KR20100116023A

KR20100116023A - 슈도모나스 제니큘라타 ｍｈ102 균주 및 이를 이용한 식물병 방제방법

Info

Publication number: KR20100116023A
Application number: KR1020090034732A
Authority: KR
Inventors: 최경자; 김진철; 장경수; 최용호; 조수정
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2009-04-21
Filing date: 2009-04-21
Publication date: 2010-10-29
Also published as: KR100997677B1

Abstract

본 발명은 신규 슈도모나스 제니큘라타(Pseudomonas geniculata) MH102 균주, 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물, 및 이를 이용한 식물병의 생물학적 방제방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주는 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 토마토 역병 및 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 파이토프토라 캅사이시(Phytophthora capsici), 또는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 의해 발생하는 다양한 식물병에 대하여 우수한 방제효과를 나타내어, 작물의 식물병을 효과적으로 방제할 수 있다.

Description

슈도모나스 제니큘라타 ＭＨ102 균주 및 이를 이용한 식물병 방제방법{PSEUDOMONAS GENICULATA MH102 STRAIN AND METHOD FOR THE BIOLOGICAL CONTROL OF PLANT DISEASES USING SAME}

본 발명은 다량의 키티나아제를 생산하고 다양한 식물병원균에 대해 살균활성을 나타내는 신규 슈도모나스 제니큘라타(Pseudomonas geniculata) MH102 균주, 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물, 및 이를 이용한 식물병의 생물학적 방제방법에 관한 것이다.

근대 과학의 산물인 농약은 농업생산성을 증대하여 인류를 기아로부터 해방시키는데 크게 기여하여 왔다. 하지만 최근에 합성 농약의 오ㆍ남용으로 인한 인ㆍ축 독성 및 환경오염에 대한 사회적 관심이 크게 증가하고 있고, 인간의 삶의 질을 중요시하는 웰빙 시대가 도래함에 따라 합성 농약 사용량을 줄이거나 농약을 사용하지 않고 작물을 재배한 친환경 농산물에 대한 수요가 증가하고 있다. 또한 농민의 입장에서도 수입 자유화로 가격이 저렴한 국외 농산물이 많이 수입되고 있어 그 대안으로 단위 면적 당 소득이 높은 유기농 재배를 선호함에 따라 친환경 농산물 재배 면적이 점차 증가하고 있다.

생물농약에는 미생물을 이용하여 식물병, 해충 및 잡초를 방제하는 미생물농약과, 식물 혹은 미생물이 생산하는 천연물을 이용하는 생화학농약이 있다. 미생물농약의 경우, 현재 개발된 제품의 수가 너무 적고 그나마 개발된 제품들도 적용 병해 범위가 일부 식물병에 한정되어 있어 다양한 병 방제에 어려움이 있다. 따라서 우리나라는 미생물 살균제 제품을 수입하여 사용하고 있으며, 제품 생산 기술 및 마케팅 능력 부족으로 아직 해외로 수출하는 미생물 살균제는 없다. 따라서 다양한 식물병을 효과적으로 방제할 수 있는 새로운 생물적 방제제의 개발이 요구된다.

슈도모나스 속 세균, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa), 슈도모나스 아우레오파시엔스(P. aureofaciens), 슈도모나스 푸티다(P. putida), 슈도모나스 피로시니아(P. pyrrocinia) 등을 이용하여 식물병을 방제하고자 하는 연구가 활발히 진행되어 왔다(de Weger 등, J. Bacteriol. 1986, 165: 585-594). 이들은 주로 페나진-1-카복실산(phenazine-1-carboxylic acid), 피오시아닌(pyocyanin), 2-아세트아미도페놀(2-acetamidophenol), 피롤니트린(pyrrolnitrin), 피오루테오린(pyoluteorin), 2,4-디아세틸플로로글루치놀(2,4-diacetylphloroglucinol), 비스코시나미드(viscosinamide), 텐신(tensin) 등과 같은 살균활성 물질을 생산하여 식물병을 방제한다고 알려져 있다(Sunish Kumar 등, J. Appl. Microbiol. 2005, 98: 145- 154). 이들 항균물질 중 피롤니트린은 유도체 합성을 통하여 플루디옥소닐(fludioxonil)과 펜피클로닐(fenpiclonil) 살균제 개발에 이용된 바 있다(Ligon 등, Pest. Manag. Sci. 2000, 56: 688-695). 또한, 슈도모나스 속 중 슈도모나스 아우레오파시엔스 Tx-1, 슈도모나스 세파치아(P. cepacia), 슈도모나스 클로로라피스(P. chlororaphis), 슈도모나스 플루오레센스, 슈도모나스 시린게(P. syringae) ESC-10 등은 생물농약 살균제로 상품화되어 판매되고 있으나, 식물병을 방제할 수 있는 살균활성을 가진 본 발명의 슈도모나스 제니큘라타(P. geniculata) 균주는 보고된 바 없다.

한편, 지구상에서 섬유소 다음으로 풍부한 바이오매스(biomass)인 키틴은 N-아세틸-β-D-글루코사민(NAG)이 β-1,4형으로 결합된 천연고분자 물질로서, 분자량은 약 1X10⁶ 정도이다. 키틴은 게, 크릴새우, 보리새우 등과 같은 갑각류와 거미, 개미, 메뚜기 등과 같은 곤충의 외피를 구성하는 주성분이며, 미생물에서는 녹조류, 효모, 사상균 등의 세포벽 성분으로 존재한다. 물속 생물권에서는 매년 100억톤 이상의 키틴이 생산되는 것으로 추정하고 있다.

이러한 키틴 특히 키틴 분해산물인 키틴 올리고당은 항균작용, 항암작용, 면역강화작용, 병원성 진균병에 대한 저항성 유도작용, 유산균 증식 촉진작용을 나타내며, 단량체인 NAG는 퇴행성관절염 치료에 효과가 뛰어나고 항염증, 심장보호, 간장보호 작용 등에 효과가 있다고 알려져 있다. 최근에는 이러한 키틴 올리고당 및 NAG의 생산을 위해 기존의 산분해법 대신에 효소 키티나아제를 이용하는 방법이 모 색되고 있다. 키티나아제는 식물병원균의 세포벽을 분해하여 용균작용 함으로써 키티나아제 생산 미생물이 식물병원균에 대하여 길항작용을 나타내게 한다고 보고되고 있기 때문에, 키티나아제를 많이 생산하는 균주를 식물병 방제제로 사용하는 것은 매우 효과적이다.

