수행될 수 있다. 상기 언급한 토양 처리에서, 유효 성분이 식물에 동시에 적용될 수 있거나, 유효 성분을 함유하는 페이스트 비료와 같은 고체 비료가 토양에 적용될 수 있다. 유효 성분은 관개 액체 내에서 혼합될 수 있으며, 예를 들어 관개 시설(관개 튜브, 관개 파이프, 스프링클러 등) 에 주입되고, 고랑 사이 범람하는 액체 내에 혼합되거나, 수경 배치(water culture medium)에 혼합될 수 있다. 대안적으로는, 관개 액체 및 유효 성분은 사전에 혼합될 수 있고, 예를 들어 상기 언급된 관개 방법 및 살포 및 범람과 같은 다른 방법을 포함하는 적절한 관개 방법에 의한 처리에 사용될 수 있다.
본 발명의 방제 방법으로 휘발 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 식물을 배양하는 토양 및 식물의 배양을 위한 수경 배지, 모판 등의 매개물에 살포 처리하여 살포된 조성물의 휘발을 통해 식물체를 병충해로부터 보호되도록 하는 방법이며, 이외에도 상기 조성물을 식물체 주변에 거치시켜 휘발된 기체상태의 조성물에 식물체를 노출시킬 수 있다.
본 발명의 방제 방법으로의 종자 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 병충해로부터 보호되도록 종자를 처리하는 방법이며, 이의 특정 예는 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 현탁액을 미리 확보하고 종자 표면 상에 분무하는 분무 처리법; 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 습윤성 분말, 유액, 유동화제 등을 그 자체로 또는 소량의 물을 첨가하여 종자 표면 상에 적용하는 살포 처리법; 종자를 특정 기간 동안 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 용액 내에 함침시키는 함침 처리법; 필름 코팅 처리법 및 펠렛 코팅 처리법을 포함한다.
식물, 또는 식물 성장용 토양이 본 발명에 의한 화합물로 처리되는 경우, 처리량은 처리할 식물의 종류, 방제할 해충의 종류 및 발생 빈도, 제형 형태, 처리 기간, 기후 조건 등에 따라 변화할 수 있다.
유액, 습윤성 분말, 유동화제 등은 통상 물로 희석된 후 처리를 위해 살포된다. 이러한 경우, 유효 성분의 농도는 통상 0.0001 내지 3 중량 %, 바람직하게는 0.0005 내지 1 중량% 의 범위이다. 분말제, 과립제 등은 통상 희석없이 처리에 사용된다.
본 발명의 방제 방법은 논과 같은 경작지 또는 비경작지에서 사용될 수 있다.
상기 식물병은 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes), 토마토잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 배추 검은무늬병(원인균: Alternaria brassicicola), 호접란 세균성갈색점무늬병(원인균: Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 복숭아 세균성구멍병(원인균: Xanthomonas arboricola pv. pruni), 키위 궤양병(원인균: Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 과수 화상병(원인균: Erwinia amylovora)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 식물은 벼, 토마토, 보리, 밀, 고추, 호접란, 복숭아, 키위, 배추, 사과나무 및 배나무로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 한국화학연구원 실험포장의 토양으로부터 분리한 HK544 균주를 동정하여 농촌진흥청 농업유전자원센터에 특허균주(수탁번호: KACC81093BP)로 기탁하였다(도 1 참조).
또한 본 발명자들은 본 발명의 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주의 배양여액을 식물에 처리한 후, 식물병원성 곰팡이와 세균들에 대한 생장 억제활성을 조사한 결과, 배추 검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 고추탄저병균(Colletotrichum coccodes), 호접란 세균성갈색점무늬병균(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 복숭아 세균성구멍병균(Xanthomonas arboricola pv. pruni), 키위 궤양병균(Pseudomonas syringae pv. actinidiae)에 대한 생장 억제 효과를 가짐을 확인하였다(표 1 참조).
또한 본 발명자들은 상기 균주의 배양액 또는 배양여액을 식물에 처리한 후, 벼 도열병(병원균: Magnaporthe oryzae), 토마토 잿빛곰팡이병(병원균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(병원균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(병원균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(병원균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(병원균: Colletotrichum coccodes)에 대한 식물병 방제 효과를 확인한 결과, 본 발명의 균주의 배양액 또는 배양여액은 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 녹병 및 고추 탄저병에 대한 방제 효과를 가짐을 확인하였다(표 2 참조).
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 입체 이성질체를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학물은 이데인 B1(edeine B1)이다.
