CN105746579A - 枯草芽孢杆菌hmb19198制剂在防治人参立枯病的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌HMB19198制剂的新用途，该用途为用来防治人参立枯病。在试验剂量下其防治效果可达到61.49％?78.30％。其中以4g/m²处理防效最高，在5％的水平下，与70％的恶霉灵可溶性粉剂2g/m²的防效相当，在具有恶霉灵化学农药防治效果的前提下，同时还是一种微生物菌剂，这样就保证了人参立枯病的防治是高效环保，无污染的；同时制作方法也非常简单，成本也非常低，使用技术非常成熟，是防治人参立枯病路途上的一座里程碑。

Description

枯草芽孢杆菌HMB19198制剂在防治人参立枯病的应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是涉及枯草芽孢杆菌HMB19198制剂在防治人参立枯病的应用。

背景技术

人参是多年生草本植物，生长在我国的东北山区的森林地带，对生长条件要求比较严格，分布地区是有限的，而且在野外条件下，生长非常缓慢，参根要生长三五十年才能达到50克重(加工干燥后只有10克重)。在人为条件下，土壤、水分、光照等都比野生环境优越得多，再加上经常锄草、松土、防治病虫等，人参生长发育比野生的快多了。经过研究，初步看到，人工种植6年收获的参根，在重量和质量上都相当于野生20～30年的参根。

人工种植的人参，从植物学角度看，它和野山参原是一家；从化学角度看，没什么本质区别。所以目前人工种植人参是填补大自然中人参资源缺少的一种弥补。

而人参对生长环境很苛刻，它特别喜欢生长在茂密的森林里，但不是所有茂密的森林中都能生长的。早在1000多年前，民间流传着“三桠五叶，背阳向阴，欲来求我，椴树相寻”的说法。这说明，最适合于人参生长的森林是针阔叶混交林和杂木林，其中以有椴树生长的阔叶林为最佳。当然，除了有椴树的森林以外，在有柞树和椴树的阔叶林中也有人参生长。

人参对土壤也有一定要求，它喜欢生长在棕色森林土上，而且需要比较丰富的腐殖质。在阔叶林里，由于常年枯枝落叶的堆积和腐烂，产生了许多腐殖质，土壤结构比较疏松，因此能满足人参的需要。

人参是喜阴植物，喜爱散射光和较弱的阳光，最怕强烈的阳光直接照射。而这种生长条件，在东北的阔叶林内最为理想。

人参也是耐寒植物，气温在15～20℃是生长发育良好，气温高于30度，就会停止生长，温度再高便会死亡。相反，冬季它在-40度是不会冻死，仍保持着生命力，第二年春天可继续生长。

上述条件，只有我国东北林区才有，特别是长白山地区的吉林省抚松县，有符合人参生长的理想环境条件，是人工种植人参的理想地区。

在人工种植的人参过程中，立枯病是人参苗期的主要病害，参区普遍发生，立枯病不仅为害1至2年生幼苗，3至4年生以上植株在生育初期，亦常受此病危害，一般发病率为6.2％-22.7％，常造成参苗成片列亡，损失较重，是参业生产中影响产量的主要原因。病状立枯病病菌侵害表土以下(3-6厘米)，干湿交界处茎部，被害组织初呈浅黄褐色，然后被害茎部腐烂和溢绷呈黄褐色长斑，使植株死亡。病菌侵染幼苗，可使小苗不能出土，出苗后主要侵害茎部，发病后，从中心病株迅速向四周到延，幼苗依次倒伏，造成成片幼苗死亡。

经研究发现，人参立枯病的病原菌为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，其属真菌。该病以菌丝体或菌核在土壤中的病残体上越冬。第二年春土壤温湿度适宜时，开始萌发侵染植株，逐渐向四周蔓延，此菌是一种偏酸性的兼性寄生菌，在土壤中可存活2-3年。立枯病在低温多湿的条件下极易发生。当气温在12-18℃，土温在14-16℃，土壤湿度30％-35％，排水不良等条件下发病较多。东北地区5月末开始发生，6月上中旬为盛期，6月下旬为末期，7月上旬基本停止。华北约提早1个月发生。土壤5厘米深的温度在5-17℃，含水量为27％-32％，立枯病发生蔓延极为迅速。