이에 본 발명자들은 잔디(한국들잔디, zoysiagrass) 근권에서 분리한 세균인 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주가 키티나아제 생산성이 우수하고, 다양한 식물병에 대하여 우수한 방제효과를 나타내며, 기존 농약과 혼용하거나 교호적으로 살포하여 농약 사용량 감소가 가능한 종합적 방제에 이용이 가능하다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 다양한 식물병에 대하여 방제효과가 우수한 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 식물병 방제용 조성물을 이용하여 식물병을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주(기탁번호: KCTC 11489BP)를 제공한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 식물병 방제용 조성물을 토양 또는 식물에 처리하는 것을 포함하는, 식물병 방제방법을 제공한다.

본 발명에 따른 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주는 다량의 키티나아제를 생산할 수 있으며, 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 토마토 역병 및 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 파이토프토라 캅사이시(Phytophthora capsici), 또는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 의해 발생하는 다양한 식물병에 대하여 우수한 방제 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에 따른 슈도모나스 제니큘라타(Pseudomonas geniculata) MH102 균주(이하, MH102 균주로 기재함)는 대한민국 포장으로부터 순수 분리될 수 있다. 본 발명의 균주는 트립틱 소이 한천 배지(tryptic soy agar), 영양 한천배지(nutrient agar)에 배양하였을 때 연노랑의 전형적인 슈도모나스 콜로니를 형성 하는 세균이다. 주사현미경으로 MH102 균주를 관찰하면 일반적인 간균의 형태를 나타낸다. MH102 균주는 바이올로그 테스트(Biolog test)에서 슈도모나스(Pseudomonas sp.) 속으로 동정되었으며, 16S 리보조말 디엔에이(rDNA) 유전자 상동성 검색에서, 슈도모나스 제니큘라타(Pseudomonas geniculata)와 가장 높은 상동성(99.9%)을 보였다. 따라서 완전히 동일하지는 않지만 식물병 방제효과가 있는 MH102 균주를 슈도모나스 제니큘라타 신균주로 동정하였다.

본 발명자들은 이 신균주를 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주로 명명하여 한국생명공학연구원 내 유전자은행에 2009년 3월 25일자로 기탁번호 제 KCTC 11489BP로 기탁하였다.

본 발명에 따른 MH102 균주는 트립틱 소이 한천 배지, 영양 한천 배지(nutrient agar), 루브리아-버타니배지(Lubria-Bertani agar) 등 세균 생장을 위한 세균 배양용 배지에서 잘 자란다. 본 발명의 균주는 0.5 내지 3%, 바람직하게는 1 내지 2%의 콜로이달 키틴(colloidal chitin)이 첨가된 세균 배양용 배지에서 배양할 경우, 키티나아제의 생산성이 증가한다. 또한 본 발명의 MH102 균주는 15 내지 35℃의 온도, 바람직하게는, 25 내지 30℃의 온도에서 잘 생장하며 약 25℃가 생장 최적 온도이다. 또한 pH 5.0 내지 pH 10의 배지에서 비교적 잘 생장하며, pH 6.0에서 가장 잘 생장한다.

본 발명의 균주의 키티나아제 생산의 최적 조건은, 1% 콜로이달 키틴이 첨가되고 pH 6.0으로 조정한 배지에 상기 균주를 접종하고 25℃에서 3일 동안 진탕 배양하는 것이다.

본 발명의 균주는 대치배양 실험에서 다양한 식물병원균에 대하여 살균작용을 나타낸다. 각종 작물의 잿빛곰팡이병을 일으키는 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 인삼 점무늬병균인 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 각종 식물에 모잘록병을 일으키는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)와 고추 역병 병원균인 파이토프토라 캅사이시(Phytophthora capsici), 고추 탄저병균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 벼 도열병균인 마그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea), 각종 작물에 시들음병을 일으키는 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 등 주요 식물병원균의 생장을 효과적으로 억제하였다.

또한, 본 발명의 균주는 온실실험에서 다양한 식물병원균에 의해 발생하는 식물병을 효과적으로 방제할 수 있다. 구체적으로, 콜로이달 키틴을 첨가한 배지에서 배양한 MH102 균주를, 재배한 식물에 살포함으로써 벼 도열병(병원균: 마그나포르테 그리시아), 토마토 잿빛곰팡이병(병원균: 보트리티스 시네리아), 토마토 역병(병원균: 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)), 밀 붉은녹병(병원균: 푸치니아 레콘디타(Puccinia recondita)) 및 고추 탄저병(병원균: 콜레토트리쿰 코코데스) 등 다양한 식물병에 대하여 방제효과를 나타낼 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 균주는 벼 도열병, 밀 붉은녹병 및 토마토 역병 등의 식물을 효과적으로 방제할 수 있다. 또한, MH102 균주는 벼, 토마토, 오이, 밀, 보리, 배추, 고추 등의 작물에 대하여 전혀 병원성을 나타내지 않으므로 생물적 방제제로 이용이 가능하다.

따라서, 본 발명에서는 슈도모나스 제니큘라타(Pseudomonas geniculata) MH102 균주(KCTC 11489BP) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 토마토 역병 및 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 파이토프토라 캅사이시(Phytophthora capsici) 또는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 의해 발생하는 식물병으로 이루어진 군에서 선택되는 식물병의 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에서는, 상기 식물병 방제용 조성물을 식물이 생장하고 있는 환경 또는 식물에 처리하는 것을 포함하는, 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 토마토 역병 및 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 파이토프토라 캅사이시(Phytophthora capsici) 또는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 의해 발생하는 식물병으로 이루어진 군에서 선택되는 식물병의 방제방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 MH102 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 식물이 생장하고 있는 환경(예: 토양, 물) 또는 성장 중인 식물 표면에 식물병을 억제할 수 있는 양으로 살포하거나 관주처리 함으로써 채소 및 과일 등 작물의 다양한 식물병을 생물학적으로 방제할 수 있다. 이때, 필요에 따라, 생물농약분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하고 분말, 펠렛, 과립 또는 용액 등으로 제형화하여 식물병 방제용 조성물로서 사용할 수 있다. 상기 담체로는 물, 화이트 카본, 카올린 등을 사용할 수 있으며, 상기 배양물은 액체 배양물 또는 고체 배양물일 수 있다.

상기 균주 배양액은 포장에서 분무기나 조로를 이용하여 살포 및 관주 등 일반적인 관행 방법으로 식물에 처리할 수 있다.

본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 포장에 처리할 때 조성물 중의 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주의 농도는 포장의 병원균의 밀도, 발병환경 등에 따라 달라질 수 있으나, 1x10⁴ 내지 1x10¹⁰ 포자/ml의 농도로 제조한 현탁액을 흘러내릴 정도로 처리할 수 있으며, 특히 1x10⁸내지 1x10¹⁰포자/ml의 농도에서 우수한 방제효과를 나타낸다.

