KR20130032100A - 작물의 생육촉진 및 내한성 증강효과를 갖는 신규한 바실러스 발리스모티스 ｂｓ０７ｍ 균주 및 이를 포함하는 미생물제제 - Google Patents

작물의 생육촉진 및 내한성 증강효과를 갖는 신규한 바실러스 발리스모티스 ｂｓ０７ｍ 균주 및 이를 포함하는 미생물제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 작물의 생육촉진 및 내한성 증강효과를 갖는 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 및 이를 포함하는 미생물제제에 관한 것이다.
본 발명의 신규미생물 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis ) BS07M 균주 KCTC11991BP는 서열번호 1로 표현되며 작물의 생육촉진 및 작물의 내한성 증강효과를 갖는 것이 특징이며, 본 발명의 미생물 제제는 상기의 신규미생물 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis ) BS07M 균주 KCTC11991BP의 균체 또는 그 배양액을 포함하는 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 식물병원균에 대한 직접적인 억제능뿐만 아니라 식물병에 대한 저항성을 유도하고 면역기능활성이 증강되어 작물의 생육을 촉진시킴과 동시에 작물의 내한성 증강효과도 갖는 신규 미생물인 바실러스 발리스모티스 BS07M 및 이를 함유하는 미생물제제가 제공된다.

Description

작물의 생육촉진 및 내한성 증강효과를 갖는 신규한 바실러스 발리스모티스 ＢＳ０７Ｍ 균주 및 이를 포함하는 미생물제제{NOVEL BACILLUS VALLISMORTIS BS07M WITH PROMOTING EFFECT OF PLANT GROWTH AND IMPROVING EFFECT OF COLD-TOLERANCE, AND MICROBIAL AGENT CONTAINING THE SAME}
본 발명은 작물의 생육촉진 및 내한성 증강효과를 갖는 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 및 이를 포함하는 미생물제제에 관한 것으로서, 특히 식물병원성균의 생육을 억제하고, 유도저항성에 의한 작물의 면역기능을 활성화하여 작물생육을 촉진하며, 작물의 내한성도 증강되도록 한 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 및 이를 포함하는 미생물제제에 관한 것이다.
최근 화학농약 남용에 따른 농업생태계 오염과 안전농산물에 대한 사회적 관심이 높아지면서 화학약제로 방제가 어려운 각종 병해를 대상으로 미생물을 이용한 친환경적 생물방제 방법이 시도되고 있다.
종래에는 병원균에 대한 항균작용을 주로 하는 미생물을 생물적 방제에 이용하여 왔으나, 최근에는 병에 대한 저항성을 작물체에 유도할 목적으로 미생물을 미리 작물체에 선 접종함으로써 작물체내에 유도되는 저항성 반응(Induced Systemic Resistance, " ISR" )을 이용하고 있다.
이러한 식물병에 대한 저항성을 유도하는 미생물은 세균에 속한 다양한 종류의 미생물이 관여하나, 그 중에서도 바실러스(Bacillus) 속 등이 알려져 있으며, 실용화되는 균주는 소수에 불과하고, 또한 동일한 속명에 속한 균주들도 종에 따라 작물에 대한 유도저항성의 면역기능활성은 상당한 차이를 보이고 있어서 우수한 균주의 선발이 필요하다.
이를 위해 식물병에 대한 유도저항성을 안정적으로 나타내면서 작물 유묘기에 효율적으로 처리하여 작물생육 후기까지 면역기능을 나타내는 우수한 기능을 가진 균주선발이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 식물병원균에 대한 직접적인 억제능뿐만 아니라 식물병에 대한 저항성을 유도하고 면역기능활성이 증강되어 작물의 생육을 촉진하고, 작물의 내한성도 증강되도록 한 신규 미생물인 바실러스 발리스모티스 BS07M 및 이를 함유하는 미생물제제를 제공하는데 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 신규미생물 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis ) BS07M 균주 KCTC11991BP는 서열번호 1로 표현되며 작물의 생육을 촉진하는 것이 특징이며, 특히 식물병원성균의 항균활성능, 식물병에 대한 면역기능 활성능, 작물의 내한성 증대능을 갖는 것이 특징이다.
상기 작물은 고추, 오이, 담배 중 선택된 어느 하나인 것이 특징이다.
