KR101972079B1 - 식물 생육 증진 및 식물병 억제 효과를 갖는 신규 슈도모나스 사포니필라 ghr1-1 균주와 이를 함유하는 미생물제 - Google Patents

식물 생육 증진 및 식물병 억제 효과를 갖는 신규 슈도모나스 사포니필라 ghr1-1 균주와 이를 함유하는 미생물제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 새롭게 분리, 동정된 슈도모나스 사포니필라(Pseudomonas saponiphila) GHR1-1 균주, 이의 식물병 방제 용도, 및 식물 생장 촉진 용도에 관한 것이다. 본 발명의 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주는 식물 생장 촉진 효과가 우수하며, 다양한 식물병에 대한 항균 효과가 우수하므로 식물병 방제를 위한 친환경적 농약으로 활용될 수 있다.

Description

식물 생육 증진 및 식물병 억제 효과를 갖는 신규 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주와 이를 함유하는 미생물제{A novel Pseudomonas saponiphila GHR1-1 strain that promotes plant growth and inhibits plant diseases, and microbial agent containing the same}
본 발명은 식물 생육 증진 및 식물병 억제 효과를 가지는 새롭게 분리, 동정된 신규 슈도모나스 사포니필라(Pseudomonas saponiphila) 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
현대 농업에서는 작물을 병으로부터 보호하기 위해 농업용 살균제 사용에 의존하고 있는데, 이러한 농업용 살균제들은 인간 및 환경에 대한 부정적인 영향에도 불구하고 안정적인 농업 생산을 위해서 계속적인 사용이 불가피한 상황이다. 이러한 이유로 국내외 많은 연구자들이 새롭고 인간과 환경에 안전한 미생물 농약을 개발하고자 노력하고 있지만, 국내외적으로 식물병에 대하여 길항 효과를 갖는 미생물의 확보는 아직 부족한 실정이다.
실험실의 제한된 조건에서 선발된 길항 능력이 있는 미생물은 실제 포장의 다양한 환경조건에서 생존하지 못하거나 길항 효과를 발휘하지 못하는 경우가 있으며, 이러한 이유로 외국에서 우수한 길항 미생물이 실제로 우리나라의 환경에서 효과를 발휘하지 못하는 경우가 많다.
또한, 고추와 같이 고부가가치를 생산하는 작물을 재배할 때 수확량 증가를 위하여 과도한 양의 비료를 사용하며 실제 농가에서는 생장 촉진제와 같은 화학약품을 사용하기도 하므로, 환경오염과 독성의 문제를 야기하여 지속적이고 안전한 고추의 생산에 심각한 문제가 발생할 수 있다.
국내 연구기관들이 선진 외국처럼 세균 또는 진균 등을 사용하여 식물병 방제를 위한 길항 미생물 탐색 및 실용화 연구를 하고 있으나 여전히 기초단계의 연구를 수행하고 있다. 또한 작물 재배에서 길항 미생물을 이용한 식물병 방제에 대한 연구는 대학교, 농업관련 국가연구소, 또는 정부출연연구소 등을 중심으로 추진되고 있으나, 아직 국내 연구 인력 및 기술 축적이 불충분하며, 국내 재배 여건에 적용되어 작물 생산에 유용한 농용 생물농약과 비료의 사용 및 실용화는 미미한 실정이다.
한편 식물의 역병은 파이토프토라(Phytophthora)속 등의 난균류에 의해 일어날 수 있다. 또한 탄저병(anthracnose)은 온난다습한 지역의 식물에서 발생하며, 주로 콜레토트리쿰(Colletotrichum) 속이 원인이다. 탄저병균은 잎, 줄기, 과일, 또는 꽃 등 부위를 가리지 않고 파괴하며, 특히 수요가 높은 고추, 여름철 과일인 수박 등 가지과 및 박과 작물에서 특히 심하게 발명한다. 탄저병에 걸리면 식물의 잎, 줄기, 열매, 꽃에 여러 색의 반점들이 생겨나는데, 이 반점들은 점점 커져 조직을 위축시키고 식물을 시들어 죽게 한다. 탄저병을 예방하기 위해서는 병든 부분을 제거하거나 살균제를 살포하거나 식물 사이에 탄저병균을 전파시키는 진드기류와 곤충들을 제거해야 한다. 농가에서 재배되는 대부분의 식물이 이러한 병원균에 의해 피해를 입고 있는 실정이다.