또한, 본 발명의 식물병 방제용 조성물을 합성 살균제와 혼용 또는 교차 처리하여 사용함으로써 식물병을 방제할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주의 분리 및 선발

한국 들잔디를 재배하고 있는 포장, 즉 축구장, 골프장, 야구장 등에서 잔디 갈색마름병이 발생한 잔디들 가운데서 건전하게 자라고 있는 잔디를 채취하였다. 상기 채취한 잔디를 잘 털어서 토양을 제거한 후 말려 막자사발에 놓고 액체 질소를 부어 조직을 얼린 후 갈아서 잔디 조직을 잘라 주었다. 상기 잘린 잔디 조직을 살균수로 희석하고 트립틱 소이 배지(tryptic soy agar)에 도말한 후, 배지 중앙에 라이족토니아 솔라니(잔디 갈색마름병 병원균)의 균총으로부터 떼어낸 5 mm의 균사조각을 올려놓고 25℃ 배양기에서 배양하였다. 3일 배양한 후 세균이 자라나오면서 라이족토니아 솔라니의 균사 생장을 억제하여 형성된 투명환(clear zone)에서 라이족토니아 병원균에 대하여 살균활성이 있다고 판단되는 균주를 취했다. 이어, 단 콜로니 분리를 실시하여 172개 균주를 분리하고, 40% 글리세롤 용액에 각 세균을 접종하고 -80℃의 초저온 냉장고(deep freezer)에 각 균주를 보관하면서 실험에 사용하였다.

상기 균주 중에서 키티나아제를 많이 생산하는 균주를 선발하기 위하여, 하기 표 1에 기재된 성분을 포함하는 콜로이달 키틴 배지 중앙에 줄을 그어 각 균주를 접종하고, 30℃에서 4일 동안 배양한 후 형성되는 투명대(halo zone)의 크기를 조사하였다. 분리한 172개 균주 중 키티나아제 활성이 있는 균주는 12개 균주였으며, 이들 중 키티나아제 활성이 가장 우수한 균주는 MH102 균주였다. 도 1에 나타난 바와 같이, MH102 균주는 투명대의 직경이 22.6 mm에 달할 정도의 우수한 키티나아제 활성을 나타내어 이 균주를 생물학적 방제제로 이용하고자 선발하였다.

성분	함량
콜로이달 키틴	5 g
KH₂PO₄	3 g
K₂HPO₄	2 g
NH₄Cl	1 g
MgSO₄·7H₂O	0.2 g
CaCl₂·2H₂O	0.01 g
효모 추출물	0.1 g
아가	15 g
물	1 ℓ

실시예 2 : 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주의 동정

상기 실시예 1에서 분리한 MH102 균주의 동정을 위하여 형태적 및 생화학적 특성, 16S rDNA 염기서열 분석을 실시하였다.

(2-1) 형태적 및 생화학적 특성

본 발명의 MH102 균주를 트립틱 소이 한천 배지(tryptic soy agar) 및 영양 한천배지(nutrient agar)에 배양한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, MH102 균주는 연노랑의 전형적인 슈도모나스 콜로니를 형성하는 세균임을 알 수 있었다. 또한 MH102 균주는 그람 염색반응에서 음성 반응을 나타내었다.

주사전자현미경(scanning electron microscope) 관찰을 위해, 적출한 균주 시료를 2.5% 파라포름알데하이드-글루타르알데하이드(paraformaldehyde-glutaraldehyde, 4℃, 0.1M 인산염 완충액, pH 7.2) 고정액에서 2시간 전고정하고, 완충액(0.1M 인산염 완충액, pH 7.2)으로 10분씩 3회 세척한 후, 1% OsO₄(25℃, 0.1M 인산염 완충액, pH 7.2)에서 2시간 동안 후고정하였다. 고정이 끝난 재료를 동일 완충용액으로 수회 세척한 후, 에탄올 농도를 상승시켜가며 탈수시켜 아이소아밀 아세테이트로 치환하고 임계점 건조기(critical point dryer)로 건조한 다음, SC502 스퍼터링 코팅기(sputtering coater)를 이용하여 20nm 두께로 도금한 후, 히타치(HITACHI) S4300N (히타치, 일본) 주사전자현미경으로 20 kV에서 실시하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 그 결과, 균의 형태가 간균임을 알 수 있었다.

또한, 미국 바이올로그(Biolog) 사의 GN 마이크로플레이트를 이용하여 각 탄소원 및 질소원 이용성을 조사하고 통계학적 데이터뱅크(statistical databank, MicroLog TM System, Biolog Inc.)로 분석하여 MH102 균주의 질소원 및 탄소원 이용성 패턴을 하기 표 2에 나타내었으며, 이로부터 MH102 균주가 슈도모나스(Pseudomonas sp.) 속에 속하는 균주임을 알 수 있었다.

α-사이클로덱스트린	-	자일리톨	-	L-알라닌	+
덱스트린	+	메틸 피루베이트	+	L-알라닐-글리신	+
글리코겐	-	모노-메틸 숙시네이트	+	L-아스파라진	+
트윈 40	+	아세트산	-	L-아스파트산	+
트윈 80	+	시스-아코니트산	+	L-글루탐산	-
N-아세틸-D-갈락토사민	+	시트르산	+	글리실-L-아스파트산	+
N-아세틸-D-글루코사민	+	폼산	-	글리실-L-글루탐산	+
아도니톨	-	D-갈락톤산 락톤	-	L-히스티딘	+
L-아라비노즈	-	D-갈락투론산	-	하이드록시 L-프롤린	-
D-아라비톨	-	D-글루콘산	-	L-루신	-
셀로비오즈	+	D-글루코사민산	-	L-오르니틴	-
i-에리트리톨	-	D-글루쿠론산	-	L-페닐알라닌	-
D-프럭토즈	+	α-하이드록시-부티르산	+	L-프롤린	+
L-푸코즈	-	β-하이드록시-부티르산	-	L-피로글루탐산	-
D-갈락토즈	-	γ-하이드록시-부티르산	-	D-세린	-
젠티오비오즈	+	p-하이드록시 페닐아세트산	-	L-세린	+
a-D-글루코즈	+	이타콘산	-	L-트레오닌	+
m-이노시톨	-	α-케토 부티르산	+	D,L-카르니틴	-
α-D-락토즈	+	α-케토 글루타르산	+	γ-아미노 부티르산	-
락툴로즈	+	α-케토 발레르산	+	우로칸산	+
말토즈	+	D,L-락트산	+	이노신	-
만니톨	-	말론산	+	우리딘	+
D-만노즈	+	프로피온산	+	티미딘	-
D-멜리비오즈	+	퀴닌산	-	페닐 에틸아민	-
β-메틸-D 글루코시드	+	D-사카르산	-	푸트레신	-
D-프시코즈	-	세바크산	-	2-아미노 에탄올	-
D-라피노즈	-	숙신산	+	2,3-부탄디올	-
L-람노즈	-	브로모 숙신산	-	글리세롤	-
D-솔비톨	-	숙신남산	-	D,L-a-글리세롤 포스페이트	-
수크로즈	+	글루쿠론-아미드	-	글루코즈-1-포스페이트	-
D-트레할로즈	+	알라닌아미드	+	글루코즈-6-포스페이트	-
투라노즈	+	D-알라닌	+

