CN104403958B - 一株能有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的蜡样芽孢杆菌ny5 - Google Patents

一株能有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的蜡样芽孢杆菌ny5 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株能有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的蜡样芽孢杆菌菌株NY5(Bacillus cereus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9372。该蜡样芽孢杆菌为好氧型细菌，能够有效抑制罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的生长。通过亚硝酸氮实验去除效率可达到100％。该菌还具有水解酪蛋白和淀粉的功能，并已经通过安全性检测，在水体中蜡样芽孢杆菌NY5浓度为2×107cfu/ml和在注射2.1×106cfu/ml浓度的NY5菌液100μl的条件下，罗非鱼没有出现死亡及其他异常现象。本发明为有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的生长，及在有氧条件下高效降解亚硝酸盐氮、水解蛋白和淀粉提供了有用的菌源，拓宽了对蜡样芽孢杆菌功能方面的应用，具有较强的应用价值。

Description

一株能有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的蜡样芽孢杆菌NY5
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高活力蜡样芽孢杆菌菌株NY5(Bacilluscereus)。
背景技术
罗非鱼(Tilapia)隶属于鲈形目、鲈形亚目、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属。由于罗非鱼具有杂食性、生长快、繁殖力强、适应性广等优点，目前已成为世界性主要养殖鱼类。我国是全球最大的罗非鱼生产国和加工出口国，2013年产量150万吨，加工出国量30多万吨，出口额10多亿美元。但自2009年以来，我国罗非鱼养殖中病害频繁爆发，损失巨大，严重影响了罗非鱼产业的可持续发展，其中最为严重的是链球菌病。该病具有传染性强，持续时间长，死亡率高等特点，成为目前罗非鱼病害防控的难题。
过量的亚硝酸盐氮对水生动物具有一定的毒害作用，因此，养殖水体亚硝酸盐氮的有效去除是水产业亟待解决的问题之一。
氧气的充足供应是集约化养殖的重要条件之一，而传统的反硝化细菌多数为厌氧菌，在目前的养殖环境下，其反硝化性能必定受到限制。
集约化水产养殖的水环境是一个特殊的生态系统，大量的饲料投入、饵料残留、动物排泄物等造成水体有机物浓度迅速升高，导致水体环境的恶化。而芽孢杆菌通常具有非常强的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶分泌能力，可迅速降解残饵、粪便等大分子物质，降低有机物累积的同时为其他微生物及藻类提供丰富的营养物质。
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)广泛存在于土壤等环境中，是一种好氧型的芽孢杆菌，可产生丰富的蛋白酶、淀粉酶及抑菌物质等。在水产中，将蜡样芽孢杆菌制成微生态制剂，可以克服使用抗生素所带来的副作用，如鱼体肠道微生态系统失调、免疫力下降、药物残留及产生抗药性等。蜡样芽孢杆菌能选择性促进生活在肠道的微生物的活性，同时抑制肠道内有害病菌的生长，降低宿主染病的机会。另外，蜡样芽孢杆菌在生长过程中还会产生有益的代谢产物，刺激和促进宿主的生长。
针对集约化养殖带来的养殖环境恶化，鱼类抵抗力下降，病害肆虐，滥用抗生素等问题，筛选出在好氧条件下既能有效的拮抗鱼源链球菌，又能高效降解亚硝酸盐氮、有机物的蜡样芽孢杆菌，为水产养殖提供新的可用的益生菌菌株。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种能有效抑制罗非鱼源链球菌的生长，能在有氧条件下高效降解亚硝酸盐氮、水解蛋白和淀粉的蜡样芽孢杆菌NY5。该菌株经过安全性检测，罗非鱼在蜡样芽孢杆菌NY5浓度为2×107cfu/ml的水体中及在注射100μl浓度为2.1×106cfu/ml的NY5菌液条件下，没有出现死亡及异常情况。该菌株为水产益生菌提供了有用的菌源，拓宽了对蜡样芽孢杆菌功能方面的应用，具有较强的应用价值。
本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)NY5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9372。