국내 고추 재배에 있어서 고추탄저병, 역병, 세균성 점무늬병, 또는 바이러스병 등이 심각한 피해를 야기한다. 특히 고추 열매의 생산과 관련하여 고추 재배시 발생하는 역병, 및 고추 열매에 발생하는 탄저병에 의한 피해가 매우 심각하며, 이들을 방제하기 위해 권장 사용량 이상의 과도한 유기 합성 농약 살포에 의존하고 있다.
이러한 유기 합성 농약의 오남용으로 인하여 저항성 균주의 출현, 오존층의 파괴, 토양과 작물 내의 잔류 또는 환경 오염 등의 문제가 야기되고 있다. 이러한 유기 합성 농약을 대체하기 위하여 길항 미생물을 이용한 생물적 방제 등의 많은 연구들이 진행되어 오고 있지만, 아직까지 효과적인 길항 미생물을 이용한 생물적 방제가 미미한 실정이다. 특히 환경 보전적 지속 농업과 무농약 고부가가치 산업과 관련하여 역병 및 탄저병의 생물적 방제 연구가 집중적으로 수행되고 있으나, 토양 또는 공기 전염성 병에 대한 이해가 부족하며, 식물의 지하 및 지상부에 발생하는 병원균에 대하여 아직까지 기존의 농용 살균제에 비해 보다 효과적인 길항 미생물을 확보하는데 미비한 실정이다.
종래 기술로는 항균활성을 갖는 신균주 슈도모나스 CP236 및 이를 포함하는 식물병 방제용 조성물(대한민국 등록특허 10-1260170), 또는 슈도모나스 에스피 피에프-1 균주를 이용한 식물병 방제제(대한민국 등록특허 10-0986653) 등이 있다. 그러나 슈도모나스 사포니필라 균주가 식물병을 방제 또는 식물의 생장을 촉진함에 대해서는 알려진 바가 없다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 식물병균을 친환경적이고 효과적으로 사멸시킬 수 있는 새로운 균주를 분리하고, 이를 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 새로운 균주를 이용한 식물병의 방제 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 새로운 균주를 포함하는 식물 생장 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 식물병에 대한 방제 효과 및 식물 생장 촉진 효과를 발휘하는 새롭게 분리, 동정된 슈도모나스 사포니필라(Pseudomonas saponiphila) GHR1-1 균주(KACC 92188P)를 제공한다.
본 발명의 발명자들은 콩의 근권으로부터 미생물을 분리 및 동정하였으며, 분리된 미생물의 인산 가용화능을 검정하여 생육 증진 관련 활성을 검정하고, 대치 배양을 통해 다양한 식물 병원균에 대한 항균 활성을 검정하여 우수한 효과를 가지는 균주를 선별하였고, 이를 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1(KACC 92188P)로 명명하였다.
슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주는 2017년 8월 21일자로 KACC(농업생명공학연구원)에 기탁하였고 기탁번호 KACC 92188P를 부여받았다.
본 발명자들은 선발된 GHR1-1 균주를 16S rRNA 유전자 및 필수 유전자(하우스키핑 유전자, rpoD-gyrB-rpoB)의 염기서열 분석을 통하여 EzTaxon(ChunLab, Korea)의 16S DNA 데이터베이스와 상동성 검색을 수행하고, MEGA 프로그램을 이용하여 계통학적 위치를 확인한 결과, GHR1-1 균주는 슈도모나스 사포니필라와 99%의 유사도를 갖는 슈도모나스 사포니필라 종으로 확인되었다(도 10, 도 12).