(2) MH102 균주의 염기서열 분석

MH102 균주의 16S rDNA 염기서열(서열번호: 1)을 분석한 결과를 하기 표 3에 나타내었으며, MH102 균주들의 계통도를 도 4에 나타내었다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 MH102 균주는 슈도모나스 제니큘라타(Pseudomonas geniculata) ATCC 19374(T)와 99.9%의 상동성을 보였다. 따라서 완전히 동일하지는 않지만 MH102 균주를 슈도모나스 제니큘라타 신균주로 동정하였다.

본 발명자들은 상기 MH102 균주를 슈도모나스 제니큘라타 MH102(Pseudomonas geniculata MH102)로 명명하여 한국생명공학연구원 내 유전자은행에 2009년 3월 25일자로 기탁번호 제 KCTC 11489BP로 기탁하였다.

타입 스트레인	상동성 (%)	상이한 개수/ 비교개수
슈도모나스 제니큘라타(Pseudomomas geniculata) ATCC19374^T	99.86	2/1437
슈도모나스 히비스시콜라(Pseudomomas hibiscicola) ATCC19867^T	99.65	5/1441
슈도모나스 베텔리(Pseudomomas beteli) ATCC19861^T	99.31	10/1440
슈도모나스 시스시콜라(Pseudomomas cissicola) ATCC33616^T	96.81	46/1442
슈도모나스 픽토룸(Pseudomomas pictorum) ATCC23328^T	96.79	46/1433
슈도모나스 보레오폴리스(Pseudomomas boreopolis) ATCC33662^T	95.87	59/1427
슈도모나스 인돌옥시단스(Pseudomomas indoloxydans) IPL-1^T	87.11	183/1420
슈도모나스 베로니이(Pseudomomas veronii) CIP104663^T	87.05	186/1436
T: 타입 스트레인

실시예 3 : 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주의 배양적 특징

(3-1) 배양 온도에 따른 MH102 균주의 생장 정도

슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주를 트립틱 소이 액체배지(TSB)에 접종하여 1일 동안 전배양한 MH102 배양액 0.5 ml씩을 멸균한 50 ml의 TSB 배지가 들어있는 삼각플라스크에 접종하고 15℃, 20℃, 25℃, 30℃ 및 35℃ 각각의 온도에서 각각 1일, 2일, 3일 동안 배양하였다. 각 배양액 시료의 C.F.U.(colony forming unit)를 조사하여 배양 온도에 따른 MH102 균주의 생장 정도를 조사하여 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

일반적인 세균의 생육 적온은 30℃로, 곰팡이보다 다소 높은 온도에서 잘 자라는 반면, 상기 표 4의 결과와 같이 MH102 균주는 2일 동안 배양한 후에는 30℃보다 25℃에서 더 빠르게 생장함을 알 수 있었다. 하지만 3일 배양 후에는 30℃에서도 25℃와 유사하게 잘 자랐다.

(3-2) 배지의 pH에 따른 MH102 균주의 생장 정도

배지의 pH에 따른 MH102 균주의 생장 정도를 확인하기 위하여 트립틱 소이 액체배지의 pH가 멸균한 이후에 각각 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 및 10이 되도록 트립틱 소이 액체배지를 준비하였다.

이어, 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주를 트립틱 소이 액체배지에 접종하여 1일 동안 전배양한 MH102 배양액 0.5 ml씩을 준비한 각 pH 조정 배지 50 ml가 들어있는 삼각플라스크에 접종하고 30℃에서 각각 1일 동안 배양하였다. 각 배양액 시료를 2배로 희석하여 분광 광도계(spectrophotometer)를 이용하여 600 nm에서 흡광도를 조사하여 MH102 균주의 생장정도를 조사하여 그 결과를 표 5에 나타내었다.

상기 표 5에 나타난 바와 같이, 슈도모나스 MH102 균주는 pH 6에서 가장 잘 생장하였으며, pH 5 및 pH 7 내지 10의 트립틱 소이 액체배지에서 거의 유사하게 생장하였다.

실시예 4 : MH102 균주의 키티나아제 생산의 최적 배양 조건

(4-1) 키티나아제 활성 측정법

MH102 균주가 생산한 키티나아제의 양을 측정하기 위하여, 각 균주를 상기 표 1에 기재된 조성을 포함하는 콜로이달 키틴배지에서 배양한 후 배양액을 원심분리(4℃, 12,000 g, 10분)한 후, 상등액을 취하여, 상기 상등액(배양여액)의 키티나아제 활성을 측정하였다.

구체적으로, 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 5)에 콜로이달 키틴을 2%가 되도록 첨가하여 기질 용액을 만들고, 상기 기질 용액 0.3 ml와 배양여액 0.3 ml를 혼합하고 N-아세틸-β-D-글루코사민(NAG)을 생산하도록 50℃에서 30분 동안 반응하였다. 4℃에서 1200 rpm으로 10분간 원심분리하고 상등액 0.3 ml를 취하였다. 상등액 0.3 ml에 디니트로살리시클릭산(dinitrosalicylic acid; DNS) 용액을 1 ml 첨가하고 100℃에서 5분간 가열하여 반응시킨 후 찬물에서 냉각시키고 분광 광도계로 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 대조구로는 기질인 콜로이달 키틴을 넣지 않은 배양여액을 이용하여 반응시키고 이를 흡광도 측정에서 블랭크(blank)로 사용하였다. 효소활성 즉, 생성된 NAG 양은 표준곡선으로부터 정량하였으며, 키티나제 1 유닛(unit)은 시간 당 1 μmol의 NAG을 생산하는 효소의 양으로 정의하였다.

