CN103232952B - 一株抑制植物病原真菌的花域芽孢杆菌 - Google Patents
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Abstract
一株抑制植物病原真菌的花域芽孢杆菌，它涉及一株花域芽孢杆菌。本发明提供一株花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)菌株，可高效抑制植物病原真菌。本发明抑制植物病原真菌的花域芽孢杆菌为花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2012年11月19日，保藏号为CGMCC No.6838。本发明的花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)菌株，具有广泛的温度、酸碱适应性和储藏稳定性，适于作为农业生防菌加以开发利用。
Description
技术领域
本发明涉及一株花域芽孢杆菌。
背景技术
随着绿色农业的兴起和生物防治的特殊作用，从土壤中筛选拮抗微生物用于防治病害已被人们持续关注。生物防治被认为是最具发展潜力的防治方法，而获得高效广谱的拮抗菌株并掌握其基本功能特性是这一研究的基础。
花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)是1996年Robert等人从土壤中首先分离得到并报道，又名死谷芽孢杆菌，它与枯草芽孢杆菌的系统发育亲缘关系较近，只是在脂肪酸含量，DNA序列上有所差异。2006年Kyungseok等报道一株花域芽孢杆菌EXTN-1对马铃薯Y病毒和X病毒有诱导系统抗性的作用。2007年Jae等发现花域芽孢杆菌具有纤溶酶活性，且对链球菌具有溶菌活性。
发明内容
本发明提供一株花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)菌株，可高效抑制植物病原真菌。
本发明抑制植物病原真菌的花域芽孢杆菌为花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年11月19日，保藏号为CGMCCNo.6838。
本发明花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112为革兰氏阳性菌，长杆状，细胞大小为(1.8μm～2.0μm)×(0.7μm～0.8μm)，有芽孢(如图1所示)，呈椭圆型端生；在PDA培养基上28℃培养24h，菌落直径3～5mm，不透明，呈花瓣型，边缘不整齐，表面不光滑有褶皱，颜色为淡粉色。
参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对花域芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)HWyb1112进行生理生化鉴定：花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112革兰氏染色试验呈阳性，接触β-半乳糖苷酶、吡咯烷基芳胺酶、β-木糖苷酶、酪氨酸芳胺酶呈阳性，接触L-脯氨酸芳胺酶、β-N-乙酰葡萄糖苷酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶呈阴性，能够利用D-甘露醇、D-甘露糖、古老糖、β-葡萄糖苷酶、a-葡萄糖、D-海藻糖、D-葡萄糖，不能利用D-塔格糖。
本发明的花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112通过16S rDNA序列比对分析，与芽孢杆菌属(Bacillus)的16S rDNA序列的同源性最高，保守区相似性为99％，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定花域芽孢杆菌HWyb1112属于芽孢杆菌属(Bacillus)，为花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)菌株。
本发明的花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112可在PDA培养基上生长。花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112的最适生长温度为28℃，最适生长环境的pH为7.5。
本发明的花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)菌株，可高效抑制植物病原真菌，尤其是对甜菜根腐病病原菌、腐皮镰孢霉菌、丝核菌(例如，立枯丝核菌、内蒙葵花菌核菌)、尖孢镰刀菌、大豆根腐病以及禾谷镰刀菌等一系列作物根部土传病害菌具有较为高效的拮抗作用，并具有广泛的温度、酸碱适应性和储藏稳定性，适于作为农业生防菌加以开发利用。
本发明的花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112属于芽孢杆菌属(Bacillus)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年11月19日，保藏号为CGMCC No.6838。
附图说明
图1为本发明花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112放大8000倍的TEM图片；
图2为通过花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112和相近菌株的16S rDNA序列进行同源性比对构建的系统发育树图；
图3为未加入花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112的立枯丝核菌的平板培养状况图；
图4为加入花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112的立枯丝核菌的平板培养状况图；
图5为未加入花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112的内蒙葵花菌核菌的平板培养状况图；
图6为加入花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112的内蒙葵花菌核菌的平板培养状况图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式抑制植物病原真菌的花域芽孢杆菌为花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年11月19日，保藏号为CGMCC No.6838。
本实施方式花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112为革兰氏阳性菌，长杆状，细胞大小为(1.8μm～2.0μm)×(0.7μm～0.8μm)，有芽孢(如图1所示)，呈椭圆型端生；在PDA培养基上28℃培养24h，菌落直径3～5mm，不透明，呈花瓣型，边缘不整齐，表面不光滑有褶皱，颜色为淡粉色。
参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对花域芽孢杆菌(Bacillusvallismortis)HWyb1112进行生理生化鉴定：花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112革兰氏染色试验呈阳性，接触β-半乳糖苷酶、吡咯烷基芳胺酶、β-木糖苷酶、酪氨酸芳胺酶呈阳性，接触L-脯氨酸芳胺酶、β-N-乙酰葡萄糖苷酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶呈阴性，能够利用D-甘露醇、D-甘露糖、古老糖、β-葡萄糖苷酶、a-葡萄糖、D-海藻糖、D-葡萄糖，不能利用D-塔格糖。