상기 화합물은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주에서 분리된 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 식물병은 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes), 토마토잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 배추검은무늬병(원인균: Alternaria brassicicola), 호접란 세균성갈색점무늬병(원인균: Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 복숭아 세균성구멍병(원인균: Xanthomonas arboricola pv. pruni), 키위 궤양병(원인균: Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 과수 화상병(원인균: Erwinia amylovora)일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 식물은 벼, 토마토, 보리, 밀, 고추, 호접란, 복숭아, 키위, 배추, 사과나무 및 배나무로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 조성물은 식물병 방제 활성을 가질 수 있다.
상기 화합물은 농약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있고, 농약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 이용하여 식물병 방제 방법을 제공한다.
상기 처리는 조성물을 식물체에 직접 살포하거나, 식물체가 자라고 있는 토양에 살포하거나 식물체의 배양용 매개체에 살포하는 간접 살포일 수 있다.
본 발명의 방제 방법은 식물의 줄기 및 잎의 처리, 식물이 성장하는 장소(예를 들어 토양)의 처리, 종자 멸균/종자 코팅과 같은 종자의 처리 및 뿌리의 처리를 포함한다.
본 발명의 방제 방법으로의 줄기 및 잎의 처리로서, 특히, 예를 들어 줄기 및 잎에 분무하는 것과 같은 식물 표면 상의 적용이 포함될 수 있다. 본 발명의 방제 방법 가운데 토양의 처리로서, 예를 들어 토양 상 분무, 토양과의 혼합, 액체 처리계의 토양 내로의 살포 (액체 처리계의 관개, 토양 내로의 주입, 액체 처리제의 적하)가 포함될 수 있으며, 처리되는 장소의 예는 재식혈(planting hole), 고랑, 재식혈 주변, 심을골(planting furrow)주변, 성장 부위의 전체 표면, 토양과 식물 사이 부분, 뿌리 사이 부분, 식물체의 줄기 밑 부위, 주 고랑, 성장 토양, 못자리, 모 재배용 상자, 모 재배용 트레이, 모판을 포함한다. 처리는 살포 전, 살포 시, 살포 직후, 모의 재배 기간 동안, 재배 정착 전, 재배 정착시 및 재배 정착 후 성장 시기에 수행될 수 있다. 상기 언급한 토양 처리에서, 유효 성분이 식물에 동시에 적용될 수 있거나, 유효 성분을 함유하는 페이스트 비료와 같은 고체 비료가 토양에 적용될 수 있다. 유효 성분은 관개 액체 내에서 혼합될 수 있으며, 예를 들어 관개 시설(관개 튜브, 관개 파이프, 스프링클러 등) 에 주입되고, 고랑 사이 범람하는 액체 내에 혼합되거나, 수경 배치(water culture medium)에 혼합될 수 있다. 대안적으로는, 관개 액체 및 유효 성분은 사전에 혼합될 수 있고, 예를 들어 상기 언급된 관개 방법 및 살포 및 범람과 같은 다른 방법을 포함하는 적절한 관개 방법에 의한 처리에 사용될 수 있다.
본 발명의 방제 방법으로 휘발 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 식물을 배양하는 토양 및 식물의 배양을 위한 수경 배지, 모판 등의 매개물에 살포 처리하여 살포된 조성물의 휘발을 통해 식물체를 병충해로부터 보호되도록 하는 방법이며, 이외에도 상기 조성물을 식물체 주변에 거치시켜 휘발된 기체상태의 조성물에 식물체를 노출시킬 수 있다.
본 발명의 방제 방법으로의 종자 처리법은, 예를 들어 본 발명의 식물병 방제용 조성물로 병충해로부터 보호되도록 종자를 처리하는 방법이며, 이의 특정 예는 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 현탁액을 종자 표면 상에 분무하는 분무 처리법; 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 습윤성 분말, 유액, 유동화제 등을 그 자체로 또는 소량의 물을 첨가하여 종자 표면 상에 적용하는 살포 처리법; 종자를 특정 기간 동안 본 발명의 식물병 방제용 조성물의 용액 내에 함침시키는 함침 처리법; 필름 코팅 처리법 및 펠렛 코팅 처리법을 포함한다.
식물, 또는 식물 성장용 토양이 본 발명에 의한 화합물로 처리되는 경우, 처리량은 처리할 식물의 종류, 방제할 해충의 종류 및 발생 빈도, 제형 형태, 처리 기간, 기후 조건 등에 따라 변화할 수 있다.
유액, 습윤성 분말, 유동화제 등은 통상 물로 희석된 후 처리를 위해 살포된다. 이러한 경우, 유효 성분의 농도는 통상 0.0001 내지 3 중량 %, 바람직하게는 0.0005 내지 1 중량% 의 범위이다. 분말제, 과립제 등은 통상 희석없이 처리에 사용된다.