(4-2) 배양 온도에 따른 MH102 균주의 키티나아제 생산

상기 표 1에 기재된 조성에서 콜로이달 키틴을 1% 첨가하고 멸균한 콜로이달 키틴 배지를 제조하였다. 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주를 트립틱 소이 액체배지(TSB)에 접종하여 1일 동안 전배양한 MH102 배양액 0.5 ml 씩을 멸균한 키틴 배지 50 ml가 들어있는 삼각플라스크 각각에 접종하고 20℃, 25℃, 30℃ 및 35℃에서 각각 3일 동안 150 rpm으로 진탕배양하였다. 상기 실시예 4-1에 기재된 방법으로 각 배양액 시료의 키티나아제 활성을 측정하여 그 결과를 표 6에 나타내었다.

상기 표 6에 나타난 바와 같이, 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주는 25℃와 30℃에서 배양하였을 때 가장 많은 키티나아제를 생성하였다.

(4-3) 배양 기간에 따른 MH102 균주의 키티나아제 생산

상기 표 1에서 기재된 조성에서 콜로이달 키틴을 1% 첨가하고 멸균한 콜로이달 키틴 배지를 제조하였다. 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주를 트립틱 소이 액체배지(TSB)에 접종하여 1일 동안 전배양한 MH102 배양액 0.5 ml 씩을 멸균한 키틴 배지 50 ml가 들어있는 삼각플라스크 각각에 접종하고 30℃에서 각각 1일, 2일 및 3일 동안 150 rpm으로 진탕배양하였다. 상기 실시예 4-1에 기재된 방법으로 각 배양액 시료의 키티나아제 활성을 측정하여 그 결과를 표 7에 나타내었다.

상기 표 7에 나타난 바와 같이 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주는 배양 기간이 증가함에 따라 ml 당 키티나아제의 활성이 증가하였으며, 세균 수도 증가하였다.

(4-4) 배지의 pH에 따른 MH102 균주의 키티나아제 생산

상기 표 1에 나타난 조성에서 콜로이달 키틴을 1%가 되도록 첨가하고 5M HCl과 5M NaOH 용액을 첨가하여 멸균한 배지의 pH가 각각 4, 5, 6, 7, 8 및 9인 콜로이달 키틴 배지를 제조하였다. 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주를 트립틱 소이 액체배지(TSB)에 접종하여 1일 동안 전배양한 MH102 배양액 0.5 ml 씩을 준비한 콜로이달 키틴 배지 50 ml가 들어있는 삼각플라스크 각각에 접종하고 30℃에서 3일 동안 150 rpm으로 진탕배양하였다. 상기 실시예 4-1에 기재된 방법으로 각 배양액 시료의 키티나아제 활성을 측정하여 그 결과를 표 8에 나타내었다.

상기 표 8에 나타난 바와 같이, 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주는 배지의 pH가 6인 경우에 키티나아제를 가장 많이 생산하는 것을 알 수 있었다. 또한 pH 7도 상당 양의 키티나아제를 생산하였다.

실시예 5: 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주의 다양한 식물병원균에 대한 살균효과

직경 8.5 cm 페트리 디쉬(Petri dish)에 있는 트립틱 소이 배지의 한쪽에 MH102 균주를 스트리킹(streaking)하여 접종한 후 30℃에서 1일 동안 전배양한 후 반대편에 각 식물병원균(라이족토니아 솔라니, 파이토프토라 캅사이시, 콜레토트리쿰 코코데스, 푸자리움 옥시스포룸, 보트리티스 시네리아, 마그나포르테 그리시아 및 알터나리아 파낙스)의 균사 조각(직경 6.5 mm)을 접종하고, 보트리티스 시네리아는 20℃에서, 나머지 6종 병원균은 25℃에서 2~7일 동안 배양한 후 균총의 직경을 측정하였다. 이때, 대조군으로서 무처리구는 MH102 세균을 접종하지 않고 처리구와 동일한 방법으로 병원균을 접종하였다. 이중 잿빛곰팡이병(B. cinerea)에 대한 무처리구와 MH102 처리구의 배양사진을 도 5에 나타내었다.

균사생장 억제효과는 하기 수학식 1에 따라 계산하였으며 그 결과를 표 9에 나타내었다.

억제율(%) = 100 × (무처리구 균총 직경 - 처리구 균총 직경)/무처리구 균총 직경

병원균		억제율(%)
라이족토니아 솔라니(R. solani)	각종 식물 모잘록병	72
파이토프토라 캅사이시(P. capsici)	고추 역병	58
콜레토트리쿰 코코데스(C. cocodes)	고추 탄저병	58
푸자리움 옥시스포룸(F. oxysporum)	시들음병	27
보트리티스 시네리아(B. cinerea)	각종 식물 잿빛곰팡이병	93
마그나포르테 그리시아(M. grisea)	벼 도열병	50
알터나리아 파낙스(A. panax)	인삼 점무늬병	86

표 9에 나타난 바와 같이, MH102 균주는 실험한 7종 식물병원균에 대하여 높은 균사생장 억제효과를 나타내어 다양한 병원균에 대하여 살균 활성이 있음을 알 수 있었다. 특히, MH102 균주는 실험한 병원균 중 보트리티스 시네리아, 알터나리아 파낙스와 라이족토니아 솔라니에 대하여 우수한 살균 활성을 보였으며, 콜레토트리쿰 코코데스, 파이토프토라 캅사이시, 마그나포르테 그리시아에 대해서도 50% 이상의 억제효과를 나타내었다.

실시예 6 : 온실실험에서 MH102 균주의 식물병 방제효과

슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주 배양액 처리에 의한 식물병 방제효과를 온실에서 실험하였다. 벼 도열병(병원균: Magnaporthe grisea), 토마토 잿빛곰팡이병(병원균: Botrytis cinerea), 토마토 역병(병원균: Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(병원균: Puccinia recondita), 보리 흰가루병(병원균: Blumeria graminis f. sp. hordei), 및 고추 탄저병(병원균: Colletotrichum coccodes)의 6종 식물병에 대한 방제효과를 조사하기 위하여, 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주의 배양액을 벼, 토마토, 고추, 밀 그리고 보리에 살포하고 1일 후에 각 병원균의 포자를 접종하고 발병시켜 식물병 방제효과를 조사하였다.