본 발명의 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주는 식물 병원균에 대해 우수한 항균 활성을 가져 생물학적 방제 효과가 우수하다. 본 발명의 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주는 탄저병균(Colletotrichum acutatum), 역병균(Phytophthora capcisi), 균핵병균(Sclerotinia sclerotiorum), 검은곰팡이병균(Altanaria altanata), 잎집무늬마름병균(Rhizoctonia solani), 뿌리썩음병균(Fusarium oxysporum), 탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides KACC 40690), 오이검은별무늬병균(Cladosporium cucumerium KACC 40576), 감자역병균(Phytophthora infestans 보성6), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea KACC 40573), 근부병균(Fusarium solani), 궤양병균(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 콩불마름병균(Xanthomonas axonopodis pv. glycines), 및 슈도모나스 시린개 아종 시린개(Pseudomonas syringae subsp. syringae) 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 식물 병원균에 대한 방제 효과가 우수하다. 바람직하게 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주는 탄저병균, 역병균, 균핵병균, 오이검은별무늬병균, 또는 감자역병균에 대하여 현저한 길항 효과를 갖는다.
본 발명의 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주가 방제 효과를 나타내는 식물병은 탄저병, 역병, 균핵병, 검은곰팡이병, 잎집무늬마름병, 뿌리썩음병, 오이검은별무늬병, 감자역병, 잿빛곰팡이병, 근부병, 궤양병, 및 콩불마름병 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 상기 식물 병원균에 의해 발생할 수 있다. 바람직하게 상기 식물병은 탄저병, 역병, 균핵병, 오이검은별무늬병 또는 감자역병일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식물병이 발생할 수 있는 식물, 바람직하게 채소 또는 과일은 고추, 벼, 콩, 오이, 시금치, 쑥갓, 마, 감나무, 매화나무, 복숭아나무, 감귤나무, 밤나무, 또는 사과나무 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게 본 발명의 GHR1-1 균주는 콩 또는 고추에 발생하는 식물병을 효과적으로 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주, 균체, 포자, 이의 배양액, 이러한 배양물의 건조물 또는 이러한 배양물의 추출물을 제공한다.
본 발명의 명세서에 있어서, 용어 '균체'는 균주의 파쇄된 세포벽 분획, 사균, 또는 건조균을 포함하는 의미이다. 배양액 중의 배양 배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 통상의 기술자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동 또는 냉동 건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
본 발명의 명세서에 있어서, 용어 '배양물의 추출물'은 배양물을 다양한 유기용매를 이용해 다양한 생리활성물질이 포함되도록 추출한 것을 의미하며, 이에 한정되는 것은 아니지만, C1-4 알코올(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 아세톤 및 에틸아세테이트 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 유기용매를 단독으로 사용하거나 2종 이상을 순차적으로 사용하여 추출을 수행할 수 있다.
본 발명의 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주는 통상적인 바실러스 속 미생물의 배양법에 의해 대량으로 배양할 수 있다. 배양 배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄 등으로 구성된 배지를 사용할 수 있다. 상기 배양을 위한 배지에는 고체배지 및 액체배지가 모두 포함될 수 있다. 예를 들어, NA(Nutrient Agar) 또는 TSA(Tryptic Soy Agar)와 같은 고체배지를 사용할 수 있으며, 액체 배지로는 균주가 포함되어 있는 NB(Nutrient Broth), KB(King's medium B Broth), PSB(Peptone Sucrose Broth), 또는 TSB(Tryptic Soy Broth)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 배지로는 NB 배지를 사용할 수 있다. 배양은 통상의 배양 조건으로 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주를 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식물병 방제용 조성물은 식물병이 발생할 수 있는 채소 및 과일들, 예를 들어, 고추, 벼, 콩, 오이, 시금치, 쑥갓, 마, 감나무, 매화나무, 복숭아나무, 감귤나무, 밤나무, 또는 사과나무 등에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게, 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 고추 유묘에 처리됨으로써 역병균(Phytophthora capcisi)으로 인해 발병되는 고추역병을 효과적으로 방제할 수 있다.