본 발명의 방제 방법은 논과 같은 경작지 또는 비경작지에서 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주의 배양여액을 부탄올 및 아세톤으로 순차적으로 분획하여 얻은 분획물로부터 화학식 1로 표시되는 이데인 B1(edeine B1)를 분리하였다(도 4 및 5 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 분리한 이데인 B1(edeine B1)이 식물병원성 곰팡이 배추검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 고추탄저병균(Colletotrichum coccodes), 벼도열병균(Magnaporthe oryzae), 토마토역병균(Phytophthora infestans) 및 식물병원성 세균인 과수화상병균(Erwinia amylovora)에 대해 우수한 살균활성 효과를 가짐을 확인하였다(표 4 참조).
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> HK544 균주의 분리
HK544 균주를 분리하기 위하여 한국화학연구원 실험포장의 토양으로부터 토양시료를 채취하여 물과 혼합하였다. 25 ㎛체를 이용하여 찌꺼기를 거른 다음 현탁액 0.1 ㎖을 취하여 1/10 농도의 TSA 희석배지(1/10 strength tryptic soy agar; 0.17% tryptone, 0.03% soytone, 0.025% dextrose, 0.05% NaCl, 0.25% K2HPO4, 1.5% agar)에 도말한 후, 25℃ 배양기에서 3일간 배양하였다. 분리한 세균은 3번의 계대배양을 통해 단일 콜로니를 획득하였으며, HK544 균주로 명명하였다. 이후 실험에 사용할 때까지, HK544 균주는 멸균한 20% 글리세롤(glycerol) 수용액에 침지하여 -80°에 보관하였다.
<실시예 2> HK544 균주의 분자생물학적 동정
본 발명에 사용한 HK544 균주는 TSA(tryptic soy agar; 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K2HPO4, 1.5% agar) 배지에 배양하였을 때 아이보리색의 슬라임 형태의 균총을 형성한다(도 1). HK544 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 바탕으로 분자계통학적 분석을 실시하였다. HK544 균주를 TSA 배지에 접종하여 25°에서 2일 동안 150 rpm으로 진탕배양하여 얻은 균체로부터 CTAB 버퍼를 사용한 다음 DNA 추출법을 사용하여 KH544 균주의 DNA(100 ng/㎕)를 얻었다. 상기 DNA를 주형으로 한쌍의 유니버셜 프라이머 세트(27F, 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'; 1492R, 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')와 Ex Taq polymerase(Takara, Otsu, Japan)를 사용한 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 이용하여 16S rRNA 유전자 단편을 얻었다. 0.8% 아가로즈 젤(agarolse gel)에서 확인된 밴드는 GeneAll Expin PCR purification kit (GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 정제한 후, 염기서열 분석을 위해 시퀀싱 분석 서비스(Macrogen, Daejeon, Korea)를 이용하였다.
그 결과, 서열번호 1의 16S rRNA 유전자 염기서열을 얻었으며(서열번호 1), NCBI BLASTn (http://www.ncbi. nlm.nih.gov) 데이터베이스에 등록된 다른 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열과 비교 분석하였다. MEGA 4.0 프로그램을 이용하여 Clustal W로 염기서열을 정렬한 다음, 유전자 간의 유사도를 근린 결합법에 의한 계통수(neighbor-joining tree)로 작성하였다(Saitou와 Nei, 1987). 분자계통도는 거리행렬법 중의 하나인 Neighbour-joining 방법을 사용하여 구성하였으며, Bootstrap 분석(1,000 회)은 MEGA 프로그램의 알고리즘을 이용하여 수행하였다.
[서열번호 1]
AGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAGTGTCTTCGGACCCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTCTCAGACTGGGATAACATAGGGAAACTTATGCTAATACCGGATAGGTTTTTGGATCGCATGATCCGAAAAGAAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTGGGAGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTCCACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAACGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGTTCTGTTGTTAGGGACGAATAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTGACGAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTATGTAAGTCTGGTGTTAAAGCCCGGAGCTCAACTCCGGTTCGCATCGGAAACTGTGTAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGCGGTATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGGGGTTTCAATACCCTCAGTGCCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGCTCGCAAGAGTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGCTGACCGCTCTGGAGACAGAGCTTCCCTTCGGGGCAGCGGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGTCGACAAGACGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTTGGTACAACGGGATGCTACCTCGCGAGAGGACGCCAATCTCTTAAAACCAATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGTAGATGACTGGGGTGAAGTCGTA
16S rRNA 유전자 염기서열 분석 결과 HK544 균주는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) DSM 5760 균주와 같은 그룹을 형성하였고(도 2), 높은 상동성(99.9% 이상)을 나타냈다. 이러한 결과를 바탕으로 HK544 균주를 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis)로 동정하였고, 농촌진흥청 농업유전자원센터에 특허균주(수탁번호: KACC81093BP)로 기탁하였다.