상기 식물병원성균은 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 보트리티스 시네리아(Botrytis Cinerea), 페니실리움 이타리쿰(Penicillium italicum), 페니실리움 익스판숨(Penicillium expansum), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스크레로티니아 스크레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum) 중 선택된 어느 하나인 것이 특징이다.
상기 식물병은 고추역병(Phytophthora capsici), 고추무름병(Pectobacterium carotovora), 고추 탄저병(Colletotrichum acutatum), 오이모자이크바이러스(cucumber mosaic virus) 중 선택된 어느 하나인 것이 특징이다.
또한, 본 발명의 신규미생물 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis) BS07M 균주 KCTC11991BP는 서열번호 1로 표현되며 작물의 내한성 증대능을 갖는 것이 특징이다.
상기와 같은 신규 미생물은 미생물 농약, 미생물 비료, 종자코팅제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 중 어느 하나의 유효성분으로 이용되는 것이 특징이다.
본 발명의 미생물 제제는 상기의 신규미생물 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis ) BS07M 균주 KCTC11991BP의 균체 또는 그 배양액을 포함하는 것이 특징이다.
본 발명의 작물 생육촉진방법, 식물병원성균의 방제방법 및 작물의 내한성을 증강시키는 방법은 상기의 신규미생물을 포함하는 미생물 제제를 작물에 살포 또는 토양관주하여 처리하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의해, 작물의 내한성이 증강되어 냉해에 견디는 특징을 갖는 신규 미생물 바실러스 발리스모티스 BS07M이 제공된다.
또한 상기 신규 미생물 바실러스 발리스모티스 BS07M은 식물병해억제 및 식물생육촉진효과도 종래의 효과보다도 현저히 우수하다. 이에, 본 발명의 신규 미생물 및 이를 포함하는 미생물제제를 이용하면 식물병원균을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라 식물면역기능의 활성증대로 병해가 현저히 감소하고 이로 인해 작물생육촉진 효과도 우수하게 나타나 친환경농업에 유용하게 활용된다.
도 1은 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M(Bacillus vallismortis BS07M)균주의 16S rRNA gene sequence를 이용한 계통분류학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 2는 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주의 토양관주 처리에 의한 고추육묘의 생육증진효과를 나타낸 도면이다.
도 3은 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 처리에 의한 고추과실의 생육증진효과를 나타낸 도면이다
도 4는 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주의 식물병원성균에 대한 항균활성을 나타낸 도면이다.
도 5는 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 처리에 의한 병저항성 유전자 발현을 나타낸 도면이다.
1. Col O: 애기장대 야생형
2. etr3-5: 유전자로 형질전환된 애기장대
3. nah G: PR 유전자를 발현할 수 없게 형질 전환된 애기장대
4. npr1: 유전자로 형질전환된 애기장대
도 6은 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 처리에 의한 오이유묘 뿌리의 리그닌 집적을 나타낸 도면이다.
도 7은 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 처리 시 고추유묘의 팩토박테리움 캐로토보라(Pectobacterium carotovora ) SCC1에 대한 유도저항성 발현을 나타낸 도면이다.
도 8은 노지재배 조건에서 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 처리 시 고추 탄저병 억제효과를 나타낸 도면이다.
도 9는 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 처리 시 오이모자이크바이러스의 억제효과를 나타낸 도면이다.
도 10은 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 처리에 의한 오이의 내한성증대 효과를 나타낸 도면이다.
도 11은 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 처리에 의한 담배유묘의 내한성증대 효과를 나타낸 도면이다.
본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 작물생육촉진 및 작물의 내재해성 증가 및 식물병 방제효과가 우수한 신규한 바실러스 바리스모티스 BS07M(Bacillus vallismortis BS07M) 균주를 선발하였다.
상기 선발된 균주에서 수득한 16S rRNA의 상동성을 비교분석한 바, 바실러스 바리스모티스(Bacillus vallismortis)의 신규한 균주로 밝혀져, 이를 바실러스 바리스모티스 BS07M(Bacillus vallismortis BS07M)로 명명하고, 이 균주를 한국생명공학연구원에 기탁하여 2011년 07월 28일 수탁번호 KCTC11991BP를 부여받았다.
본 발명의 신규미생물 바실러스 바리스모티스 BS07M(Bacillus vallismortis BS07M)는 서열번호 1로 기재되는 염기서열 전체 또는 그것의 일부로 이루어지며, 1478bp의 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 구성된다.