在目前的人参立枯病防治中，本技术领域技术人员还没有找到“特效药”。在本领域内，技术人员也正在不断的试验摸索中寻找能更好防治人参立枯病的制剂。现在也只能通过各个环节的综合方法来防治。最普遍的做法分为以下几个步骤：1、选无病土做营养土；2、选用抗病、包衣的种子，如未包衣，则用拌种剂或浸种剂灭菌；3、加强苗期管理：出苗后，严格控制温度、湿度及光照；提高地温，低洼积水地及时排水，防止高温高湿条件出现；4、发病初期若土壤湿度大，粘重，通透差，要及时改良并晾晒，再用药。在以上的防治步骤中第4步关于制剂的选用，则主要是采用恶霉灵农药，恶霉灵是一种广普性杀菌剂，对多种病原真菌引起的植物病害有一定的防治结果，对鞭毛菌、子囊菌、担子菌、半知菌亚门的腐霉菌、苗腐菌、镰刀菌、丝核菌、伏革菌、根壳菌和雪霉菌等引起的病状都有一定的治疗效果。恶霉灵虽然能够对立枯病起到一定的防治作用，但是恶霉灵毕竟是化学农药，且其药性单一，易造成高毒、高残、导致人参品质降低，同时易产生抗药性。因为在同一地区长期，连续使用一种农药，或使用作用机理相同的农药，害虫、病菌或杂草对农药抵抗力就会的提高，进而产生一定的抗药性。

近年来，生物防治方法由于高效、环保、无污染、无残留等优点越来越受到重视。因此，如何寻找到能够防治人参立枯病生物菌剂是本领域技术人员目前亟需解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌HMB19198制剂在防治人参立枯病的新用途。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种枯草芽孢杆菌HMB19198制剂的新用途，所述用途为用来防治人参立枯病。

优选的，所述制剂用量为2g/m²、3g/m²或4g/m²。

优选的，所述制剂使用方法为在人参播种移栽前开始用药，用药两次，间隔15天。

优选的，所述制剂处理方式为穴施。

优选的，所述土壤浇灌用水量为2.5kg水/m²。

本发明的枯草芽孢杆菌制剂是一种利用生物防治人参立枯病的解决办法，该菌剂对人参立枯病丝核菌特异性极强；不易产生抗药性，并且对人参立枯病有较好的防治效果，在试验剂量下其防治效果可达到61.49％-78.30％。其中以4g/m²处理防效最高，在5％的水平下，与70％的恶霉灵可溶性粉剂2g/m²的防效相当。在具有恶霉灵化学农药防治效果的前提下，同时还是一种微生物菌剂，这样就保证了人参立枯病的防治是高效环保，无污染的；同时制作方法也非常简单，成本也非常低，使用技术非常成熟，是防治人参立枯病路途上的一座里程碑。

具体实施方式

本发明的核心是提供一种枯草芽孢杆菌HMB19198制剂在防治人参立枯病的新用途，能够有效的防治人参立枯病。

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

首先对室内环境进行活性测试。

实施例一

本实施例的目的是鉴定枯草芽孢杆菌制剂对人参立枯病的防治效果及对人参生长的影响，测试浓度为：0.1～1000mg/L。

具体步骤如下：

(1)病菌培养：将人参立枯病病菌在PDA培养基上25℃恒温箱中培养5d后备用。

(2)制剂配置：制作枯草芽孢杆菌原粉试验，并以98.0％的恶霉灵原药为对照。将枯草芽孢杆菌原粉用灭菌水溶解，恶霉灵原药用丙酮溶解，药液用0.1％吐温80水溶液稀释，使有机溶剂的最终含量少于2％，设置5个浓度梯度，剂量设置见表1。

(3)制剂处理：在无菌操作条件下，根据试验处理将预先融化的灭菌PDA培养基取27ml定量加入无菌锥形瓶中，采用室内菌丝生长速率法，以5个不同质量浓度的制剂3ml，分别与27ml培养基混合，等量倒入3个无菌培养皿内，凝固后，接种人参立枯病菌，25℃下培养4d，以不含制剂但等量溶剂的PDA平板做对照。狮子交叉法垂直测量菌落直径，计算抑制百分率。试验设置3次重复。