<실시예 3> HK544 균주의 배양액, 배양여액 및 이들의 희석액의 제조
브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주를 TSA 배지(1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K2HPO4, 1.5% agar)에서 배양한 다음, TSA 한천배지에 형성된 균총을 면전으로 밀봉하여 멸균한 200 ml의 TSB 배지(tryptic soy broth; tryptic soy agar; 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K2HPO4)가 담긴 1 L-삼각플라스크에 접종하고, 2일 동안 25˚C에서 진탕배양(150 rpm)하여 전배양액을 제조하였다. 전배양액을 새로운 400 ml의 TSB 배지가 담긴 2 L-삼각플라스크에 1% 접종하고, 접종 후 3일 동안 25˚C에서 진탕배양(150 rpm)하여 HK544 배양액을 제조하였다.
또한, 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주 배양액을 원심분리(10,000 ×g, 20 min)한 후 여과지(Whatman No.1)로 걸러서 배양여액을 제조하였다. 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주 배양액 또는 배양여액을 증류수에 10%, 20%, 30% 농도로 희석한 시료를 식물병 방제 시험에 사용하였다.
<실험예 1> HK544 균주 배양여액의 in vitro 살균활성 효과
상기 실시예 3에 의해 제조된 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주 배양여액을 식물병원성 곰팡이인 배추검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 고추탄저병균(Colletotrichum coccodes), 벼도열병균(Magnaporthe oryzae), 토마토역병균(Phytophthora infestans)과 식물병원성 세균인 호접란세균성갈색점무늬병균(Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 과수뿌리혹병균(Agrobacterium tumefaciens), 세균성벼알마름병균(Burkholderia glumae), 고추궤양병균(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 세균성무름병균(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum), 복숭아세균성구멍병균(Xanthomonas arboricola pv. pruni), 키위궤양병균(Pseudomonas syringae pv. actinidiae) 등에 대한 생장 억제활성을 96-웰 플레이트를 사용한 액체배지미량희석법으로 최소억제농도(MIC)를 결정하였다.
100 μl 웰에 곰팡이의 경우 포자가 1 ×104 spores/ml 또는 세균의 경우 1 ×103 baceterial cells/ml의 농도로 포함하도록 각각 배양하였다. 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주 배양여액이 1.3%, 2.5%, 5%, 10%, 20%의 농도가 되도록 각 웰에 처리하였다. 이 때 무처리구로 멸균수를 사용하였다. 2-3일 동안 미생물 생장이 최적인 온도에서 배양한 다음 육안으로 관찰했을 때, 곰팡이의 생장이 완전히 억제되는 농도를 최소억제농도(MIC)로 결정하였다.
식물병원균 최소억제농도(%)
Alternaria brassicicola 1.3
Botrytis cinerea 1.3
Colletotrichum coccodes 1.3
Magnaporthe oryzae >20
Phytophthora infestans >20
Acidovorax avenae subsp. cattleyae 10
Agrobacterium tumefaciens >20
Burkholderia glumae >20
Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis >20
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum >20
Dickeya chrysanthemi >20
Pseudomonas syringae pv. lachrymans >20
Xanthomonas arboricola pv. pruni 20
Pseudomonas syringae pv. actinidiae 20
Ralstonia solanacearum >20
그 결과, 표 1에서 나타난 바와 같이, HK544 균주의 배양여액은 1.3% 농도에서 배추검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 고추탄저병균(Colletotrichum coccodes)을 완전히 억제하는 in vitro 살균활성을 나타내었다. 또한, 10―20% 농도의 HK544 균주 배양여액은 3종의 식물병원성 세균(A. avenae subsp. cattleyae, X. arboricola pv. pruni, P. syringae pv. actinidiae)의 생장을 완전히 억제하는 활성을 나타내었다.
<실험예 2> HK544 균주의 배양액, 배양여액 및 이들의 희석액의 식물병 방제효과 확인
상기 실시예 3에서 제조한 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주의 배양액, 배양여액 및 이들의 희석액을 대상으로 6가지 주요 식물병인 벼 도열병(병원균: Magnaporthe oryzae), 토마토 잿빛곰팡이병(병원균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(병원균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(병원균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(병원균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(병원균: Colletotrichum coccodes)에 대한 식물병 방제 효과를 온실 조건에서 확인하였다.