또한, 본 발명은 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주를 유효성분으로 포함하는 선충 방제용 조성물을 제공한다. 본 발명의 발명자들은 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주가 시안화물(cyanide)를 생성함을 발견하였으며, 이를 이용하여 GHR1-1 균주를 선충의 방제에 효과적으로 이용할 수 있음을 확인하였다. 상기 선충은 농작물에 피해를 입히는 선충으로, 뿌리혹선충, 포낭선충, 또는 뿌리썩이선충 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주를 유효성분으로 포함하는 식물 생장 촉진용 조성물을 제공한다. 바람직하게, 본 발명의 식물 생장 촉진용 조성물은 콩의 종자에 처리되어 콩의 출현율 및 생육을 증진시킬 수 있다.
아울러, 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1의 균체, 포자, 이의 배양액, 이러한 배양물의 건조물 또는 이러한 배양물의 추출물이 상기 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주를 대체하거나 또는 균주에 추가하여 처리될 수 있다. 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주의 생균, 균주, 균체, 포자, 이의 배양액, 이러한 배양물의 건조물 또는 이러한 배양물의 추출물 중 어느 것을 1 이상 선택하여 처리할지 여부는 육묘 환경, 대상 식물의 종류 또는 경제성 등을 고려하여, 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.
이러한 조성물은 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주, 균체, 이의 배양액, 이러한 배양물의 건조물 또는 이러한 배양물의 추출물 중 어느 것을 1 이상 선택한 것을 유효성분으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 식물병 방제용 조성물을 살포 또는 도포하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 식물 생장 촉진용 조성물을 살포 또는 도포하는 단계를 포함하는 식물 생장 촉진 방법을 제공한다.
본 발명의 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1는 예컨대 식물 전체에의 처리, 식물근(root) 처리, 식물 종자 처리, 번식기 중의 식물 조직 처리, 또는 식물 파종이나 식수 전후에 식물 병해 방제 또는 식물 생장 촉진용 매체에 포함시켜 처리하는 방법이 포함될 수 있으며, 이에 제한되지 않고, 당업계 공지된 다양한 방법으로 상기 식물 내지 식물 주변 토양에 처리될 수 있다. 또한, 상기 식물 내지 식물 주변 토양에의 처리는 살포, 도포, 관주, 인필트레이션, 분무, 주사, 코팅, 더스팅 또는 침지 등 당업계 공지된 다양한 방법으로 수행될 수 있으며, 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1의 상태, 육묘 환경, 계절, 대상 식물의 종류, 대상 병원균의 종류 또는 경제성 등을 고려하여 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물은, 실제 포장에서 사용하기 적합한 안정적인 제제화를 목적으로 생화학 농약으로 사용가능한 계면활성제 또는 증량제 등을 사용하여 수화제, 입상수화제, 액상수화제, 액제, 수용제, 수용성입제 또는 캡슐화제의 형태로 제조될 수 있다. 상기 계면활성제의 일예로 알킬(C8C12)아릴설포네이트, 디알킬(C3C6)아릴설포네이트, 디알킬(C8C12)설포숙시네이트, 리그닌설포네이트, 나프탈렌설포네이트축합물, 나프탈렌설포네이트포르말린축합물, 알킬(C8C12)나프탈렌설포네이트포르말린축합물, 폴리옥시에틸렌알킬(C8C12)페닐설포네이트와 같은 설포네이트 화합물의 나트륨염 또는 칼슘염, 알킬(C8C12)설페이트, 알킬(C8C12)아릴설페이트, 폴리옥시에틸렌알킬(C8C12)설페이트, 폴리옥시에틸렌알킬(C8C12)페닐설페이트와 같은 설페이트 화합물의 나트륨염 또는 칼슘염, 폴리옥시알킬렌숙시네이트와 같은 숙시네이트화합물의 나트륨염 또는 칼슘염, 나트륨 벤조에이트, 알킬카르복실레이트 등의 음이온성 계면활성제, 폴리옥시에틸렌알킬(C12C18)에테르, 폴리옥시에틸렌알킬(C8C12)페닐에테르, 폴리옥시에틸렌알킬(C8C12)페닐폴리머, 에틸렌옥사이드 프로필렌옥사이드 코폴리머와 같은 비이온성 계면활성제, 폴리카복실레이트, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상이 혼합되어 사용될 수 있으며, 이들 이외의 다른 계면활성제들도 사용될 수 있음은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 갖은 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다.