상기의 신규 균주의 균체 또는 이 균체의 배양액을 포함하는 미생물 제제를 대상으로 작물의 생육촉진과 면역기능의 강화를 확인한 바, 모든 작물에 대해 도시되어 있지는 않으나 작물의 종류와 상관없이 그 생육촉진과 면역기능 강화 효과 및 내한성 증강효과를 얻을 수 있으며, 그 중 특히 고추, 오이, 담배에 대해서 가장 우수한 생육촉진과 면역기능 강화 효과 및 내한성 증강효과들을 나타냄을 확인하였다. 즉, 상기 신규 균주를 고추에 처리할 경우 고추수량이 30% 이상 증가된다.
또한, 탄저병 등 주요 식물병원균을 억제하는 강력한 항균 물질도 생산하며, 공시병원균인 고추역병(Phytophthora capsici), 고추무름병(Pectobacterium carotovora), 고추 탄저병(Colletotrichum acutatum), 오이모자이크바이러스(cucumber mosaic virus ) 등에 대한 복합병해 저항성도 나타낸다.
또한, 병저항성 유전자가 발현되어 살리실산 경로를 통한 면역기능이 강화된다.
또한, 상기 신규 균주를 작물에 처리한 후 4 ℃이하의 저온에서 24시간이상 노출하여도 100%의 생존율을 보이므로 작물의 내한성도 증대시켜 준다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 실험예에 의해 보다 구체적으로 설명하기로 한다.
< 실시예 1> 균주의 분리 및 선발
식물 병에 대한 면역기능을 활성화시키는 우수한 균을 분리하기 위하여 전국 각지의 농경지에서 식물근권토양을 채취하였다.
채취한 시료를 멸균수에 넣고 진탕한 후 희석평판법에 의해 단계별 희석액을 제조하여 고체배지인 TSA 배지에 도말하였다.
30℃에 2일간 배양한 후 배지표면에 나타난 세균 바실러스 발리스모티스(Bacillus valismortis) BS07M 균주를 순수 분리하였다.
순수 분리된 균주를 오이탄저병(Colletotrichum orbiculare)에 대한 유도저항성을 검정하였다.
은성백다다기 오이품종의 종자를 1% 소디움 클로라이드로 표면살균한 후 플라스틱 폿드에 파종하여 2주 후 공시분리균주의 현탁액을 관주처리 하였다.
1주 후 관주처리 된 잎에 오이탄저병균의 포자현탁액을 잎에 살포하여 형성된 병반을 조사하여 식물 병에 대한 저항성을 보이는 가장 우수한 균주인 바실러스 발리스모티스(Bacillus valismortis) BS07M을 선발하였다.
< 실시예 2> 본 발명 신규 균주의 동정
상기 실시예 1에서 선발한 균주의 동정은 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 이용하였다.
(1) 16S rRNA 염기서열 분석
세균의 동정을 위해서는 16S rRNA 유전자 염기서열분석을 이용하였다.
즉, DNA 추출키트(DNA extraction kit)로 분리균주의 DNA를 추출한 후 universal primer인 fD1(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')과 rP2(5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')를 이용하여 16S rDNA gene을 PCR을 통해 증폭하였다.
이렇게 얻어진 PCR 산물은 DNA 시퀀싱 키트(DNA sequencing kit)를 사용하여 반응시킨 후, 유전자분석기(3100 Genetic Analyser)로 염기의 서열을 분석하였다. 염기서열은 NCBI 서버(server)의 BLAST 프로그램을 통해 속(genus)까지 동정하였다.
균주 간 유연관계를 분석하기 위하여 16S rDNA 염기서열은 CLUSTAL W 프로그램을 이용하여 표준균주의 염기서열과 정렬하였다. 데이터셋의 진화계통수 작성은 MEGA version 프로그램을 이용하였다. branch의 안정성(bootstrap value)은 1,000회의 재표본화(resampling)을 통하여 조사하였다.
분자 계통분류학적 분석결과 도 1에서 나타낸 바와 같이, 바실러스 발리스모티스 BS07M균주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) , 바실러스 모자벤시스(Bacillus mojavensis), 바실러스 발리스모티스(Bacillus vallismortis) 와 유연관계가 높았으며, 그 중 Bacillus vallismortis와 유연관계가 가장 높아 Bacillus vallismortis로 동정하였다. 이에 2011년 7월 28일 한국생명공학연구원에 기탁하였으며, 수탁번호는 KCTC11991BP이며, 이 신규 미생물은 바실러스 발리스모티스(Bacillus vallismortis) BS07M으로 명명하였다.