식물병 방제효과를 평가하기 위해 0.025% (w/v) 트윈 20(Tween 20)을 전착제로서 시료에 첨가하였고, 이때 무처리구는 0.025% (w/v) 트윈 20 수용액을 사용하였다. 시료를 벼, 토마토, 밀, 보리 및 고추 유묘에 분무처리하고, 1일 후 각각의 병원균을 접종하여 배양액 또는 배양여액의 식물병 방제활성을 조사하였다.
구체적으로, 각 식물병 당 4개의 포트를 이용하였고, 시료를 엽면에 분무 살포한 후 24시간 동안 풍건한 다음 각각의 식물 병원균을 접종하였다. 실험에 사용한 벼, 토마토, 보리 및 밀 식물은 지름 4.5 ㎝의 플라스틱 포트에 수도용 상토 또는 원예용 상토를 70% 정도 채운 다음, 종자를 파종하여 25℃의 온실에서 1주 내지 4주간 재배하였다.
토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병은 접종 3일 후, 벼 도열병은 접종 5일 후, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병은 접종 7일 후에 병반면적율(%)을 조사하였다. 고추 탄저병에 대한 방제활성 실험을 위해서 습실상에서 2일간 발병시킨 후 25℃의 항온실에 1일간 방치하였고, 접종 3일 후에 병반면적율(%)을 조사하여 다음과 같은 식에 대입하여 방제가(%)를 구하였다.
방제가(%) = [1 - (처리구의 병반면적율 / 무처리구의 병반면적율)] ×100
　 농도(%) 병방제가(%)
RCBa TGM TLB WLR BPM PAN
배양액 10 14 99 92 60 0 63
20 14 100 87 43 0 58
30 14 96 84 80 17 92
배양여액 10 0 97 95 0 0 47
20 0 98 95 10 0 79
30 0 98 95 53 0 82
aRCB, 벼 도열병; TGM, 토마토 잿빛곰팡이병; TLB, 토마토 역병; WLR, 밀 붉은녹병; BPM,
보리흰가루병; PAN, 고추탄저병
그 결과, 표 2에서 나타난 바와 같이, HK544 균주의 배양액 또는 배양여액은 10% 농도에서도 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병을 90% 이상 방제하는 우수한 방제활성을 보였으며, 밀 붉은녹병 및 고추 탄저병에 대한 방제활성을 나타냈다. HK544 균주의 배양액 또는 배양여액은 30% 농도에서 고추 탄저병을 80% 이상 방제하는 효과를 나타냈고, 이는 합성농약 다이티아논(dithianon)을 50 μg/ml 농도로 처리한 효과에 준하였다(도 3). 또한 HK544 균주의 배양액과 배양여액은 30% 농도에서 밀 붉은녹병을 각각 80%와 53% 방제하는 효과를 나타냈다.
<실시예 4> HK544 균주의 배양여액으로부터 살균활성 물질의 분리
브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주를 TSA 배지(1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K2HPO4, 1.5% agar)에서 배양한 다음, TSA 배지에 형성된 균총을 면전으로 밀봉하여 멸균한 200 ml의 TSB 배지(tryptic soy broth; tryptic soy agar; 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K2HPO4)가 담긴 1 L 삼각플라스크에 접종하고, 2일 동안 25˚C에서 진탕배양(150 rpm)하여 전배양액을 제조하였다. 전배양액을 새로운 400 ml의 TSB 배지가 담긴 2 L 삼각플라스크 10개에 1%씩 접종하고, 접종 후 3일 동안 25˚C에서 진탕배양(150 rpm)하여 HK544 배양액(4 L)를 제조하였다. 이후, 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주 배양액을 원심분리(10,000 ×g, 20 min)한 후 여과지(Whatman No.1)로 걸러서 배양여액을 제조하였다.
HK544 배양여액(4 L)을 폴리스티렌 수지(Diaion HP-20, Mitsubishi Chemicals)이 충진된 컬럼(column; Φ 8 cm ×40 cm)에 로딩하고, 20%, 40%, 60%, 80%, 100% 메탄올수용액으로 순차적으로 1 L씩 용출시키고, 마지막으로 100% 아세톤(1 l)으로 용출시켜 F1―F6의 6개 분획물을 제조하였고, 각 분획물을 5% 농도로 고추 탄저병균(Colletotrichum coccodes)에 처리했을 때, F4 분획물이 강한 살균활성이 나타나는 것을 확인하였다.