对统计进行分析：

以制剂浓度(mg/L)的对数值及对应的抑制百分率的机率值作回归分析，计算各制剂的EC₅₀、EC₉₀及其95％置信限。以恶霉灵为标准制剂，计算枯草芽孢杆菌相对毒力指数。

单剂毒力指数＝X100

表1 室内试验数据

接种后4d检查结果(如表1)，枯草芽孢杆菌对人参立枯病菌的EC₅₀和EC₉₀分别为0.050mg/L和47.987mg/L，恶霉灵对人参立枯病菌的EC₅₀和EC₉₀分别为0.098mg/L和6.608mg/L。由上表测试数据清晰可知枯草芽孢杆菌抑制人参立枯病菌的EC₅₀低于标准制剂恶霉灵(防治人参立枯病常用制剂，设定参照毒力指数为100)，相对毒力指数为196.00，对人参立枯病菌具有较高的生物活性。

该实施例有效说明枯草芽孢杆菌HMB19198制剂在防治人参立枯病的新用途。

其次是对人参立枯病做田间试验。

实施例二

首先制备菌剂：

利用枯草芽孢杆菌HMB19198生产的微生物菌剂，该微生物菌剂的活性成分为枯草芽孢杆菌HMB19198芽孢和它的胞外代谢产物。

具体步骤如下：

(1)菌种活化：将低温保存的HMB19198菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上33℃培养40小时左右，得到活化的菌株；

(2)种子液制备：用无菌的接种环刮取一环步骤(1)中活化的菌株接种到100mLLB液体培养基中，在24～32℃、摇床转速为200rpm的条件下培养24～30小时后，得种子液；

(3)发酵培养：按照体积比为0.6％～2.8％的比例将步骤(2)的种子液接入到蔗糖豆饼粉培养基(pH值为5.6～6.0)中，在温度为24～32℃、摇床转速为200rpm的条件下发酵培养48～60h，得发酵液；所述的蔗糖豆饼粉培养基，其组成成分及其重量百分比为：蔗糖2.4～3.2％，豆饼粉1.8～2.6％，NaCl 0.1～0.2％，CaCO₃ 0.1～0.2％，HK₂PO₄ 0.01～0.02％和MgSO₄·7H₂O 0.01～0.02％，其余为水；

(4)检测发酵液中菌体和芽孢数量，待发酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌体总数的95％时停止发酵培养。

(5)将发酵液浓缩获得芽孢，再与固体填充物按照重量分数比1∶400的比例混合，然后经烘干和粉碎制成可湿性粉剂；所述的可湿性粉剂其组成成分及其重量百分比为：高岭土99％，葡萄糖1％。

本实施例的试验对象同样为马牙参，试验地点为吉林省抚松县松江河镇榆树村人参种植基地，参地为前一年立枯病发生较重的地块，于头一年秋天整理好。

制剂用量及处理编号如表1：

表2 供试制剂试验设计

处理编号	制剂	制剂施药量g/m2
			1	枯草芽孢杆菌制剂	2
2	枯草芽孢杆菌制剂	3
			3	枯草芽孢杆菌制剂	4
4	70％恶霉灵可溶性粉剂	2
			5	空白对照	-

其中小区面积为8m²，播种方式为撒播。重复次数为4次。处理方式为穴施。随后使用容量为2.5kg水/m²土壤浇灌，施药时间为两次，间隔时间为15日。

表3 小区排列

5	3	2	4	1	3	1	2	4	5
										3	2	1	5	4	2	5	3	1	4

表4 施药当日试验地天气状况

施药日期

天气状况

风向与风力

温度(℃)

相对湿度

降雨情况

其他气象因素

5.8

晴

偏西风、微风

20.4

36

无

5.23

多云转晴

东南风、微风

18.1

43

无

表5 试验结果统计

本实施例采用5点法调查、每点0.5平法米，记录立枯病株数和总植株数。

病株率的计算方式为：

$D=\frac{N_d}{N}\×100$

D--病株率，单位为百分比(％)，N_d--病株数，N-调查总株数。

防治效果的计算公式为：

CK₁--对照区发病率，PT₁--防治区发病率。

结果和分析如表6：

表6 10亿活芽孢/克枯草芽孢杆菌可湿性粉剂防治人参立枯病田间药效试验结果

生物统计分析采用DMRT法。

枯草芽孢杆菌制剂对人参立枯病有较好的防治效果，在试验剂量下其防治效果可达到61.49％-78.30％。其中以4g/m²处理防效最高，在5％的水平下，与70％的恶霉灵可溶性粉剂2g/m²的防效相当，是能够有效防治人参立枯病发病率的微生物菌剂。