< 실시예 3> 본 발명의 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주의 배양
상기와 같이 명명된 바실러스 발리스모르티스 BS07M를 사용하며, 이는 초저온조(-80 ℃)에 보관중인 바실러스 발리스모르티스 BS07M을 멸균된 TSA(Tryptic soy agar) 배지에 도말하여 30 ℃에서 48시간 배양하여 재활성화시켰다. (이때 멸균된 TSB 액체배지에 바실러스 발리스모르티스 BS07M을 접종한 다음 30 ℃에서 48시간 배양하여 재활성화시키기도 한다.)
상기와 같이 배양된 균체를 수거하여 1ℓ의 멸균수 또는 0.2M-인산완충액(phosphate buffer)에 넣어 109~1010 cfu/㎖ 균체 현탁액을 준비하였다.
이 균체현탁액을 106~107 cfu/ 의 농도로 희석하여 하기 토양관주 및 식물처리 실험에 사용하였다.
< 실험예 1> 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주의 고추생육촉진능 확인
1) 비닐하우스 조건
상기 실시예 3의 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주의 균체 현탁액을 준비하였다.
비닐하우스 조건에서 육묘기 동안 근권 토양에 상기 균체 현탁액을 관주처리 하였다.
구체적으로 설명하면, 먼저 본엽 2~3엽기에 상기 바실러스 발리스모르티스 BS07M 균체(109 cfu/㎖) 현탁액을 100배 희석하여 관주하였다. 그리고 나서 10일 간격 2회 정도 근권토양에 관주하였다.
그 결과, 도 2와 하기 표 1,2와 같이 나타났다.
즉, 도 2에 나타나 있듯이 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 처리구에서 육묘기 생육촉진효과가 현저히 양호하게 나타남을 확인하였으며, 그 후의 생육의 결과에서도 그 생육량이 증가함을 볼 수 있었다.
처리 초장(cm) 줄기직경
(mm)		 과수
(개/주)
5.28 6.18 6.28 7.19 7.19 7.19
대조구 23.70 50.50 70.83 101.90 11.9 41.4
병저항성 유도제
(0.1mM-BTH)		 20.90 58.08 76.17 116.20 11.0 33.8
본 발명
(BS07M)		 27.10 73.50 102.50 132.80 13.9 53.0
LSD(p=0.05) 1.20 5.71 5.71 8.50 1.7 14.8
*LSD(least sinificant difference): 최소 유의차
또한, 상기 표 1에 나타나 있듯이 초장, 줄기직경의 생육량은 대조구와 병저항성 유도제인 0.1mM BTH 처리구 보다도 본 발명의 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 처리구가 현저히 우수하게 나타날 뿐만 아니라 고추 수량에 영향을 미치는 주당 과수에도 본 발명의 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 처리구가 월등히 많게 나타남을 확인하였다.
처리
 수량(kg/plot) 총과중
(kg)
5일 17일 30일
대조 16.0 35.8 42.0 93.8
Bacillus subtillis S08 22.0 40.4 34.0 96.4
Bacillus vallismortis BS07M(본 발명) 20.0 45.4 37.0 102.4
Bacillus subtillis BS5b 20.0 38.6 40.0 98.4
또한, 상기 표 2에 나타나 있듯이 바실러스(Bacillus)의 균주간에 있어서도 큰 차이를 나타냄을 확인하였다. 즉, 고추의 총 과중에서 다른 바실러스(Bacillus) 균주들 보다 본 발명인 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 처리구가 가장 높게 나타나 우수한 증수효과를 나타냄을 알 수 있었다.
2) 노지조건
육묘기 동안은 상기 비닐하우스 조건과 동일하게 비닐하우스 내 근권 토양에 상기 균체 현탁액을 관주처리 하였다. 그 후 정식기에 노지로 정식하여 대조구와 비교하였다.
그 결과, 하기 표 3과 같이 나타났다.
처리 초장(cm) 수량(g)/주 과일수 과실내경(mm) 과피두께(mm)
관행구(대조구) 127.1 795.0 31.1 21.58 2.34
BS07M(본 발명) 131.5 929.0 40.1 26.08 3.3
LSD(p=0.05) 16.0 29.0 10.8 2.1 0.5
*LSD(least sinificant difference): 최소 유의차
상기 표 3에 나타나 있듯이, 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 처리구에서 고추의 초장, 과실내경, 과피두께 등 생육량이 관행구(대조구)에 비해 월등히 우수하고 과일수와 수량이 증가됨을 볼 수 있었다.