F4 분획물(2 g)을 C18 수지(LiChroprep RP-18, Merck)가 충진된 컬럼(Φ 4 cm ×20 cm)에 로딩하고 진공펌프를 사용하여 20%, 40%, 50%, 60%, 70%, 90%, 100% 메탄올수용액(0.l% 개미산 포함)으로 용출시켜 F41―F47의 7개 분획물을 제조하였고, 각 분획물을 200 μg/ml 농도로 고추탄저병균에 처리했을 때, F41 분획물에서 강한 살균활성이 나타나는 것을 확인하였다
F41 분획물(200 mg)을 소량의 물에 녹여서 교차결합 덱스트란(cross-linked dextran) 수지(Sephadex LH-20, Merck)가 충진된 컬럼(XK16/100, GE Healthcare)에 로딩하고 분당 0.1 ml의 유속으로 물을 통과시켜 나온 분획물을 2 ml씩 분취하였고, 각 분획물을 25 μg/ml 농도로 처리했을 때, 분획물 58번―62번에서 활성이 나타나는 것을 확인하였다.
58번―62번 분획물의 1H-NMR 스펙트럼이 동일함을 확인하였고, 이를 합쳐서 117 mg의 화합물 1을 정제하였다. 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주 배양여액으로부터 살균활성 물질의 분리정제 순서 도 4와 같다.
<실시예 5> HK544 배양여액으로부터 분리한 살균활성 물질의 화학구조 동정
화합물 1의 화학구조 결정을 위하여 MS와 NMR 분석을 실시하기 위해 화합물 1을 D2O(99.9 atom% D; Cambridge Isotope Laboratories)에 녹여 Bruker Avance 500 MHz 핵자기공명장치에서 1H-과 13C-NMR 스펙트럼과 COSY, HSQC, HMBC 스펙트럼을 분석하였다. 그리고 ESI-MS 질량분석기(Waters)를 사용하여 화합물의 분자량을 측정하였다.
carbon chemical shift (ppm)
δ C,type δ H(JinHz)
1 51.5, CH 4.64 dt (7.5, 3.9)
2 56.4, CH2 2.92 ddd (15.1, 8.2, 3.0); 3.0 m
3 172.5, CO 　
4 43.3, CH2 3.27 dt (6.7, 2.0); 3.44 m
5 71.2, CH 4.09 m
6 175.9, CO 　
7 48.2, CH 4.71 dt (8.1, 4.0)
8 170.3, CO 　
9 52.8, CH 4.14 m
10 32.1, CH2 1.56 m; 1.69 m
11 22.6, CH2 1.26 m; 1.38 m
12 27.6, CH2 1.52 m; 1.76 m
13 56.2, CH 3.27 dt (6.7, 2.0)
14 68.5, CH 4.29 ddt (10.2, 6.9, 3.6)
15 39.0, CH2 2.42 m
16 174.4, CO 　
17 43.5, CH2 3.87 d (2.5)
18 172.8, CO 　
19 37.1, CH2 3.18 t (6.8)
20 26.6, CH2 1.60 m; 1.76 m
21 40.1, CH2 3.0 m
22 43.7, CH2 3.0 m
23 26.1, CH2 1.52 m; 1.60 m
24 23.9, CH2 1.52 m; 1.60 m
25 46.0, CH2 3.0 m
26 157.5, C 　
27 41.5, CH2 3.34 dq (7.5, 3.7); 3.35 dq (14.5, 5.5)
28 179.4, CO 　
1' 127.9, C 　
2',6' 129.8, (CH)2 8.55 d (8.5)
3',5' 117.0, (CH)2 6.9 d (8.5)
4' 157.8, C 　
그 결과, 화합물 1은 ESIMS에서 m/z 797 [M + H]+, m/z 819 [M + Na]+, m/z 836 [M + K]+의 양이온으로 검출되었으며, 분자량은 MW 796으로 결정하였다(도 5). 표 3에 나타난 바와 같이, 화합물 1의 13C-NMR 스펙트럼에서 6개의 카보닐 탄소(δ C 179.4, 175.9, 174.4, 172.8, 172.5, 170.3, 157.8), 3개의 쿼터너리 sp2(δ C 157.8, 157.5, 127.9), 4개의 메틴 sp2(δ C 129.8, 117.0; superimposed), 6개의 메틴 sp3(δ C 71.2, 68.5, 56.2, 52.8, 51.5, 48.2), 15개의 메틸렌 sp2(δ C 56.4, 46.0, 43.7, 43.5, 43.3, 41.5, 40.1, 39.0, 37.1, 32.1, 27.6, 26.6, 26.1, 23.9, 22.6) 시그널이 나타났다(표 3). 1H-1H COSY, HSQC, HMBC 분석을 통해 수소 시그널의 위치를 결정하였고, 표 3의 1H-와 13C-NMR 스펙트럼과 문헌 데이터를 종합하여, 화합물 1의 화학구조를 선형 펩타이드 항생물질 이데인 B1(edeine B1)으로 결정하였다(도 6).
