CN106916768B - 一种具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌及应用 - Google Patents

一种具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌及应用 Download PDF

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Abstract

一种具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌及应用，它涉及一种昆虫病原线虫共生菌及应用。该菌为伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)HEB01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年3月9日，保藏号CGMCC NO.12193。用于防治马铃薯黑痣病。本发明致病杆菌HEB01具有较强的抑制马铃薯黑痣病菌菌丝生长的能力，且随着体积浓度的增加而增大，抑菌效果显著。同时，该菌具有培养条件要求低、持效期长、来源环保无毒性等特点，使其具有很好的开发应用前景。

Description

一种具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌及应用
技术领域
本发明涉及一种昆虫病原线虫共生菌及应用。
背景技术
中国是马铃薯种植大国，在马铃薯主粮化等战略的推动下，我国马铃薯产业得到了快速发展。然而，随着种植面积的不断扩大，由轮作制度不健全、脱毒种薯监管不完善等诸多原因造成的土传病害普遍发生且逐年加重问题，严重影响了马铃薯产业的健康发展。
马铃薯黑痣病是马铃薯生产上最具威胁的土传病害之一，可以在块茎表面形成黑痣、裂口等症状严重影响马铃薯(尤其是种薯)的品质和商品性，造成巨大经济损失，同时其病原立枯丝核菌还可在苗期引起溃疡病，在苗期造成危害。研究表明，该病原菌环境适应能力极强，能够通过菌核在块茎上、土壤中或菌丝体在植株残体上越冬，待到次年气候条件适宜时，对马铃薯芽眼、幼苗茎基部、匍匐茎以及薯块表面进行侵染，从而对产量和品质造成危害。目前，该病在我国普遍发生，一般年份发病率为15％-30％，严重年份可达到70％以上，严重威胁着马铃薯产业的发展。
昆虫病原线虫共生菌是存在于昆虫病原线虫肠道内的一类革兰氏阴性细菌，属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，包括致病杆菌属(Xenorhabdus)、光杆状菌属(Photorhabdus)和沙氏菌属(Serratia)，其分别与斯氏线虫属(Steinernema)、异小杆线虫属(Heterorhabditis)及拟异小杆线虫属(Heterorhabditidoides)的线虫共生。在自然界，此类细菌存在于3龄侵染期线虫的肠道内，随着线虫的侵染，而被携带到寄主体内并释放到血腔中，经大量繁殖，产生毒素，在48之内就能杀死寄主。国内外研究表明，此类细菌在离体人工培养时，也能够产生多种具有抑菌、杀虫、抗病活性代谢物等成份，因此，对昆虫病原线虫共生菌的开发和利用，已成为农业及医药等领域的研究热点，成为当前具有较大开发潜力和应用前景的一类重要的新型生物资源。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌及应用。
本发明的一种具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌，它为伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)HEB01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年3月9日，保藏号CGMCCNO.12193。
它用于防治马铃薯黑痣病。
本发明具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌为革兰氏阴性菌，在营养琼脂培养基上为乳黄色菌落，圆形，微凸，边缘不整齐，随着时间延长颜色加深；在NBTA培养基上，初生型可吸收溴麝香百里酚蓝(BTB)，形成蓝色菌落，次生型不能吸收呈紫色菌落。根据《常见细菌系统鉴定手册》方法进行生理生化指标测定，结果表明：昆虫病原线虫共生菌对硝酸还原酶、过氧化氢酶、氧化酶、脲酶、苯丙氨酸还原酶阴性，蛋白酶、柠檬酸盐、色氨酸还原酶及染料吸收为阳性。
本发明具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌可在NBTA培养基上生长，生长温度为28℃，最适pH为7.2～7.4，转速180r/min。NBTA培养基由牛肉膏5g、蛋白胨10g、营养琼脂20g、氯化钠5g、溴麝香百里酚蓝(BTB)0.025g、氯化三苯基四氮唑(TCC)0.04g和蒸馏水1000mL组成。
本发明具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌通过16S rDNA序列比对分析，与致病杆菌属有极高的同源性，同源性为99％以上。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定昆虫病原线虫共生菌属于致病杆菌属(Xenorhabdus)，为伯氏致病杆菌Xenorhabdus bovineii。
平板抑菌实验表明，在固体培养条件下，本发明伯氏致病杆菌(Xenorhabdusbovineii)HEB01具有较强的抑制马铃薯黑痣病菌菌丝生长的能力，随着体积浓度的增加而增大，持效期长，抑菌效果显著(此处最好给出本发明菌株)。
附图说明
图1为马铃薯黑痣病菌在含有不同体积比浓度伯氏致病杆菌(Xenorhabdusbovineii)HEB01的PDA培养基上的菌丝生长照片；
图2为不同体积比浓度伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)HEB01在PDA培养基上的抑菌照片(对照，CK)。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌，它为伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)HEB01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年3月9日，保藏号CGMCC NO.12193。
本实施方式的伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)HEB01是按照如下方式获取的：
利用大腊螟诱集法从采自哈尔滨市的土样中分离出昆虫病原线虫；按下列方法分离初生型共生细菌：
用分离得到的昆虫病原线虫感染大腊螟5龄幼虫，虫体死亡后，用体积百分含量为75％的酒精浸泡3s后，用质量百分含量为1％的NaClO溶液擦拭虫体表面，并用灭菌滤纸吸干虫体上的水分；用灭菌剪子剪掉大腊螟前足，将从伤口流出的血淋巴涂布于NBTA培养基上，置于28℃生化培养箱中培养2-3天，挑取蓝色单菌落为初生型共生单菌落并接种于NB培养液(由牛肉膏5g、蛋白胨10g和蒸馏水1000mL组成)中，于28℃下180r/min振荡培养24h后，按体积比1％转入发酵培养液中振荡发酵36-48h后，离心管中冷冻离心，取上清液，以获得无菌体发酵液。
所筛选的具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌为革兰氏阴性菌，在营养琼脂培养基上为乳黄色菌落，圆形，微凸，边缘不整齐，随着时间延长颜色加深；在NBTA培养基上，初生型可吸收溴麝香百里酚蓝(BTB)，形成蓝色菌落，次生型不能吸收呈紫色菌落。根据《常见细菌系统鉴定手册》方法进行生理生化指标测定，结果表明：昆虫病原线虫共生菌对硝酸还原酶、过氧化氢酶、氧化酶、脲酶、苯丙氨酸还原酶阴性，蛋白酶、柠檬酸盐、色氨酸还原酶及BTB吸收为阳性。