또한, 도 3에서 보는 바와 같이 고추 과실의 크기가 관행구(대조구)보다 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 처리구가 더 굵고 길게 나타나, 그 생육량이 증가되었음을 확인하였다.
< 실험예 2> 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주의 식물병원균에 대한 항균활성 효과확인
신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주의 주요 식물병원균에 대한 항균활성효과는 도 4에 나타낸 바와 같다.
즉, 본 발명의 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주는 식물병원성진균인 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata ), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 페니실리움 이타리쿰(Penicillium italicum), 페니실리움 익스판숨(Penicillium expansum KC08001), 페니실리움 익스판숨(Penicillium expansum JVV81), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum,), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스크레로티니아 스크레로티룸(Sclerotinia sclerotirum,)의 생육을 억제하는 활성을 나타냄을 확인하였다.
그 중에서도 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 알터나리아 알터네이타(Alternaria alternata), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea)와 스크레로티니아 스크레로티룸(Sclerotinia sclerotirum)를 가장 잘 억제하는 것으로 나타나, 상기와 같은 식물 병원균에 대해 높은 항균활성을 나타냄을 알 수 있었다.
< 실험예 3> 신규한 바실러스 발리스모르티스 BS07M 균주 처리에 의한 유도저항성 증진활성의 확인
1) 실험방법
(1) 애기장대 식물체의 재배
신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주처리시 유도저항성 증진 활성에 의한 항진균성 유전자의 발현 변화를 확인하기 위하여, 애기장대 야생형(Col 0) 및 형질전환주(부모 애기장대 생태형으로부터 유래된 PR 유전자를 발현할 수 없게 형질 전환된 애기장대(nah G: SA), 유전자로 형질전환된 애기장대 (etr3-5, npr1)를 사용하였다.
이때, 애기장대 야생형(Col 0)은 센터로부터 얻었고, 상기 nah G 형질전환 식물(애기장대)은 살리실산염 디하이드로게나제(salicylate dehydrogenase)를 암호화하고 SA를 분해하는 것으로 알려져 있다.
애기장대 종자를 표면살균(70% 에탄올에 2분간 침지하고 1% 차아염소산나트륨에 20분간 침지)하고 살균된 증류수에 3회 세척한 후, 0.8% 아가 및 1.5% 수크로스가 포함되고 pH 5.7로 조절된 절반 농도의 MS(Murashige-Skoog) 배지가 담긴 페트리 디쉬에 올려놓은 후, 빛을 차단한 4 ℃ 상태에서 2일간 종자의 발아를 촉진시킨 후 유묘를 12시간-빛(light)/12시간-암(dark) 주기로 설정된 식물생장상에 넣고 40W 형광등 하에서 방치하였다.
상대습도 50 내지 60%에서, 온도는 22±1 ℃로 유지하였다. 2주 후, 상기 묘목을 24시간의 간격을 두고 1시간 동안 2회 고압증기 멸균된 화분용 영양토(potting soil) 혼합물이 포함된 60 ㎖의 화분에 옮겨 심었다.
상기 묘목을 화분에 옮겨심기 전에, 상기 화분용 영양토는 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 현탁액 또는 동일 용량의 살균증류수 중 어느 하나로 처리하였다. 자란 식물체는 70%의 상대습도 하에서 9시간 주(200 μE/m2s, 24℃) 및 15시간 야(20℃) 주기로 식물생장 상에서 재배하였다.
상기 식물체는 격일로 관수하였으며 일주일에 한번 변형된 절반 농도의 호글랜드 영양분 용액(Hoagland nutrient solution)을 처리하였다. 2주 후, 상기 애기장대 식물체에 실시예 3의 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주의 균체 현탁액을 토양관주하였다.
(2) 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주처리에 의한 방어유전자 발현의 확인
상기와 같이 준비된 애기장대 식물체에 실시예 3의 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주의 균체 현탁액을 108 cfu/㎖ 농도로 토양관주한 뒤 1주 후, RNA 분석을 위하여 상기 식물체로부터 잎 조직을 수득하였다.