증량제로는 벤토나이트(bentonite), 활석, 클레이, 카올린, 탄산칼슘, 규사, 경석, 규조토, 산성 백토, 제올라이트, 펄라이트, 화이트 카본, 암모늄 설페이트, 요소, 포도당, 덱스트린(dextrin), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 포도당 및 전분, 물 등이 단독으로 또는 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있으며, 이들 이외의 다른 증량제들도 사용될 수 있음은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 갖은 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식물병 방제용 조성물의 제조 방법을 제공한다. 상기 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주의 배양 방법 및 식물병 방제용 조성물의 제조 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주는 여러 가지 식물병에 대해 우수한 방제 활성을 나타내므로 환경 친화적인 천연물 살균제의 개발 및 고부가가치의 유기농산물 생산에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주는 식물 생장 촉진 효과가 우수하다.
도 1은 Pikovskaya’s 배지를 사용하여 분리된 균주들의 인산 가용화 활성을 확인한 결과이다.
도 2는 시안화물 테스트 키트를 이용하여 GHR1-1 균주의 시안화물 생성 여부를 확인한 결과이다.
도 3은 콩의 종자에 GHR1-1 균주를 포함한 여러 균주를 처리한 후, 7일 간격으로 두 번 콩의 출현율(n=10)을 조사한 결과이다.
도 4는 GHR1-1 균주를 콩에 처리한 후 식물 생장 촉진 효과를 검정한 결과이다.
도 5는 GHR1-1 균주의 IAA(indole acetic acid) 생성능을 확인한 결과이다.
도 6은 GHR1-1 균주에 의한 휘발성 물질의 생성 및 이의 식물 병원균 생장 억제능을 확인한 결과이다.
도 7은 GHR1-1 균주를 고체 배지에서 대치 배양하여 탄저병균(Colletotrichum acutatum), 역병균(Phytophthora capcisi), 균핵병균(Sclerotinia sclerotiorum), 검은곰팡이병균(Altanaria altanata), 잎집무늬마름병균(Rhizoctonia solani), 또는 뿌리썩음병균(Fusarium oxysporum)에 대한 길항 활성을 확인한 결과이다.
도 8은 GHR1-1 균주를 고체 배지에서 대치 배양하여 탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides KACC 40690), 오이 검은별무늬병균(Cladosporium cucumerium KACC 40576), 감자역병균(Phytophthora infestans 보성6), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea KACC 40573), 또는 잎집무늬마름병균(Rhizoctonia solani KACC 40123)에 대한 길항 활성을 확인한 결과이다.
도 9는 고추 유묘에 GHR1-1 균주를 처리하고 2주 후 고추역병 포자를 접종하여 방제 활성을 검정한 결과이다.
도 10은 GHR1-1 균주의 16S rRNA를 이용하여 Neighbor-Joining 방법을 통해 계통유전학적으로 분석한 결과이다.
도 11은 GHR1-1 균주의 16S rRNA의 유전자 염기서열(1,475bp)을 나타낸다.
