CN106635885B - 一种昆虫病原线虫共生菌及其应用 - Google Patents

一种昆虫病原线虫共生菌及其应用 Download PDF

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Abstract

一种昆虫病原线虫共生菌及其应用，它涉及一种昆虫病原线虫共生菌及其应用。该菌为致病杆菌(Xenorhabdus budapestensis)HEB02，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年4月11日，保藏号CGMCC No.12352。用于防治大豆立枯病。本发明致病杆菌(Xenorhabdus budapestensis)HEB02具有较强的抑制大豆立枯病原菌丝生长的能力，且随着体积浓度的增加而增大，抑菌效果越明显。

Description

一种昆虫病原线虫共生菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种昆虫病原线虫共生菌的分离及应用。
背景技术
大豆[Glycine max(L.)Merr.]起源于中国，具有悠久的栽培历史，作为我国重要的粮食作物和油料作物，其在我国农业生产以及社会经济生活中都占有极其重要的地位。近年来，我国大豆产业发展遇到诸多瓶颈，种植面积和产量均呈逐年减少趋势，其原因除了受到国际市场冲击外，土传病害的猖獗也是造成品质差、单产低、持续生产力不稳定等问题的一个关键因素。大豆立枯病，俗称黑根病，是由立枯丝核菌引起的一种重要的大豆土传病害。该病主要在幼苗和幼株主根及近地面茎基部侵染发病，引起红褐色稍凹陷病斑，皮层开裂呈溃疡状，植株表现为外形矮小、生育迟缓，发病严重时，2-3天即可死苗。据调查，大豆立枯病在我国各大豆产区均有分布，病害严重年份，死亡率可达30％以上，生产上防控极为困难。
昆虫病原线虫共生菌是存在于昆虫病原线虫肠道内的一类革兰氏阴性细菌，属肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，包括致病杆菌属(XeNorhabdus)、光杆状菌属(Photorhabdus)和沙氏菌属(Serratia)，其分别与斯氏线虫属(Steinernema)、异小杆线虫属(Heterorhabditis)及拟异小杆线虫属(Heterorhabditidoides)的线虫共生。在自然界，此类细菌存在于3龄侵染期线虫的肠道内，随着线虫的侵染，而被携带到寄主体内并释放到血腔中，经大量繁殖，产生毒素，在48之内就能杀死寄主。研究表明，昆虫病原线虫共生菌在离体人工培养时，也能够产生多种物质。随着对昆虫病原线虫共生菌研究的不断深入，这些产物的功能亦不断被发现，如对多种动植物加人类病原菌有广泛的抑菌活性等。目前，昆虫病原线虫共生菌已成为一类新型的具有开发潜力和应用前景的能够杀虫防病的生物资源。
发明内容
本发明提供了一种昆虫病原线虫共生菌及其应用。
本发明的一种昆虫病原线虫共生菌，它为致病杆菌(XeNorhabdusbudapestensis)HEB02，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年4月11日，保藏号CGMCC No.12352。
它用于防治大豆立枯病。
本发明昆虫病原线虫共生菌为革兰氏阴性菌，在营养琼脂培养基上为乳黄色菌落，圆形，微凸，边缘不整齐，随着时间延长颜色加深；在NBTA培养基上，初生型可吸收溴麝香百里酚蓝(BTB)，形成蓝色菌落，次生型不能吸收呈紫色菌落。根据《常见细菌系统鉴定手册》方法进行生理生化指标测定，结果表明：昆虫病原线虫共生菌不能还原硝酸盐，过氧化氢酶、氧化酶阴性，淀粉水解、吲哚实验阴性，葡萄糖、纤维二糖、麦芽糖、甘油等产酸为阳性，蔗糖、蜜二糖、D-核糖等为阴性。
本发明昆虫病原线虫共生菌可在NBTA培养基上生长，生长温度为28℃，最适pH为7.2～7.4，转速180r/min。NBTA培养基由牛肉膏5g、蛋白胨10g、营养琼脂20g、氯化钠5g、溴麝香百里酚蓝(BTB)0.025g、氯化三苯基四氮唑(TCC)0.04g和蒸馏水1000mL组成。
本发明昆虫病原线虫共生菌通过16S rDNA序列比对分析，与致病杆菌属有极高的同源性，同源性为99％以上。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定昆虫病原线虫共生菌属于致病杆菌属(XeNorhabdus)，为致病杆菌XeNorhabdusbudapestensis。
平板抑菌实验表明，在固体培养条件下，本发明致病杆菌(XeNorhabdusbudapestensis)HEB02具有较强的抑制大豆立枯病原菌丝生长的能力，且随着体积浓度的增加而增大，抑菌效果越明显。
附图说明
图1表示为致病杆菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02在PDA培养基上的抑菌照片(对照，CK)。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种昆虫病原线虫共生菌，它为致病杆菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年4月11日，保藏号CGMCC No.12352。
本实施方式的致病杆菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02是按照如下方式获取的：
利用大腊螟诱集法从采自哈尔滨市的土样中分离出昆虫病原线虫；按下列方法分离初生型共生细菌：
用分离得到的昆虫病原线虫感染大腊螟5龄幼虫，虫体死亡后，用体积百分含量为75％的酒精浸泡3s后，用质量百分含量为1％的NaClO溶液擦拭虫体表面，并用灭菌滤纸吸干虫体上的水分；用灭菌剪子剪掉大腊螟前足，将从伤口流出的血淋巴涂布于NBTA培养基上，置于28℃生化培养箱中培养2-3天，挑取蓝色单菌落为初生型共生单菌落并接种于NA培养液(由牛肉膏5g、蛋白胨10g和蒸馏水1000mL组成)中，于28℃下180r/min振荡培养24h后，按体积比1％转入发酵培养液中振荡发酵36-48h后，离心管中冷冻离心，取上清液，以获得无菌体发酵液。