애기장대의 총 RNA는 적어도 2 g의 얼린 조직을 동일 용량의 추출 완충용액 (0.35 M Glycine, 0.048 M NaOH, 0.34 M NaCl, 0.04 M EDTA, 4% (w/v) SDS)에 균질화하여 추출하였다. 그런 다음, 균질 현탁액을 페놀 및 클로로포름을 사용하여 추출하였고, RNA는 LiCl로 침전시켰다.
RT-PCR은 Ex Taq polymerase를 사용하여 수행하였다.
반응 혼합물은 20 ㎕의 완충용액에 cDNA 0.1 ㎍, 정방향 및 역방향 프라이머 각각 10 pMol, dNTP 250 nM, 및 0.5U의 Ex Taq polymerase를 포함하도록 제조하였다.
상기 PCR은 94℃에서 5분간 처리한 후, 94℃에서 1분, 57℃에서 1분간 처리하는 것을 25 사이클 조건으로 실시하였고, 최종 72℃에서 10분간 연장반응을 실시하였다.
방어 유전자에 대한 프라이머는 PDF1.2 유전자에 대한 프라이머로써, 정방향 프라이머 5'-TGCGGTAACACCGAACCATAC-3' (서열번호 1) 및 역방향 프라이머 5'- CGACAGTTGCATTGGTCCTCT-3'(서열번호 2)을 사용하였고, PR-1 유전자에 대한 프라이머로써, 정방향 프라이머 5'-AACCGCCAAAAGCAAACGCA-3'(서열번호 3) 및 역방향 프라이머 5'-TCACGGAGGCACAACCAAGTC-3'(서열번호 4)을 사용하였다.
증폭된 PCR 산물은 1.2% 아가로스 젤을 사용하여 분석하여 상기 젤을 기록하였다.
미생물의 감염이나 유도저항성 발현물질에 의한 식물의 유도저항성이 발현되면 과민성 반응이 발생하고, 이어서 유도저항성 기작으로 글루카나아제(glucanase), 키틴아제(chitinase) 등과 같은 PR(pathogenesis related protein)단백들이 증가하고, 식물세포의 리그닌화가 유도되며, 피토알렉신(Phytoalexin) 및 페놀화합물 등의 저항성물질이 축적되어 저항성 반응이 나타나게 된다.
이와 유사하게 비병원성인 신규한 바실러스 발리스모르티스 BS07M 균주의 근권 처리에 의하여 식물의 면역기능이 유발된다.
2. 실험결과
신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 처리에 의한 식물체의 병저항성 유전자 발현은 도 5에 나타나 있듯이, 상기와 같이 준비된 야생형 애기장대에서 병 저항성 유전자인 PR1유전자의 발현이 확인되었으며 NahG 변이주에서는 발현되지 않는 것으로 보아 SA에 의한 병저항성 경로로 식물면역 활성이 증대되는 것으로 판단된다.
또한, 상기 실험을 증명하기 위해 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주를 처리하여 뿌리의 반응을 확인한 결과 도 6과 같은 식물 뿌리조직에서 리그닌화의 유도를 확인하였다. 즉, 붉은색으로 표시된 리그닌 형성은 병저항성 반응 중의 하나를 나타내는 것으로서 식물세포벽이 두꺼워짐을 의미하는 것이다. 따라서 본 발명의 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주를 처리함으로 인해 오이 뿌리의 세포벽이 두꺼워져 식물병원균이 침입하지 못함을 알 수 있었다.
< 실험예 4> 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주의 유도저항성 발현에 의한 식물병 억제효과
신규한 바실러스 발리스모르티스 BS07M균주의 유도저항성 발현에 의한 식물병 억제효과를 보기 위하여 실내 및 포장시험 조건으로 실시하였다.
신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M균주처리에 의한 고추의 병저항성 발현은 유묘기 및 포장에서의 채취한 고추잎과 과일에 병원균을 접종하여 시험하였다.
무름병의 경우, 실내시험에서는 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주가 처리된 고추 재배구와 처리되지 않은 재배구를 구분하여 유묘기의 잎과, 노지재배 상태의 고추 잎을 채취하였다.
그리고 Pectobacterium carotovora SCC1에 대한 유도저항성 발현을 시험하였다.
그 결과 고추 유묘의 잎은 하기 표 4와 도 7과 같이 나타났다.