实施例三

本实施例利用同实施例二的方法制备得到枯草芽孢杆菌制剂。

本实施例的试验对象依然为马牙参，试验地点依然为吉林省抚松县松江河镇榆树村人参种植基地，同样参地为前一年立枯病发生较重的地块，于头一年秋天整理好。

制剂用量及处理编号如表7：

表7 供试制剂试验设计

其中小区面积为8m²，播种方式为撒播。重复次数为4次。处理方式为穴施。随后使用容量为2.5kg水/m²土壤浇灌，施药时间为两次，间隔时间为15日。

表8 小区排列

5	3	2	4	1	3	1	2	4	5
										3	2	1	5	4	2	5	3	1	4

表9 施药当日试验地天气状况

施药日期

天气状况

风向与风力

温度

相对湿度

降雨情况

其他气象因素

5.2

多云转小雨

偏东风、微风

7.8℃

82％

无

5.17

晴

偏东风、微风

18.3℃

56％

无

表10 试验结果统计

本实施例同样采用5点法调查、每点0.5平法米，记录立枯病株数和总植株数。病株率的计算方式为：

$D=\frac{N_d}{N}\×100$

D--病株率，单位为百分比(％)，N_d--病株数，N-调查总株数。

防治效果的计算公式为：

CK₁--对照区发病率，PT₁--防治区发病率。

结果和分析如表11：

表11 枯草芽孢杆菌制剂防治人参立枯病田间药效试验结果

生物统计分析采用DMRT法。

枯草芽孢杆菌制剂对人参立枯病有较好的防治效果，在试验剂量下其防治效果可达到61.54％-79.60％。其中以4g/m²处理防效最高，在5％的水平下，与70％的恶霉灵可溶性粉剂2g/m²的防效相当，是能够有效防治人参立枯病发病率的微生物菌剂。

对实施例二和实施例三的人参生长过程中经进一步分析研究，将枯草芽孢杆菌HMB19198制剂施入土壤后，当人参在种子和生根发芽时期，枯草芽孢杆菌就能够在人参种子表面、根系表面和其体内进行定殖和传导，而且菌丝能随着人参成长中根的伸长而扩展繁殖，进而保护新根不受人参立枯病菌的侵染。同时枯草芽孢杆菌产生的抗菌物质也对人参立枯病病菌有强烈的抑制作用。

枯草芽孢杆菌通过抗生、营养和空间竞争、有效定殖来提高人参的综合抗逆能力从而达到更好的防治目的。

实施例四

对田间两处种植基地进行大面积的种植试验，并与70％恶霉灵可溶性粉剂和清水分别作出对比。具体数据如表12所示：

表12 田间大面积药效试验数据

从上述数据得知，枯草芽孢杆菌对人参立枯病防效比较好，其中3～4克/平法米制剂用量的防效与对照制剂70％恶霉灵在推荐下用量下的防效相当，对人参非常安全。故从本实施例中可得知使用制剂量3～4/克/平法米，在人参播种移栽前进行土壤浇灌处理，间隔15天，用药2次，兑水2.5升/平法米的防治方法是用量非常合理有效的一种防治方法。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种枯草芽孢杆菌HMB19198制剂的新用途，其特征在于，所述用途为用来防治人参立枯病。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌HMB19198制剂的新用途，其特征在于，所述制剂用量为2g/m²、3g/m²或4g/m²。

3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌HMB19198制剂的新用途，其特征在于，所述制剂使用方法为在人参播种移栽前开始用药，用药两次，间隔15天。

4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌HMB19198制剂的新用途，其特征在于，所述制剂处理方式为穴施。

5.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌HMB19198制剂的新用途，其特征在于，所述土壤浇灌用水量为2.5kg水/m²。