蜡样芽孢杆菌NY5的菌落形态为：扁平、无规则、圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的、呈白色(似蜡烛样颜色)，直径5～7mm；需氧，革兰氏阳性芽孢杆菌。最适生长pH值：5～9，最适生长温度：25-40℃，最适盐度：0-40。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果是：该蜡样芽孢杆菌能够有效抑制罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的生长。经过反硝化性能培养基培养，结果表明能在12小时内去除水中的浓度为50mg/L亚硝酸盐氮，去除效率达到100％。其为好氧芽孢杆菌，可以水解酪蛋白、淀粉，经过安全性检测，发现罗非鱼在蜡样芽孢杆菌NY5浓度为2×107cfu/ml的水体中及注射100μl为2.1×106cfu/ml的NY5菌液，没有出现死亡及异常情况。本发明提供了在有氧条件下高效降解亚硝酸盐氮、水解蛋白和淀粉，并能有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的有用菌源，拓宽了对蜡样芽孢杆菌功能方面的应用，具有较强的应用价值。
附图说明
图1是蜡样芽孢杆菌NY5的16S rRNA基因序列的NJ系统进化树图。
图2是胞外淀粉酶检测结果图。
图3是蛋白酶检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述，当然下述实施例不应理解为对本发明的限制。
一、蜡样芽孢杆菌NY5的筛选
(一)材料
1、试验所用样品采集于中国水产科学研究院珠江水产研究所池塘养殖的罗非鱼肠道。
2、培养基：
牛肉膏蛋白胨液体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0。
牛肉膏蛋白胨固体培养基：在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加琼脂15-20g/L。
牛肉膏蛋白胨高盐培养基：在牛肉膏蛋白胨固体培养基中将NaCl的量增至30g/L。
BTB培养基：天冬酰胺酸1g/L，KNO31g/L，KH2PO41g/L，FeCl2·6H2O 0.05g/L，CaCl2·2H2O 0.2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，BTB 1g/L，琼脂20g/L，pH 7.0-7.2。
反硝化富集培养基:蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，KNO31g/L。
反硝化培养基(测定性能)：琥珀酸钠4.72g/L，NaNO20.05g/L，KH2PO4 1.5g/L，Na2HPO40.42g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，pH 7.2。
酪素培养基：牛肉膏3g，酪素8g，琼脂15g，H2O 1000ml，pH 7.0-7.2。
淀粉培养基:牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，可溶性淀粉2g，琼脂15g，H2O1000ml，pH 7.0-7.2，所有培养基经0.11MPa，121℃，灭菌20min。
3、主要试剂和仪器
革兰氏快速染色液(珠海贝索生物有限公司)，
孔雀绿(广州威佳生物有限公司)，
番红(广州威佳生物有限公司)，
API 20E试剂盒(Biomerieux)，
API 20Strep试剂盒(Biomerieux)，
细菌DNA提取试剂盒(Omega)，
Taq酶(TaKaRa)，
pMD19-T载体(TaKaRa)，
感受态细胞DH5α(TaKaRa)，
BHI培养基(广州威佳生物有限公司)，
光学显微镜(ZEISS)，
PCR仪(SensoQuest)，
恒温摇床(华利达实验设备有限公司)等。
(二)菌种的分离纯化
将采集的罗非鱼肠道用无菌手术剪剪碎，称取5g样品放入装有45ml无菌水的锥形瓶中，80℃水浴15min，充分振荡混匀，静止5min，吸取上层液体1ml加入到含有9ml无菌水的试管中，依次稀释得到不同浓度的菌悬液。分别取1×10-2和1×10-3肠道悬浊液各0.2ml滴加到牛肉膏蛋白胨高盐培养基(NaCl 30g/L)固体平板上(每种稀释度3皿)，均匀涂布，将平板置于30℃恒温箱培养1-2天。选取生长良好的单个、不规则、表面粗糙的菌落反复划线分离进行纯化培养。
将筛选出的耐盐芽孢杆菌稀释涂布在BTB平板上，30℃培养1-2天，挑选出能够使BTB平板变成蓝色的菌种作为初筛目的菌。
将含有无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)1×109个/ml培养液200μl均匀涂布在BHI固体培养基上，置于4℃冰箱待菌液吸收完全后，用灭菌的内径为6mm的圆形玻璃管在培养皿上打孔。取1×109个/ml的复筛菌培养液50μl加入小孔中，在4℃冰箱中放置过夜，使菌液充分扩散到培养基中，然后在37℃下培养24h，观察并测定抑菌圈直径，选择具有抑菌效果的菌株进行下一步筛选。