처리 병반면적율(%) 잎
BS07M
(본 발명)		 0
대조구(Control) 42
무처리(지상부 우수) 32
LSD(p=0.05) 37.23
*LSD(least sinificant difference): 최소 유의차
상기 표 4와 도 7에 나타나 있듯이, 대조구는 42% 병반면적율을 나타난 반면, 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주 처리에서는 병반이 발생되지 않아 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
또한, 노지상태의 잎의 경우에는 하기 표 5와 같이 나타났다.
처리 무름병 감염율(%) 탄저병 감염율(%)
1차 2차
관행구(대조구) 71.7 53.7 15
0.1mM-BTH 16.7 75.7 8
BS07M(본 발명) 20.0 0.0 1
LSD(p=0.05) 20.62 23.5 19.1
*LSD(least sinificant difference): 최소 유의차
상기 표 5와 같이, 대조구는 1차, 2차에서 각각 71.7%, 53.7% 무름병에 감염율을 보였으나 처리구는 각각 20.0%, 0.0%로 현저히 억제되는 효과를 보였다.
고추탄저병의 경우, 실내시험에서는 노지에서 재배한 고추의 과일을 채취하여 고추 탄저병억제효과를 시험하였다.
멸균수에 현탁하여 고추탄저병균(Colletotrichum acutatum)포자를 105 spore/의 농도로 조정하고 전착제를 첨가하여 충분히 살포하였다.
그리고 나서 상대습도 100%에서 24시간 둔 후 꺼내어 온실내에 정치하고 그 후 7일째에 병발생을 조사하였다. 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주가 처리된 고추 재배구와 처리되지 않은 재배구에서 채취한 고추과일을 구분하여 조사하였다.
그 결과, 상기 표 5와 같이 관행구에서는 15%의 감염율을 보였으나, 바실러스 발리스모티스 BS07M 처리구에서는 1%의 가장 낮은 감염율을 보여 탄저병 억제효과가 가장 큰 것으로 나타났다.
또한, 고추 탄저병의 경우, 포장시험에서는 노지재배 조건에서 실시하였다.
고추탄저병균(Colletotrichum acutatum)포자를 멸균수에 현탁하여 105 spore/의 농도로 조정하고 전착제를 첨가하여 고추의 잎과 과일에 충분히 살포하였다. 그리고 나서 약 15일 간격으로 4회에 걸쳐 탄저병 발생을 조사하였다.
그 결과는 도 8에서와 같이 포장조건에서도 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주처리에 의해 탄저병 억제 효과가 가장 큰 것으로 나타났다.
또한, 오이모자이크바이러스(cucumber mosaic virus , CMV)에 대한 억제효과도 확인하였다.
설명하면, 근권균 BS07M 균주의 포자현탁액을 관주 처리한 파종 2주 후의 오이(은성백다다기)유묘 1본엽에 오이모자이크바이러스(CMV)에 걸린 오이잎을 마쇄하여 카보란덤 분말과 함께 문질러 접종한 다음 상온의 온실에서 정치후 1주째 형성된 모자이크로 바이러스 감염 여부를 조사하였다. 무처리는 살균 증류수를 관주 처리하였으며 동일한 방법으로 CMV 바이러스를 접종하였다.
그 결과, 도 9에 나타나 있듯이 BS07M이 처리된 오이 유묘는 CMV 바이러스에 의한 감염증상이 전혀 없는 것으로 보아 바이러스 방제효과가 우수함을 입증할 수 있었다
< 실험예 5> 신규한 바실러스 발리스모티스 BS07M 균주의 식물처리에 의해 식물의 내한성증대 효과
바실러스 발리스모티스 BS07M의 식물 근권처리 후 오이와 담배유묘의 내한성을 조사하였다.
4℃에서 24시간 처리 후 온실에 6시간 방치하여 냉해피해로 나타나는 잎의 변색정도를 육안으로 관찰하여 조사하였다.
도 10과 11에서와 같이, 대조구는 저온처리에 의해 냉해를 받으면서 엽록체가 파괴되어 잎 표면이 오그라들며 회백색으로 변색된 반면, 신규한 바실러스 발리스모르티스 BS07M균주 처리에서는 저온에서도 견디는 힘이 강해져서 냉해를 받지 않고 내한성(耐寒性)이 증대되는 효과를 나타내었다.
이에, 본 발명의 신규 미생물은 작물처리에 의해 내한성이 증강되어 4℃ 저온조건에서도 냉해에 견디는 우수한 특징이 있으며, 이를 이용하면 식물병해억제 및 식물생육촉진효과도 종래의 효과보다도 현저히 우수하여 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.