所筛选的昆虫病原线虫共生菌为革兰氏阴性菌，在营养琼脂培养基上为乳黄色菌落，圆形，微凸，边缘不整齐，随着时间延长颜色加深；在NBTA培养基上，初生型可吸收溴麝香百里酚蓝(BTB)，形成蓝色菌落，次生型不能吸收呈紫色菌落。根据《常见细菌系统鉴定手册》方法进行生理生化指标测定，结果表明：昆虫病原线虫共生菌不能还原硝酸盐，过氧化氢酶、氧化酶阴性，淀粉水解、吲哚实验阴性，葡萄糖、纤维二糖、麦芽糖、甘油等产酸为阳性，蔗糖、蜜二糖、D-核糖等为阴性。
对分离筛选得到的致病杆菌进行分子鉴定，按以下步骤进行：提取菌株的总DNA，根据共生菌16S rDNA设计引物，以基因组DNA为模板进行PCR扩增。然后利用胶回收试剂盒回收纯化PCR产物，之后，进行克隆、转化，测序。测序结果与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，同源性达到99％以上。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化鉴定结果确定昆虫病原线虫共生菌HEB02属于致病杆菌属(XeNorhabdus)，为致病杆菌XeNorhabdusbudapestensis。
具体实施方式二：本实施方式的一种昆虫病原线虫共生菌的应用，它用于防治大豆立枯病。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：它是采用昆虫病原线虫共生菌的菌液防治大豆立枯病。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：所述的昆虫病原线虫共生菌的菌液制备方法是按照以下步骤进行的：
将致病杆菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02接种于液体培养基中，在28℃，180r/min的条件下，振荡发酵培养36～48h，倒入离心管中冷冻离心后，取上清液，获到无菌体发酵液。
其它与具体实施方式二或三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式四不同的是：所述的液体培养基为NA培养液；1L的NA培养液是由5g的牛肉膏、10g的蛋白胨以及1000mL蒸馏水组成。
其它与具体实施方式四相同。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
应用梯度稀释法测定无菌体发酵液对大豆立枯病病原菌立枯丝核菌的拮抗作用。
具体步骤为：
1.前期准备：采集大豆立枯病样品，按照常规方法对病原菌进行分离、纯化后，接种于PDA培养基上置于24℃恒温培养箱内，培养至菌丝刚刚长满培养皿时，备用；
2.带药培养基的制备：在无菌条件下，将致病杆菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02发酵液加入到PDA培养基中混匀，以制备5个浓度梯度，以加无菌水的PDA培养基为对照，每处理3次重复；
3.拮抗作用测定：将5mm靶标菌(即大豆立枯病病原菌)饼分别接于上述不同浓度PDA培养基及对照培养基中心，24℃恒温培养3天，采用十字交叉法测量菌落直径，测定抑菌圈率；
4.数据处理：抑菌率公式如下，几率值法求毒力回归方程，算出各药剂对病原菌的EC50。
抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％；
为验证本实施例致病杆菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02的抑菌效果，现将结果列出如下：
通过上述抑菌实验，结果表明在PDA平板培养条件下，HEB02对丝核菌菌丝的生长具有较好的抑制作用，且随着体积浓度的增加而增大，抑菌效果越明显(见图1和表1)，抑菌中浓度及线性回归方程见表2。
表1 PDA平板培养条件下致病杆菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02的拮抗效果
体积比浓度 0.2 0.1 0.05 0.025 0.0125
抑菌率(％) 80.27 73.78 57.68 34.24 13.42
注：表中数据为接菌第三天时不同浓度的抑菌率，数值为3次重复平均值。
表2平板培养条件下致病杆菌(XeNorhabdus budapestensis)HEB02对大豆立枯病的毒力分析

Claims (4)

1.一种昆虫病原线虫共生菌在防治大豆立枯病中的应用，其特征在于所述昆虫病原线虫共生菌为致病杆菌(Xenorhabdus budapestensis)HEB02，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2016年4月11日，保藏号CGMCC No.12352。
2.根据权利要求1所述的一种昆虫病原线虫共生菌在防治大豆立枯病中的应用，其特征在于它是采用昆虫病原线虫共生菌的菌液防治大豆立枯病。
3.根据权利要求2所述的一种昆虫病原线虫共生菌在防治大豆立枯病中的应用，其特征在于所述的昆虫病原线虫共生菌的菌液制备方法是按照以下步骤进行的：
将致病杆菌(Xenorhabdus budapestensis)HEB02接种于液体培养基中，在28℃，180r/min的条件下，振荡发酵培养36～48h，倒入离心管中冷冻离心后，取上清液，获得无菌体发酵液。
4.根据权利要求3所述的一种昆虫病原线虫共生菌在防治大豆立枯病中的应用，其特征在于所述的液体培养基为NA培养液；1L的NA培养液是由5g的牛肉膏、10g的蛋白胨以及1000mL蒸馏水组成。
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