도 12는 GHR1-1 균주의 rpoD-gyrB-rpoB 유전자를 이용하여 계통유전학적 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 13은 GHR1-1 균주의 rpoD-gyrB-rpoB 유전자 염기서열(1,715bp)을 나타낸다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 길항 미생물 분리 및 선발
식물병을 억제하는 길항 미생물을 선택적으로 분리하기 위해서, 콩의 근권으로부터 400여종의 균주를 분리하였다. 분리된 균주들의 인산 가용화능을 평가함으로써 생육 증진 관련 활성을 검정하였다. 또한, 분리된 균주들을 후자리움 솔라니(Fusarium solani), 콜렉토트리쿰 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 클라비박터 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 잔토모나스 악소노포디스 pv. 글리시네스(Xanthomonas axonopodis pv. glycines), 또는 슈도모나스 시린개 subsp. 시린개(Pseudomonas syringae subsp. syringae)와 대치 배양함으로써 생장 억제 활성을 검정하고, 우수한 길항 활성을 갖는 GHR1-1 균주를 선발하였다.
샘플 인산
가용화능 		Fusarium solani Colletotrichum gloeosporioides Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis Xanthomonas axonopodis pv. glycines Pseudomonas syringae subsp. syringae
Pikovskaya’s medium KACC 44891 KACC 40690 KACC 16995 KACC 11144 KACC 10604
GHR-3 + - - ++ - -
GHR1-1 +++ +++ +++ ++ - w
FSR-1 w w - +++ - -
FSR3-14 - - w ++ - -
CWRS1-8 ++ w - + - -
CWRS1-17 + - - - - -
HWAN-3 - + + - - -
CWR1-22 + - - +++ - -
CWN1-4 + - - ++ - -
CWR2-29 + + + - - -
JR4 - + - - - -
※ 균사 생육 저지 정도: +, 1~5mm; ++, 5~10mm; +++, 10.1~30mm; w, 1mm 미만)
실시예 2: 인산 가용화 활성 검정
선발된 균주의 인산 가용화 활성을 조사하기 위해, Pikovskaya’s 배지를 제조하였다. 상기 배지에 GHR1-1 균주를 배양한 결과, 투명환이 생성되어 인산 가용화 활성이 있는 것으로 확인되었다(도 1).
실시예 3: 시안화물 생성 검정
시안화물(cyanide) 테스트 키트(Merck)를 이용하여 균주의 시안화물 생성 여부를 확인하였다. 실험 결과, GHR1-1 균주는 약 25mg/L의 시안화물을 생성하는 것을 확인하였다(도 2). 이로부터 본 발명의 GHR1-1 균주를 선충 방제에 효과적으로 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4: 식물 생육 증진 활성 검정
선발된 균주의 식물 생육 증진 활성을 검정하기 위해, 먼저 콩을 70% 에탄올및 NaOCl을 이용하여 소독하였다. 실험 균주는 0.03M MgSO4에 희석(OD=0.6)하여 준비하고, 콩을 희석액에 1시간 침지하고 풍건하였다. 상토 및 밭토양을 1:1의 중량비로 섞어 만든 포트에 콩을 파종하였다. 7일 간격으로 두 번 콩의 출현율을 비교하였으며(도 3), 40일 후에 콩의 크기를 비교하였다(도 4).
실험 결과, GHR1-1 균주가 처리된 콩의 출현율은 대조군 및 다른 균주들에 비해 현저하게 우수하였다. 또한, GHR1-1 균주가 처리된 콩은 식물체의 생육도 현저하게 증진되었다.
실시예 5: IAA 생성능 검정
GHR1-1 균주의 IAA(indole acetic acid) 생성능을 GH1-13 균주와 비교 실험하였다. GHR1-1 균주는 트립토판을 첨가하지 않았을 때 다른 균주에 비해 IAA를 적게 생산(9.99mg)하였다. 일반적으로 균주에 트립토판이 첨가되면 GH1-13 균주와 같이 IAA 생성이 증가하지만, GHR1-1 균주는 오히려 약간 감소(8.90mg)하는 양상을 보였다(도 5).