<실험예 3> 다양한 식물병원균에 대한 이데인 B1(edeine B1)의 in vitro 살균활성
이데인 B1(edeine B1)의 식물병원성 곰팡이 배추검은무늬병균(Alternaria brassicicola), 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 고추탄저병균(Colletotrichum coccodes), 벼도열병균(Magnaporthe oryzae),토마토역병균(Phytophthora infestans) 및 식물병원성 세균 과수화상병균(Erwinia amylovora)에 대한 생장 억제활성을 96-웰 플레이트를 사용한 액체배지미량희석법으로 최소억제농도(MIC)를 결정하였다.
100 μl 웰에 곰팡이의 경우 포자가 1 Х104 spores/ml 또는 세균의 경우 1 Х103 bacterial cells/ml의 농도로 포함하도록 배양하고, 이데인 B1(edeine B1)가 각각 0.1, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/ml의 농도가 되도록 준비하였다. 이 때 메탄올의 함량은 1% 미만이었고, 1% 메탄올만 첨가한 것을 무처리구로 사용하였고, 항생물질 사이클로헥사마이드(cycloheximide)와 옥시테트라사이클린(oxytetracycline)를 식물병원성 곰팡이와 세균에 대한 각각의 양성대조군으로 사용하였으며, 2-3일 동안 미생물 생장이 최적인 온도에서 배양한 다음 육안으로 관찰했을 때, 곰팡이와 세균의 생장이 완전히 억제되는 농도를 최소억제농도(MIC)로 결정하였다.
식물병원성 미생물 최소억제농도(μg/ml)
이데인B1 사이클로
헥사마이드		 옥시테트라
사이클린
곰팡이 Alternaria brassicicola 0.4 12.5 na
Botrytis cinerea 1.6 100 na
Colletotrichum coccodes 12.5 50 na
Magnaporthe oryzae 12.5 1.6 na
Phytophthora infestans 0.1 0.2 na
세균 Erwinia amylovora 1.6 na 1.6
na, not analyzed
그 결과, 표 4에서 나타난 바와 같이, 이데인 B1(edeine B1)는 다양한 식물병원성 곰팡이에 광범위한 항균활성을 나타내었다. 구체적으로, 이데인 B1(edeine B1)는 배추검은무늬병균(Alternaria brassicicola)을 0.4 μg/ml의 농도에서, 토마토잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea)을 1.6 μg/ml의 농도에서, 고추탄저병균(Colletotrichum coccodes)을 12.5 μg/ml의 농도에서, 벼도열병균(Magnaporthe oryzae)을 12.5 μg/ml의 농도에서, 토마토역병균(Phytophthora infestans)을 0.1 μg/ml의 농도에서 완전히 억제하는 광범위한 항균활성이 나타났고, 이는 방선균 유래 천연항생물질 사이클로헥사마이드(cycloheximide) 보다 효과가 좋음을 나타낸다. 또한, 이데인 B1(edeine B1)는 식물병원성 세균인 과수화상병균(Erwinia amylovora)을 1.6 μg/ml의 농도에서 완전히 억제하는 살세균활성이 나타났고, 이는 항생물질 옥시테트라사이클린(oxytetracycline)과 유사한 효과를 나타낸다.
<실험예 4> HK544 균주와 근연관계에 있는 균주들간의 살균활성 비교
HK544 균주의 근연관계에 있는 균주들간의 살균활성 비교를 위하여 국립농업과학원 미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection; KACC)로부터 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) ATCC 8186, 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) ATCC 8185, 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) DSM 30, 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus reuszeri) DSM 9887, 브레비바실러스 속(Brevibacillus sp.) FMR09-05, 브레비바실러스 파나치후미(Brevibacillus panachihumi) DCY35, 브레비바실러스 보르스테렌시스(Brevibacillus borstelensis) DSM 6347, 브레비바실러스 파라브레비스(Brevibacillus parabrevis) NBRC 12334, 브레비바실러스 조시넨시스(Brevibacillus choshinensis) DSM 8552, 브레비바실러스 아그리(Brevibacillus agri) DSM 6348, 브레비바실러스 포르모수스(Brevibacillus formosus) DSM 9885를 분양 받았다.
분양받은 균주는 TSA(tryptic soy agar; 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K2HPO4, 1.5% agar) 배지에서 배양한 다음, 한천배지에 형성된 단일균총을 면전으로 밀봉하여 멸균한 50 ml의 TSB 배지(tryptic soy broth; tryptic soy agar; 1.7% tryptone, 0.3% soytone, 0.25% dextrose, 0.5% NaCl, 2.5% K2HPO4)가 담긴 250 ml-삼각플라스크에 접종하고, 3일 동안 25˚C에서 진탕배양(150 rpm)하여 배양액을 제조하였고, 원심분리(10,000 ×g, 20 min)한 다음 여과지(Whatman No.1)로 걸러서 배양여액을 제조하였다. 96-웰 플레이트에 브레비바실러스(Brevibacillus sp.) 균주 배양여액을 5% 또는 10% 농도로 첨가한 YPG 배지(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose)를 사용하여 효모균(Saccharomyces cerevisiae)에 대한 브레비바실러스(Brevibacillus sp.) 균주의 항균활성을 평가하였다. 무처리구에는 살균된 증류수를 사용하였다.