对分离筛选得到的致病杆菌进行分子鉴定，按以下步骤进行：提取菌株的总DNA，根据共生菌16S rDNA设计引物(上游：CGTTACCCGCAGAAGAAGCAC，下游：GCGGGACTTAACCCAACATTTC)，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，之后，进行克隆、转化，测序。测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，同源性达到100％以上。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定昆虫病原线虫共生菌HEB01属于致病杆菌属(Xenorhabdus)，为伯氏致病杆菌Xenorhabdusbovineii。
具体实施方式二：本实施方式的一种具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌，它用于防治马铃薯黑痣病。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：它是采用昆虫病原线虫共生菌的菌液防治马铃薯黑痣病。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：所述的具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌的菌液制备方法是按照以下步骤进行的：
将伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)HEB01接种于液体培养基中，在28℃，180r/min的条件下，振荡发酵培养36～48h，倒入离心管中冷冻离心后，取上清液，获到无菌体发酵液。
其它与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：所述的液体培养基为NB培养液；1L的NB培养液是由5g的牛肉膏、10g的蛋白胨以及1000mL蒸馏水组成。
其它与具体实施方式四相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
应用梯度稀释法测定无菌体发酵液对马铃薯黑痣病的拮抗作用。
具体步骤为：
1.前期准备：将本实验室保存的马铃薯黑痣病菌，接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上置于25℃恒温培养箱内，培养至菌丝刚刚长满培养皿时，备用。
2.带药培养基的制备：在无菌条件下，将伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)HEB01发酵液加入到PDA培养基中混匀，以制备5个浓度梯度，以加无菌水的PDA培养基为对照，每处理3次重复。
3.拮抗作用测定：在无菌条件下，将5mm靶标菌(即马铃薯黑痣病病原菌)饼分别接于上述不同浓度PDA培养基及对照培养基中心，24℃恒温培养3天，采用十字交叉法测量菌落直径，测定抑菌圈率。
4.数据处理：抑菌率公式如下，几率值法求毒力回归方程，算出各药剂对病原菌的EC50。
抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％；
为验证本实施例伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)HEB01的抑菌效果，现将结果列出如下：
通过上述抑菌实验，结果表明在PDA平板培养条件下，HEB01对丝核菌菌丝的生长具有较好的抑制作用，且随着体积浓度的增加而增大，抑菌效果越明显(见图1和表1)，抑菌中浓度及线性回归方程见表2。
表1 PDA平板培养条件下伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)HEB01的拮抗效果
体积比浓度 0.2 0.1 0.05 0.025 0.0125
抑菌率(％) 73.95 57.38 42.31 32.33 24.53
注：表中数据为接菌第三天时不同浓度的抑菌率，数值为3次重复平均值。
表2 平板培养条件下伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)HEB01对马铃薯黑痣病的毒力分析
Figure BDA0001266076600000051
。
序列表
<110> 黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所
<120> 一种具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌及应用
<160> 1
<210> 1
<211>521
<212> DNA
<213>伯氏致病杆菌（Xenorhabdus bovineii）。
aagcaccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa gcgttaatcggaattactgg 60
gcgtaaagcg cacgcaggcg gtcaattaag ttagatgtga aatccccggg ctcaacctgggaacggcatc 120
taaaactggt tgactagagt ctcgtagagg ggggtagaat tccacgtgta gcggtgaaatgcgtagagat 180
gtggaggaat accggtggcg aaggcggccc cctggacgaa gactgacgct caggtgcgaaagcgtgggga 240
gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca cgctgtaaac gatgtcgatt tggaggttgtgcccttgagg 300
cgtggcttcc ggagctaacg cgttaaatcg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaaaactcaaatg 360 aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgcaacgcgaaga accttaccta 420
ctcttgacat cctcagaatt tgctggagac agcgaagtgc cttcgggaac tgagagacaggtgctgcatg 480
gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg ggtaaaggtc c 521

Claims (5)

1.一种具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌，其特征在于它为伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)HEB01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年3月9日，保藏号CGMCCNO.12193。
2.如权利要求1所述的一种具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌的应用，其特征在于它用于防治马铃薯黑痣病。
3.根据权利要求2所述的一种具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌的应用，其特征在于它是采用具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌的菌液防治马铃薯黑痣病。
4.根据权利要求3所述的一种具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌的应用，其特征在于所述的具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌的菌液制备方法是按照以下步骤进行的：
将伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovineii)HEB01接种于液体培养基中，在28℃，180r/min的条件下，振荡发酵培养36～48h，倒入离心管中冷冻离心后，取上清液，获到无菌体发酵液。
5.根据权利要求4所述的一种具有抑制马铃薯黑痣病的昆虫病原线虫共生菌的应用，其特征在于所述的液体培养基为NB培养液；1L的NB培养液是由5g的牛肉膏、10g的蛋白胨以及1000mL蒸馏水组成。
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