本发明的花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112通过16S rDNA序列比对分析，与芽孢杆菌属(Bacillus)的16S rDNA序列的同源性最高，保守区相似性为99％，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定花域芽孢杆菌HWyb1112属于芽孢杆菌属(Bacillus)，为花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)菌株。
本实施方式的花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112可在PDA培养基上生长。
本实施方式花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112的最适生长温度为28℃，最适生长环境的pH为7.5。
具体实施方式二：本实施方式花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112由黑龙江省哈尔滨呼兰区健康甜菜田植株根部0～15cm的泥土中筛选得到。筛选按以下步骤进行：将采集的健康甜菜根际土，风干、研碎、过筛，取其中1.0g于带有玻璃珠的100mL无菌水中，充分振荡，制成悬浊液，以10倍稀释得到10-1，10-2，10-3......稀释液。取其中0.1mL梯度稀释液于上PDA和牛肉膏蛋白胨培养基中，30℃恒温培养，观察菌种形态菌落颜色，进行初筛，直至获得单菌落。测定拮抗能力，最终获得目的菌株，试管斜面4℃保存。
对筛选得到的花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112进行分子鉴定，按以下步骤进行：利用引物16F和16R，进行PCR扩增，基因扩增产物经纯化后委托上海英骏生物科技有限公司测序；其中，PCR扩增引物序列如下：
16F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，
16R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，
PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃终延伸10min。
PCR引物购买自上海生工生物技术有限公司，其他试剂购自于哈尔滨赛拓生物技术有限公司。
花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112的16SrDNA序列长度为1584bp，其序列提交至GenBank，测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，然后用软件DNAMAN的Observed Divergency构建系统发育树(如图3所示)，以确定菌株的种属关系。同源性分析结果表明，该序列与芽孢杆菌属(Bacillus)的16S rDNA序列的同源性最高，保守区相似性为99％，通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112属于芽孢杆菌属(Bacillus)，为花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)菌株。
通过平板培养的方法检测筛选得到的花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112的抑菌性：
未加入花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112的立枯丝核菌的平板培养状况图如图3所示，从图3可以看出，平板中长满了立枯丝核菌；
加入花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112的立枯丝核菌的平板培养状况图如图4所示，从图4可以看出，平板中的立枯丝核菌得到了抑制；
由图3和图4对比可以得出，花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112可高效抑制立枯丝核菌，对立枯丝核菌有拮抗作用。
未加入花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112的内蒙葵花菌核菌的平板培养状况图如图5所示，从图5可以看出，平板中长满了内蒙葵花菌核菌；
加入花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112的内蒙葵花菌核菌的平板培养状况图如图6所示，从图6可以看出，平板中的内蒙葵花菌核菌得到了抑制；
由图5和图6对比可以得出，花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112可高效抑制内蒙葵花菌核菌，对内蒙葵花菌核菌有拮抗作用。
Claims (1)
1.一株抑制植物病原真菌的花域芽孢杆菌，其特征在于抑制植物病原真菌的花域芽孢杆菌为花域芽孢杆菌(Bacillus vallismortis)HWyb1112，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2012年11月19日，保藏号为CGMCC No.6838。
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| CN101845410A (zh) * | 2010-02-11 | 2010-09-29 | 珠海市农业科学研究中心 | 一株植物内生枯草芽胞杆菌tr21及其应用 |
| JP2013066467A (ja) * | 2011-09-22 | 2013-04-18 | Republic Of Korea (Rural Development Administration) | バチルスバリスモルティスｂｓ０７ｍ菌株、微生物製剤、及び作物育成方法 |
-
2013
- 2013-03-18 CN CN201310085260.9A patent/CN103232952B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101845410A (zh) * | 2010-02-11 | 2010-09-29 | 珠海市农业科学研究中心 | 一株植物内生枯草芽胞杆菌tr21及其应用 |
| JP2013066467A (ja) * | 2011-09-22 | 2013-04-18 | Republic Of Korea (Rural Development Administration) | バチルスバリスモルティスｂｓ０７ｍ菌株、微生物製剤、及び作物育成方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王全.数据库： WPI,EPODOC, VEN, CNKI,万方，CNPAT, CNTXT, NCBI, ISI, Google Scholar, GenBank，EMBL，中国专利生物序列检索系统.《湖北农业科学》.2009,1146页摘要. * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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