실험에 사용할 작물을 준비하기 위하여, 직경 4.5 cm의 일회용 플라스틱 폿트에, 벼를 위해서는 수도용 상토를, 토마토, 오이, 고추, 밀, 보리를 위해서는 원예용 상토를 넣고 벼(품종: 낙동벼), 토마토(품종: 서광토마토, 흥농종묘), 고추(품종: 부강, 흥농종묘), 밀(품종: 은파밀) 및 보리(품종: 동보리)의 종자를 각 포트에 파종한 후 온실(25±5℃)에서 1~4주 동안 재배하여 준비한 3~4엽기의 벼, 2~3엽기의 토마토, 4~5엽기의 고추, 1엽기의 밀과 보리를 실험에 사용하였다.

콜로이달 키틴을 1% 첨가한 트립틱 소이 액체 배지에 MH102 균주를 접종하고 30℃에서 3일 동안 150 rpm으로 진탕배양하여 수확하였다. MH102 균주 배양액을 3배 농도로 희석하고 계면활성제 트윈 20을 250 ppm이 되도록 첨가한 후에 앞에서 재배하여 준비한 식물에 살포하였다. 무처리구는 트윈 20 250 ppm 용액을 동일한 방법으로 처리하였다. 약제 처리한 식물은 1일 후에 병원균의 포자 혹은 균사조각을 접종하고 습실처리하여 발병시킨 후 병반면적율을 조사하였다. 병반면적율은 식물체(유묘) 잎의 면적에 대한 병반 면적의 백분율로서 계산하였다. 방제효과는 수학식 2에 따라 방제가로 계산하였다. 각 식물병에 대한 접종 및 발병 유도는 다음과 같이 실시하였다.

벼 도열병(Rice Blast, RCB)에 대한 시험

병원균인 마그나포르테 그리시아(Magnaporthe grisea) KJ201 균주(세종대학교)를 쌀겨 한천배지(쌀겨 20 g, 덱스트로스 10 g, 아가 15 g, 증류수 1 L)에 접종하여 25℃ 배양기에서 2주간 배양하였다. 병원균이 자란 배지를 멸균한 붓으로 배지표면을 긁어 기중 균사를 제거하고, 형광등이 켜진 선반(25~28℃)에서 48시간 동안 포자를 형성시켰다. 병원균의 접종은 형성시킨 분생포자를 살균증류수로 일정농도의 포자현탁액(10⁶ 포자/ml)을 만든 뒤 식물에 흘러내릴 정도로 충분히 분무하였다. 접종한 벼는 습실상에서 암상태로 24시간 습실처리를 하고 상대습도 80% 이상이며 온도 26℃인 항온항습실에서 5일간 둔 뒤 병반면적율을 조사하였다.

토마토 잿빛곰팡이병(Tomato Gray Mold, TGM)에 대한 시험

잿빛곰팡이병 병원균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea) NY76 균주(한국화학연구원)를 감자즙액배지(potato dextrose broth) 배지(조성: 1L 당 감자전분 4g, 덱스트로즈 20g; 벡톤 앤 디킨슨사 구입)에 접종하여 20℃ 항온기(암상태)에서 5일간 배양한 후 하루에 12시간씩 광암을 교차하면서 다시 7일 동안 배양하여 포자를 형성시켰다. 병원균 접종은 배지에 형성된 포자를 감자즙액배지로 수확하여 혈구계를 사용하여 포자농도를 5x10⁵ 포자/ml로 조정하고 토마토 유묘에 분무접종 하였다. 접종한 유묘는 20℃ 습실상(상대습도 95% 이상)에서 3일간 발병을 유도시킨 후 병반면적율을 조사하였다.

토마토 역병(Tomato Late Blight, TLB)에 대한 시험

병원균인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans) PIT 균주(강릉대학교)를 오트밀 한천(oatmeal agar)배지(조성: 1L 당 오트밀 60g, 한천 12.5g; 벡톤 앤 디킨슨사 구입)에 접종하고 20℃ 항온기에서 배양하였다. 배지에 형성된 유주자낭을 살균증류수를 첨가하여 수확하고, 광학현미경하에서 혈구계로 유주자낭 농도를 조사하여 3x10⁴유주자낭/ml의 포자현탁액을 만들어 저온처리하여 유주자를 유출시킨 후, 토마토 유묘에 분무접종 하였다. 병원균을 접종한 토마토 유묘는 20℃ 습실상에서 2일간 습실처리한 후에 20℃의 항온항습실(상대습도 70%)에 1일간 두어 발병시킨 후 병반면적율을 조사하였다.

밀 붉은녹병(Wheat Leaf Rust, WLR)에 대한 시험

병원균인 푸치니아 레코디타(Puccinia recondita)(인천대학교)는 활물기생균이므로, 실험실에서 식물체에 직접 계대배양하면서 밀 유묘에 형성된 하포자를 접종원으로 사용하였다. 수확한 하포자로 포자현탁액(포자 0.67 g/L)을 제조한 후 밀 유묘에 분무접종 하였다. 접종한 유묘는 20℃의 습실상에서 1일간 습실처리한 후에 상대습도가 70%인 20℃의 항온항습실로 옮겨서 발병을 유도하고 접종한지 7일 후에 병반면적율을 조사하였다.

보리 흰가루병(Barley Powdery Mildew, BPM)에 대한 시험

병원균인 블루메리아 그라미니스(Blumeria graminis) f. sp. 호르데이(hordei)(한국화학연구원)는 활물기생균이므로, 실험실에서 보리 유묘에 인공적으로 접종하여 형성시킨 흰가루병 포자를 접종원으로 사용하였으며, 이들을 보리 유묘에 고르게 털어서 접종하였다. 접종된 보리 유묘는 20~23℃, 상대습도 70% 정도의 항온항습실에 두어 7일간 발병시킨 후 병반면적율을 조사하였다.

고추 탄저병(Red Pepper Anthracnose, RPA)에 대한 시험

병원균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes) 2-25 균주(고려대학교)를 오트밀 한천배지에 접종하여 형성된 포자를 살균증류수로 수확하고, 광학현미경하에서 혈구계로 포자농도를 조사하여 3x10⁵포자/ml의 포자현탁액을 만들어 고추 유묘에 분무접종 하였다. 병원균을 접종한 고추 유묘는 25℃ 습실상에서 2일간 습실처리한 후에 25℃의 항온항습실(상대습도 70%)에 1~2일간 두어 발병시킨 후 병반면적율을 조사하였다.

각 식물병에 대한 MH102 균주의 방제가를 하기 표 10에 나타내었다.

대상 식물병	방제가(%)
벼 도열병	93
토마토 잿빛곰팡이병	25
토마토 역병	98
밀 붉은녹병	80
보리 흰가루병	0
고추 탄저병	36

상기 표 10에 나타난 바와 같이, 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주는 벼 도열병과 토마토 역병에 대하여 90% 이상의 우수한 방제효과를 나타냈으며, 밀 붉은녹병에 대하여는 80%의 방제가를 보여 MH102 균주가 벼 도열병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병을 효과적으로 방제함을 알 수 있었다.