YPG 배지(5 ml)에 효모균(Saccharomyces cerevisiae)의 균총을 접종 후, 30°에서 1일 동안 진탕배양(150 rpm)한 효모균을 접종원으로 사용했고, UV/Vis 분광분석기로 측정했을 때, 600 nm에서의 흡광도가 0.3이 되도록 멸균한 증류수로 희석하였다. 효모균 현탁액은 96-웰 플레이트에 1% 농도로 접종하였다. 효모균 접종 후 30°에서 1일 배양한 후 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 효모균의 생장을 조사하였다. 다음과 같은 식에 대입하여 효모균의 생장억제율(%)을 조사하였다.
생장억제율 (%) = (1 - 처리구의 OD600 값 / 무처리구의 OD600 값) ×100
시험 미생물 배양여액농도(%) 효모균에대한생장억제(%)
B. brevis HK544 10 93 ±3
5 6 ±1
B. brevis ATCC8186 10 1 ±1
5 2 ±1
B. brevis ATCC8185 10 1 ±0
5 1 ±1
B. brevis DSM30 10 0
5 1 ±1
B. reuszeri DSM9887 10 0
5 1 ±1
Brevibacillus sp.FMR09-05 10 3 ±0
5 4 ±1
B. panacihumi DCY35 10 1 ±1
5 4 ±1
B. borstelensis DSM6347 10 0
5 2 ±2
B. parabrevis NBRC12334 10 1 ±0
5 3 ±1
B. choshinensis DSM8552 10 1 ±0
5 2 ±1
B. agri DSM6348 10 0
5 2 ±2
B. formosus DSM9885 10 0
5 0
그 결과, 표 5에서 나타난 바와 같이, 시험한 12종의 브레비바실러스(Brevibacillus) 배양여액 가운데 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주의 배양여액의 살균활성이 가장 우수했다. HK544 균주의 배양여액을 10% 농도로 처리했을 때, 무처리구 대비 효모균의 생장이 93% 저해되었으나, 다른 균주들은 효모균의 생장을 억제하는 효과가 없었다.
다른 종의 브레비바실러스(Brevibacillus) 뿐만이 아니라 동일 종인 ATCC 8186, ATCC8185, DSM 30의 배양여액들도 살균활성이 나타나지 않았다. 이는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주의 살균기작은 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) 종에서 보편적으로 나타나는 특성이 아니라, 개체(strain 또는 isolate) 수준에서 나타나는 HK544 균주의 고유한 특성임을 시사한다.
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Claims (7)

  1. 수탁번호 KACC 81093BP로 기탁된 식물병 방제 활성을 나타내는 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주.
  2. 제1항의 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) HK544 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 식물병은 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes), 토마토잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 배추검은무늬병(원인균: Alternaria brassicicola), 호접란세균성갈색점무늬병(원인균: Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 복숭아세균성구멍병(원인균: Xanthomonas arboricola pv. pruni), 키위 궤양병(원인균: Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 과수 화상병(원인균: Erwinia amylovora)으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나인 것인 식물병 방제용 조성물.
  4. 제 2항의 식물병 방제용 조성물을 식물 또는 식물의 주변환경에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법.
  5. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 입체 이성질체를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00002
    .
  6. 제5항에 있어서,
    상기 식물병은 벼 도열병(원인균: Magnaporthe oryzae), 토마토 역병(원인균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(원인균: Puccinia triticina), 보리 흰가루병(원인균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 고추 탄저병(원인균: Colletotrichum coccodes), 토마토잿빛곰팡이병(원인균: Botrytis cinerea), 배추검은무늬병(원인균: Alternaria brassicicola), 호접란세균성갈색점무늬병(원인균: Acidovorax avenae subsp. cattleyae), 복숭아세균성구멍병(원인균: Xanthomonas arboricola pv. pruni), 키위 궤양병(원인균: Pseudomonas syringae pv. actinidiae), 과수 화상병(원인균: Erwinia amylovora)으로 구성되는 군에서 선택된 어느 하나인 것인 식물병 방제용 조성물.
  7. 제 5항의 식물병 방제용 조성물을 식물 또는 식물의 주변환경에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법.
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