실시예 6: 휘발성 물질 생성 및 활성 검정
I-plate를 이용하여 GHR1-1 균주에 의한 휘발성 물질의 생성 및 식물 병원균의 생장 억제능을 조사하였다(도 6). 실험 결과, GHR1-1 균주에서 발생한 휘발성 물질은 탄저병균(Colletotrichum acutatum), 역병균(Phytophthora capcisi), 균핵병균(Sclerotinia sclerotiorum), 검은곰팡이병균(Altanaria altanata), 잎집무늬마름병균(Rhizoctonia solani), 또는 뿌리썩음병균(Fusarium oxysporum)의 생육을 현저하게 억제하는 것으로 나타났다. GHR1-1 균주의 휘발성 물질은 균핵병균(Sclerotinia sclerotiorum)을 가장 강력하게 억제하였다.
실시예 7: 식물 병원균 길항 활성 검정
GHR1-1 균주를 고체 배지에서 대치 배양하여, 여러 종류의 식물 병원균에 대한 길항 활성을 검정하였다(도 7). GHR1-1 균주는 탄저병균(Colletotrichum acutatum), 역병균(Phytophthora capcisi), 균핵병균(Sclerotinia sclerotiorum), 검은곰팡이병균(Altanaria altanata), 잎집무늬마름병균(Rhizoctonia solani), 또는 뿌리썩음병균(Fusarium oxysporum)의 생육을 현저하게 억제하는 것으로 나타났다. GHR1-1 균주의 억제 활성은 탄저병균(Colletotrichum acutatum), 역병균(Phytophthora capcisi), 또는 균핵병균(Sclerotinia sclerotiorum)에 대하여 강하게 나타났다.
또한, GHR1-1 균주를 탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides KACC 40690), 오이 검은별무늬병균(Cladosporium cucumerium KACC 40576), 감자역병균(Phytophthora infestans 보성6), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea KACC 40573), 또는 잎집무늬마름병균(Rhizoctonia solani KACC 40123)와 대치 배양하여 길항 활성을 검정하였다(도 8). GHR1-1 균주의 길항력은 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea KACC 40573), 또는 잎집무늬마름병균(Rhizoctonia solani KACC 40123)에 비해, 탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides KACC 40690), 오이 검은별무늬병균(Cladosporium cucumerium KACC 40576), 또는 감자역병균(Phytophthora infestans 보성6)에서 강하게 나타났다.
실시예 8: 고추역병 방제 활성 검정
고추 유묘에 GHR1-1 균주를 1×107 cfu/ml 농도로 관주 처리하고, 2주일이 지난 후 고추역병 포자(100 zoospore)를 접종하여 방제 활성을 검정하였다. GHR1-1 균주가 처리된 군은 무처리 대조구에 비해 2일차에서 83%, 3일차에서 57%의 방제가를 보였으며(도 9), 이를 통해 고추역병에 대한 방제 효과가 현저하게 우수한 것을 확인하였다.
실시예 9: GHR1-1 균주의 동정
GHR1-1 균주를 동정하기 위해 16S rRNA 유전자(서열번호 1, 도 11)를 분석하였다. GHR1-1 균주를 TSB(Tryptic Soy Broth; Bacto)에 접종하여 30℃에서 24시간 배양 후 원심 분리하여 균체를 수확하였다. Genomic Plus DNA prep kit (Inclone, Korea)를 사용하여 수확한 균체에서 DNA를 분리하였다. 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위해서 universal primer인 27F 및 1492R을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 DNA 정제키트(QIAquick PCR Purification kit, Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 염기서열 분석은 제노텍(Genotech Co, Korea)에 의뢰하여 결정하였다.