또한, 식물병원균을 효과적으로 억제할 뿐만 아니라 식물면역기능의 활성증대로 병해가 현저히 감소하고, 작물생육촉진 효과도 우수하여 친환경농업에 유용하게 활용할 수도 있다.
상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 시험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC11991BP 20110728
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> NOVEL BACILLUS VALLISMORTIS BS07M WITH PROMOTING PLANT GROWTH AND IMPROVED COLD-TOLERANCE, AND MICROBIAL AGENT CONTAINING THE SAME <130> P2011-2074 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1478 <212> DNA <213> Bacillus vallismortis <400> 1 cactcagacg aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgagcggac agatgggagc 60 ttgctccctg atgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac 120 tgggataact ccgggaaacc ggggctaata ccggatggtt gtctgaaccg catggttcag 180 acataaaagg tggcttcggc taccacttac agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg 240 tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca 300 ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat 360 ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct 420 ctgttgttag ggaagaacaa gtgccgttca aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc 480 agaaagccac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt 540 ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgcag gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc 600 cggctcaacc ggggagggtc attggaaact ggggaacttg agtgcagaag aggagagtgg 660 aattccacgt gtagcggtga aatgcgtaga gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga 720 ctctctggtc tgtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata 780 ccctggtagt ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag 840 tgctgcagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca 900 aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg 960 aagaacctta ccaggtcttg acatcctctg acaatcctag agataggacg tccccttcgg 1020 gggcagagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080 gtcccgcaac gagcgcaacc cttgatctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg 1140 tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat 1200 gacctgggct acacacgtgc tacaatggac agaacaaagg gcagcgaaac cgcgaggtta 1260 agccaatccc acaaatctgt tctcagttcg gatcgcagtc tgcaactcga ctgcgtgaag 1320 ctggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta 1380 cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gtcggtgagg taacctttta 1440 ggagccagcc gccgaagtgg gacagatgat tgggtgan 1478

Claims (12)

  1. 서열번호 1로 표현되며 작물의 생육을 촉진하는,
    신규미생물 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis ) BS07M 균주 KCTC11991BP.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 작물은 고추, 오이, 담배 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는,
    신규미생물 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis ) BS07M 균주 KCTC11991BP.
  3. 서열번호 1로 표현되며 식물병원성균의 항균활성능을 갖는,
    신규미생물 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis ) BS07M 균주 KCTC11991BP.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 식물병원성균은 콜레토트리쿰 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 알터나리아 알터나타(Alternaria alternata), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 페니실리움 이타리쿰(Penicillium italicum), 페니실리움 익스판숨(Penicillium expansum), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스크레로티니아 스크레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum) 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는,
    신규미생물 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis ) BS07M 균주 KCTC11991BP.
  5. 서열번호 1로 표현되며 식물병에 대한 면역기능 활성능을 갖는,
    신규미생물 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis ) BS07M 균주 KCTC11991BP.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 식물병은 고추역병(Phytophthora capsici), 고추무름병(Pectobacterium carotovora), 고추 탄저병(Colletotrichum acutatum), 오이모자이크바이러스(cucumber mosaic virus) 중 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는,
    신규미생물 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis ) BS07M 균주 KCTC11991BP.
  7. 제1항에 있어서,
    서열번호 1로 표현되며 작물의 내한성 증대능을 갖는,
    신규미생물 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis ) BS07M 균주 KCTC11991BP.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서,
    미생물 농약, 미생물 비료, 종자코팅제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 중 어느 하나의 유효성분으로 이용되는,
    신규미생물 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis ) BS07M 균주 KCTC11991BP.
  9. 제1항 내지 제7항의 중 어느 한항의 신규미생물 바실러스 발리스모티스 (Bacillus vallismortis ) BS07M 균주 KCTC11991BP의 균체 또는 그 배양액을 포함하는, 미생물 제제.
  10. 청구항 제9항의 미생물 제제를 작물에 살포 또는 토양관주하여, 작물의 생육을 촉진하는 방법.
  11. 청구항 제9항의 미생물 제제를 작물에 살포 또는 토양관주하여, 식물병원성균을 방제하는 방법.
  12. 청구항 제9항의 미생물 제제를 작물에 살포 또는 토양관주하여, 작물의 내한성을 증강시키는 방법.
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