이중 MH102 균주 처리에 의한 벼 도열병 방제 효과를 나타낸 사진을 도 6에 나타내었다(1: 무처리구, 2: MH102 균주 처리구 및 3: 살균제 트리시클라졸 10 ppm 처리구). 그 결과, 본 발명의 균주는 트리시클라졸과 유사한 방제 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 따라서 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주는 다양한 식물병에 대하여 방제효과를 나타낸다는 사실을 알 수 있다.

실시예 7 : MH102 균주의 토마토 역병에 대한 살균 활성 기작 규명

(7-1) MH102 균주 배양액, 배양여액 및 균체 현탁액의 식물병 방제효과

MH102 균주를 트립틱 소이 액체 배지에 접종하고 30℃에서 150 rpm으로 3일 동안 진탕배양한 후 이를 원심분리하여 균체와 배양여액으로 분리하였다. 균체는 다시 멸균수를 첨가하여 원래 농도가 되도록 하였다. MH102 균주의 배양액과 배양여액 그리고 세균 현탁액 등 3종 시료에 계면활성제 트윈 20을 250 ppm이 되도록 첨가하였다. 준비한 약제 용액을 온실에서 재배하여 준비한 토마토와 고추 유묘에 살포하고, 1일 후에 토마토 역병균과 고추 탄저병균을 각각을 접종하였다. 각 식물병의 접종 및 발병 유도는 상기 실시예 6에 기재된 방법과 동일하게 수행하였으며, MH102 균주 배양액, 배양여액 및 균체의 방제가를 계산하여 표 11에 나타내었다.

상기 표 11에 나타난 바와 같이 MH102 균주의 토마토 역병 및 고추 탄저병 방제효과는 균체보다 배양여액 처리구에서 더 높은 방제효과를 나타냈다. 따라서 식물병 방제효과는 세균의 직접적인 작용에 의한 것이 아니라 세균이 분비한 물질 및 효소에 의한 것임을 알 수 있었다. 그리고 MH102의 배양액은 배양여액보다 더 높은 방제효과를 나타내어 MH102 균체와 배양여액 간에는 상승작용이 있다고 판단되었다.

(7-2) 열처리한 MH102 균주 배양여액의 식물병 방제효과

MH102 균주의 살균 활성 본체가 효소인지 아니면 저분자 물질인지를 확인하기 위하여, MH102 배양여액을 여러 온도에서 열처리한 후 이들의 토마토 역병에 대한 방제효과를 조사하였다.

구체적으로, MH102 균주를 트립틱 소이 액체 배지에 접종하고 30℃에서 150 rpm으로 3일 동안 진탕 배양하여 수확한 MH102 균주의 배양액을 원심분리하고 멤브레인 필터로 균체를 제거하여 배양여액을 얻었다. MH102 균주의 배양여액을 30 ml 씩 나누어 80℃, 100℃ 및 121℃(멸균기 이용)에서 20분 동안 열처리한 후 각 시료에 계면활성제 트윈 20을 250 ppm이 되도록 첨가하고, 이들의 토마토 역병에 대한 방제효과 실험을 실시하였다. 각 온도로 열처리한 MH102 배양여액을 온실에서 재배하여 준비한 토마토 유묘에 살포하고, 1일 후에 역병균을 접종하였다. 각 식물병의 접종 및 발병 유도는 실시예 6에서 기재된 방법과 동일하게 수행하여 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.

상기 표 12에 나타난 바와 같이 MH102 균주의 토마토 역병 방제효과는 80∼121℃로 열처리하였을 때 없어지는 것을 확인하였다. 따라서 MH102가 분비하는 살균활성 본체는 키티나아제, 프로테아제(protease), 글루카나제(glucanase) 등의 세포벽 분해효소이거나 열에 불안정한 저분자 물질로 추정되었다.

(7-3) MH102 균주 배양액의 유기용매 추출물의 식물병 방제효과

MH102 균주의 살균활성 본체가 열에 불안정한 저분자 물질인지를 확인하기 위하여, MH102 배양액의 유기용매 추출물을 확보하고 이들의 살균활성을 조사하였다. MH102 균주를 트립틱 소이 액체배지에 접종하고 25℃에서 3일 동안 150 rpm으로 진탕배양 하였다. 수확한 MH102 배양액(1 L)을 원심분리하여 균체를 제거하고 배양여액을 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올로 순차적으로 추출한 후 농축하였다. 각 추출물의 수확량은 각각 헥산층이 32.2 mg, 에틸아세테이트층이 82.2 mg, 부탄올층이 1,798 mg 이었다. 각 시료로부터 수확량의 15분의 1의 양을 취하여 에틸아세테이트 층은 아세톤(4 ml)으로, 부탄올 층은 메탄올(2 ml)로 용해하고 계면활성제 트윈 20(250 ppm) 용액에 첨가하여 최종 부피가 40 ml가 되도록 하여 원액 농도의 약제 용액을 준비하였다.

각 추출물의 1,000 ppm 농도 처리에 의한 식물병 방제효과를 실험하기 위하여, 각 추출물 40 mg 씩을 취하고 상기와 동일한 방법으로 40 ml의 약제 용액을 준비하였다. 제조한 약제 용액을 온실에서 재배한 식물에 살포하였으며, 무처리구는 약제 없이 유기용매와 트윈 20을 첨가한 용액을 살포하였다. 약제처리한 식물에 1일 후에 각 병원균을 접종하여 식물병 방제효과를 조사하여 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.

표 13에 나타난 바와 같이 MH102 배양액의 유기용매 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 추출물은 MH102 배양액과 달리 7종 식물병에 대하여 거의 방제효과가 없었다. 따라서 MH102 균주의 활성 본체는 효소라고 판단되었다.

실시예 8 : 다양한 살균제에 대한 MH102 균주의 내성

슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주의 기존 살균제와의 혼용 및 교차 처리여부를 확인하기 위하여, 현재 농가에서 널리 사용하고 있는 합성 살균제 69종의 원제를 확보하여 MH102 균주에 대한 생장억제효과를 조사하여 내성이 있는 살균제를 선발하였다.