将筛选得到的菌种活化，按1％(体积比)的量吸取1ml接入到99ml反硝化培养基中，30℃，220r/min下培养24h，测定溶液中的亚硝酸盐氮含量，选择亚硝酸盐氮去除多的菌株为复筛菌。
将上述复筛菌用无菌牙签接种于产淀粉酶定性平板中央，每株菌3个重复，于30℃倒置培养24h。然后向平板中加入2ml碘液，轻旋至碘液均匀覆盖平板，静置10min，选择出现显色圈的菌株，进行下一步筛选。
将上述复筛菌用无菌牙签接种于产蛋白酶定性平板中央，待测菌株3个重复，于30℃倒置培养24h，选择平板上出现透明圈的菌株，即得到菌株蜡样芽孢杆菌NY5。
二、菌种NY5的鉴定
对蜡样芽孢杆菌NY5进行了形态学观察及染色、生化鉴定、16S rRNA基因序列克隆及序列分析，通过进化树分析，最终从分子水平上确定菌种NY5为蜡样芽孢杆菌。
1、形态学观察与染色
将菌株NY5划线接种于牛肉膏蛋白胨平板上，置于30℃恒温培养箱中培养24h，观察菌落形态。挑选单菌落置于滴有生理盐水的载玻片上，涂布均匀后通过革兰氏染色及芽孢染色法在光学显微镜下观察菌体形态及芽孢的形状、着生位置。
2、生化鉴定
将纯化培养的菌株用API 20E及20Strep试剂盒进行检测，操作方法详见试剂盒说明书。并参照伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)中细菌生理生化指标进行确认。
3、16S rRNA基因序列克隆及序列分析
用细菌DNA提取试剂盒(Omega)抽提细菌基因组DNA，步骤参照说明书。以基因组DNA为模板，用通用引物27F:5’–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG–3’和1492R:5’–TACGGCTACCTTGTTACGACTT–3’扩增细菌的16S rRNA基因片段。PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃90s，30个循环；72℃10min。1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测，胶回收目的片段，连接至pMD19–T载体，转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆送至上海英潍捷基贸易有限公司进行测序。通过GenBank中的BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行序列同源性分析，并下载相关细菌16S rRNA基因序列，通过Clustal x软件进行多重比对，用MEGA 5.0软件中邻接法(neighbor joining，NJ)构建系统进化树并通过自检分析(boostrap)进行置信度检测，自检数据集为1000次。
三、菌落形态与生理生化特性：
蜡样芽孢杆菌NY5的菌落形态特征：在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上30℃培养24h后可形成扁平、无规则、圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落(似蜡烛样颜色)，直径3～4mm。需氧，革兰氏阳性菌。最适生长pH值为5-9，最适生长温度为25-40℃，最适盐度为0-40。
蜡样芽孢杆菌NY5的生理生化特性：菌株NY5的精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、细胞色素氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶、明胶酶、吡咯烷酮芳胺酶、α-半乳糖甙酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖甙酶、碱性磷酸酶、亮氨酸芳胺酶试验及马尿酸水解试验、VP试验检测为阳性，能利用柠檬酸钠、蔗糖、密二糖、阿拉伯糖、D-海藻糖、淀粉，产β-半乳糖苷酶、色氨酸脱氢酶、β-葡萄糖甙、H2S试验、吲哚试验为阴性，不能利用葡萄糖、甘露醇、肌醇、鼠李糖、山梨醇、苦杏仁苷、D-核糖、D-甘露醇、D-乳糖(牛源)、菊糖、D-棉子糖、糖原。
四、应用性实验
(1)抑菌实验
通过平板扩散法测定NY-5菌株的抑制无乳链球菌的效果,以枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌为对照,每个平板三个重复。
其中带☆的为抑菌效果最好的，其中NY5为11株，枯草为6株，地衣为4株，NY5的平均抑菌圈大小为27.84mm；枯草为25.57mm；地衣为19.35mm。
(2)胞外酶性能测定
其中图2为胞外淀粉酶检测结果，可清晰见水解圈,结果显示，NY5菌株能够有效的水解淀粉，能够分泌胞外淀粉酶。图3为蛋白酶检测结果，透明圈为酪蛋白水解圈，表明NY5菌株能够有效的水解酪蛋白，能够分泌胞外蛋白酶。
(3)亚硝酸氮实验
通过接种1％的NY5菌株到50mg/L的亚硝酸氮性能液体培养基中，经过12h后，检测亚硝酸盐氮含量为0，清除率达到了100％。
(4)水体中蜡样芽孢杆菌NY5浓度(cfu/ml)和注射100μl不同浓度(cfu/ml)的NY5菌液对鱼的实验情况。