비교 표준 균주의 염기서열은 EzTaxon 데이터베이스를 통해서 다운로드 받아, MEGA 6.0 프로그램의 ClustalW 프로그램으로 염기서열의 정렬을 수행하였다Tamura et al., 2013). 계통도는 정렬된 염기서열을 Neighbor-joining 알고리즘(Saitou and Nei, 1987)을 이용하여 작성하였다. 계통도 견고성을 확인하기 위해서 1000회 반복으로 bootstrapping (Felsenstein, 1985)을 수행하여 수치를 계통도에 표시하였다.
분석 결과, GHR1-1 균주는 Pseudomonas 속이며, P. protegens (99.32%) 또는 P. saponiphila (99.05%) 균주와 높은 상동성을 보였다. 염기서열을 정렬하고 1,410bp로 맞춘 후 Neighbor-Joining 방법을 이용하여 계통유전학적으로 분석한 결과, GHR1-1 균주는 P. saponiphila에 더 가까운 것으로 분석되었다(도 10).
또한, 정확한 분류 동정을 위해 GHR1-1 균주의 필수 유전자(House keeping genes) rpoD-gyrB-rpoB를 이용하여 연쇄(concatenated) DNA 염기서열을 제조하고(서열번호 2, 도 13), 이에 계통유전학적인 분석을 수행하였다. 분석 결과, GHR1-1 균주는 P. saponiphila로 동정되었다(도 12).
농업생명공학연구원 KACC92188P 20170821
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Claims (10)

  1. 탄저병, 역병, 균핵병, 검은곰팡이병, 오이검은별무늬병, 감자역병, 근부병, 궤양병, 및 콩불마름병으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 식물병에 대한 방제 효과, 및
    식물 생장 촉진 효과를 발휘하는 슈도모나스 사포니필라(Pseudomonas saponiphila) GHR1-1 균주(KACC 92188P).
  2. 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주(KACC 92188P), 이의 배양액 또는 배양액 추출물을 유효성분으로 포함하는,
    탄저병, 역병, 균핵병, 검은곰팡이병, 오이검은별무늬병, 감자역병, 근부병, 궤양병, 및 콩불마름병으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 식물병 방제용 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 식물병은 콜렉토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 피토프토라 캡시시(Phytophthora capcisi), 스크렐로티니아 스크렐로티오름(Sclerotinia sclerotiorum), 알타나리아 알타나타(Altanaria altanata), 콜렉토트리쿰 글로에오스포리오이데스 KACC 40690(Colletotrichum gloeosporioides KACC 40690), 클라도스포리움 쿠쿠머리움 KACC 40576(Cladosporium cucumerium KACC 40576), 피토프토라 인페스탄스 보성6(Phytophthora infestans 보성6), 후자리움 솔라니(Fusarium solani), 클라비박터 미시가넨시스 아종 미시가넨시스(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis), 잔토모나스 악소노포디스 병원체변종 글리시네스(Xanthomonas axonopodis pv. glycines), 및 슈도모나스 시린개 아종 시린개(Pseudomonas syringae subsp. syringae)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 식물 병원균으로 인해 발생하는 식물병 방제용 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제2항의 식물병 방제용 조성물을 식물체에 살포 또는 도포하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 방법은 고추, 벼, 콩, 오이, 시금치, 쑥갓, 마, 감나무, 매화나무, 복숭아나무, 감귤나무, 밤나무, 및 사과나무로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 식물체에 식물병 방제용 조성물을 살포 또는 도포하는 식물병 방제 방법.
  8. 슈도모나스 사포니필라 GHR1-1 균주(KACC 92188P)를 배양하는 단계를 포함하는,
    탄저병, 역병, 균핵병, 검은곰팡이병, 오이검은별무늬병, 감자역병, 근부병, 궤양병, 및 콩불마름병으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 식물병 방제용 조성물의 제조 방법.
  9. 삭제
  10. 삭제
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