각 약제의 활성성분을 기준으로 10,000 ppm, 2,000 ppm 및 400 ppm 농도가 되도록 각 약제를 디메틸설폭사이드(dimethlysulfoxide; DMSO)에 용해하여 실험에 사용하였다. 96웰 플레이트에 이들 약제용액을 1 ㎕ 씩 넣고, 여기에 트립틱 소이 액체배지에서 1일 동안 전배양한 MH102 균주를 1%가 되도록 첨가하여 준비한 접종원을 웰당 100 ㎕ 씩 첨가하고 약제가 고르게 섞이도록 충분히 흔들어 주었다. 접종한 플레이트는 30℃에서 150 rpm으로 1일 동안 진탕 배양한 후 MH102 세균의 생장을 관찰하여 최소억제농도(minimal inhibitory concentration, MIC)를 조사하였다. 무처리구는 약제없이 DMSO만 1 ㎕ 처리하였으며, 실험은 3반복으로 2회 실시하였다. 기존 살균제 69종의 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주에 대한 생장억제효과를 하기 표 14에 나타내었다.

표 14에 나타난 바와 같이, 실험한 69종 살균제 중 63개 살균제는 100 ppm 농도에서도 MH102 균주의 생장을 거의 억제하지 않았다. 즉 농가에서 주로 사용하고 있는 살균제의 90% 이상이 MH102 균주에 대하여 영향이 없음을 알 수 있었다. 또한 100 ppm에서만 MH102의 생장을 억제한 3종 살균제 캅타폴, 캅탄 및 메티람은 점차 시장에서 퇴출되어 가는 살균제이다. 따라서 이들 혼용 가능한 살균제의 대부분이 비교적 최근에 개발된 고약효 살균제로 현재 농가 포장에서 널리 사용하는 약제이므로, 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주는 식물병 방제를 위하여 다양한 살균제와의 혼용 및 교호처리로 널리 이용될 수 있으리라 판단되었다.

도 1은 콜로이달 키틴 배지에서 배양한 MH102 균주의 키티나아제 생산 모습이다.

도 2는 트립틱 소이 한천배지에서 배양한 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주의 콜로니 모양을 나타낸 것이다.

도 3은 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주의 주사전자현미경 사진을 나타낸 것이다.

도 4는 16S rDNA 염기서열 분석에 따른 슈도모나스 MH102 균주들의 계통도를 나타낸 것이다.

도 5는 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주에 의한 잿빛곰팡이병균의 생장억제효과 사진이다(왼쪽: 무처리구, 오른쪽: MH102 처리구).

도 6은 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주 처리에 의한 벼의 도열병 방제효과를 나타낸 것이다(1: 무처리구, 2: MH102 균주 처리구, 3: 살균제 트리시클라졸 10 ppm 처리구).

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> PSEUDOMONAS GENICULATA MH102 STRAIN AND METHOD FOR THE BIOLOGICAL CONTROL OF PLANT DISEASES USING SAME <130> FPD/200904-0006 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1444 <212> DNA <213> Pseudomonas geniculata MH102 strain <400> 1 ctcagagtga acgctggcgg taggcctaac acatgcaagt cgaacggcag cacagaggag 60 cttgctcctt gggtggcgag tggcggacgg gtgaggaata catcggaatc tactctgtcg 120 tgggggataa cgtagggaaa cttacgctaa taccgcatac gacctacggg tgaaagcagg 180 ggatcttcgg accttgcgcg attgaatgag ccgatgtcgg attagctagt tggcggggta 240 aaggcccacc aaggcgacga tccgtagctg gtctgagagg atgatcagcc acactggaac 300 tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggcgca 360 agcctgatcc agccataccg cgtgggtgaa gaaggccttc gggttgtaaa gcccttttgt 420 tgggaaagaa atccagctgg ctaatacccg gttgggatga cggtacccaa agaataagca 480 ccggctaact tcgtgccagc agccgcggta atacgaaggg tgcaagcgtt actcggaatt 540 actgggcgta aagcgtgcgt aggtggtcgt ttaagtccgt tgtgaaagcc ctgggctcaa 600 cctgggaact gcagtggata ctgggcgact agagtgtggt agagggtagc ggaattcctg 660 gtgtagcagt gaaatgcgta gagatcagga ggaacatcca tggcgaaggc agctacctgg 720 accaacactg acactgaggc acgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta 780 gtccacgccc taaacgatgc gaactggatg ttgggtgcaa tttggcacgc agtatcgaag 840 ctaacgcgtt aagttcgccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt 900 gacgggggcc cgcacaagcg gtggagtatg tggtttaatt cgatgcaacg cgaagaacct 960 tacctggcct tgacatgtcg agaactttcc agagatggat tggtgccttc gggaactcga 1020 acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1080 acgagcgcaa cccttgtcct tagttgccag cacgtaatgg tgggaactct aaggagaccg 1140 ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc atcatggccc ttacggccag 1200 ggctacacac gtactacaat ggtagggaca gagggctgca agccggcgac ggtaagccaa 1260 tcccagaaac cctatctcag tccggattgg agtctgcaac tcgactccat gaagtcggaa 1320 tcgctagtaa tcgcagatca gcattgctgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac 1380 cgcccgtcac accatgggag tttgttgcac cagaagcagg tagcttaacc ttcgggaggg 1440 cgct 1444

Claims

슈도모나스 제니큘라타(Pseudomonas geniculata) MH102 균주(KCTC 11489BP).
슈도모나스 제니큘라타(Pseudomonas geniculata) MH102 균주(KCTC 11489BP) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는, 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 토마토 역병 및 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 파이토프토라 캅사이시(Phytophthora capsici) 또는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 의해 발생하는 식물병으로 이루어진 군에서 선택되는 식물병의 방제용 조성물.
제 2 항에 있어서,

상기 배양액이 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주를 0.5 내지 3%의 콜로이달 키틴이 첨가된 세균 배양용 배지에서 15 내지 35℃의 온도 및 pH 5.0 내지 pH 10에서 배양하여 얻은 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항의 식물병 방제용 조성물을 식물이 생장하고 있는 환경 또는 식물에 처리하는 것을 포함하는, 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 토마토 역병 및 알터나리아 파낙스(Alternaria panax), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes), 파이토프토라 캅사이시(Phytophthora capsici) 또는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 의해 발생하는 식물병으로 이루어진 군에서 선택되는 식물병의 방제방법.
제 4 항에 있어서,

상기 식물병 방제용 조성물 중 슈도모나스 제니큘라타 MH102 균주의 농도가 1x10⁴ 내지 1x10¹⁰ 포자/ml인 것을 특징으로 하는, 식물병의 방제방법.
제 4 항에 있어서,

상기 식물병 방제용 조성물을 합성 살균제와 혼용 또는 교차 처리하는 것을 특징으로 하는, 식물병의 방제방법.