浓度(cfu/ml) 生理盐水 2.1×106 2.1×107 2.1×108 2.1×109
死亡率 0 0 2.2％ 4.4％ 17.8％
浸泡浓度为2×107cFu/ml，无死亡情况。
五、NY5菌株安全性检测
通过人工感染罗非鱼实验来对NY5菌株的安全性进行评估，结果表明在发现罗非鱼在蜡样芽孢杆菌NY5浓度为2×107cfu/ml的水体中及注射100μl为2.1×106cfu/ml的NY5菌液，没有出现死亡及其他异常情况。，表明蜡样芽孢杆菌NY5是较为安全的菌株。
六、蜡样芽孢杆菌NY5为新的菌株
通过对菌株NY5进行PCR扩增和测序，得到其16S rRNA基因序列，片段长为1474bp。在NCBI网站(美国国立生物技术中心网站)对菌株NY5的16S rRNA基因序列与数据库中各种菌的16S rRNA序列进行比对，将得到的16S rRNA序列提交到NCBI核酸数据库中，进行BLAST在线分析，结果表明该菌株16S rRNA序列与已报道的蜡样芽孢杆菌(登录号:NC_004722.1)16S rRNA基因序列相似性高达99％。下载GenBank中相关细菌16S rRNA基因序列，通过Clustal x软件进行多重比对，用MEGA 5.0软件中邻接法(neighbor joining，NJ)构建系统进化树(图1)，结果显示，菌株NY5和蜡样芽孢杆菌在一个分支中，且菌株NY5与其中的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus ATCC 14579的亲缘关系最近。由此证明，菌株NY5为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。
综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，菌株NY5命名为蜡样芽孢杆菌NY5(Bacillus cereus)。蜡样芽孢杆菌NY5(Bacillus cereus)为新的菌株，已于2014年06月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9372。
本发明人从中国水产科学研究院珠江水产研究所池塘养殖的罗非鱼肠道中分离出一株能有效抑制无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)生长的较为安全的好氧反硝化蜡样芽孢杆菌，其能够水解酪蛋白、淀粉，拓宽了对蜡样芽孢杆菌功能方面的应用，具有较强的应用价值。

Claims (6)

1.蜡样芽孢杆菌NY5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9372。
2.如权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌NY5，其特征是在有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的过程中，通过平板扩散法测定NY5菌株的抑制无乳链球菌的应用。
3.如权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌NY5，其特征是在有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的过程中，能在有氧条件下高效降解亚硝酸氮方面的应用。
4.如权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌NY5，其特征是在有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的过程中，在有氧条件下高效降解水解蛋白的应用。
5.如权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌NY5，其特征是在有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的过程中，蜡样芽胞杆菌NY5为需氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，适宜生长pH值：5～9；生长温度25～40℃；适宜盐度0～40。
6.如权利要求1所述的蜡样芽胞杆菌NY5，其特征是在有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的过程中，罗非鱼在蜡样芽孢杆菌NY5浓度为2×107cfu/ml的水体中及在注射100μl浓度为2.1×106cfu/ml的NY5菌液条件下，没有出现死亡及异常情况。
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一株能有效抑制罗非鱼源无乳链球菌的芽孢杆菌的筛选鉴定;刘观斌 等;《2014 年中国水产学会学术年会论文摘要集》;20141029;256 *
芽孢杆菌对草鱼养殖水质调控作用的研究;李卫芬 等;《渔业现代化》;20111231;第38卷(第4期);22-26 *

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