CN107586735A - 一种高效防治柑橘溃疡病的生防菌株ch01及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效防治柑橘溃疡病的生防菌株CH01及其应用。生防菌株CH01为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，其菌株保藏号为CGMCC NO.11677。平板抑制实验结果显示，蜡状芽孢杆菌CH01不仅能显著抑制柑橘溃疡病菌地毯草黄单胞菌柑橘致病变种的生长，同时对多种病原真菌具有显著的抑制效果。除此之外，蜡状芽孢杆菌CH01在体外表现出较强的水解酶活性。温室试验结果表明，蜡状芽孢杆菌CH01能够有效预防柑橘溃疡病的发生与发展，田间试验结果显示蜡状芽孢杆菌CH01对柑橘溃疡病的防治效果高达65.46％，因此生防菌株CH01能作为一种生防制剂，高效防治柑橘溃疡病。

Description

一种高效防治柑橘溃疡病的生防菌株CH01及其应用

技术领域

本发明属于农作物病害生物防治技术领域,涉及一种高效防治柑橘溃疡病的生防菌株CH01及其应用。

背景技术

芸香科柑橘属水果，如柑橘、橙子及柠檬，作为人们喜爱的水果，随着高效农业的推进，我国柑橘产业生产迅速发展，种植面积快速扩大。随着柑橘种植的专业化，多年的栽培使果园中柑橘溃疡病病原菌基数逐年增多，进而导致柑橘溃疡病发生日趋严重，一般损失率达15％～20％；严重时达30％～50％；最高可达100％，造成树梢溃疡病变，叶片大量发病，果实果皮畸形，溃疡，严重影响果实外观及口感，失去食用价值。同时也能引起田间损失，甚至在果实的储存和运输中造成严重危害。目前针对柑橘溃疡病菌的防治还没有效果好的防治措施和方法。现阶段在柑橘生产过程中对溃疡病的主要防治措施仍然是喷洒化学药剂等手段，但是由于长期的使用化学药使得溃疡病菌对多种杀菌剂产生了抗药性。我国西南地区等柑橘重点种植区中的柑橘树上的溃疡病菌都产生了较为严重的抗药性。寻求新的防治措施成为溃疡病菌防治的重中之重。生物防治措施作为一种新兴的防治措施，与其他方法相比，具有安全、有效、持久的特点，特别是避免了化学防治带来的一系列问题。生防制剂对病害防治效果好，对人畜无毒，不污染环境，无残留；对病虫害的杀伤特异性强，不伤害天敌，有益生物，能保持生态平衡；生产原料和有效成分为天然产物易降解，可回归大自然，保证可持续发展因此。因此生物防治溃疡病逐渐成为研究的热点，大量的拮抗微生物被筛选出来对柑橘溃疡病进行防治。

发明内容

本发明的目的针对柑橘溃疡病防治困难，柑橘生长促生效果差的现状，提供开发一种高效防治柑橘溃疡病的微生物菌剂CH01，专用于防治柑橘溃疡病。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

高效防治柑橘溃疡病的生防菌株CH01，生防菌株CH01经测序鉴定，为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。于2015年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.11677。

生防菌株CH01菌体细胞杆状，末端方形，1.1～1.2×3.2～5.1μm。革兰氏阳性，无荚膜。菌落大，表面粗糙，扁平，不规则。产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生或近中生，1.2～1.6μm。

本发明所述的防治柑橘溃疡病的生防菌株CH01在防治柑橘属植物溃疡病方面的应用。

所述的柑橘属植物优选包括柑橘、橙子、柠檬、香橼中的任意一种。

由本发明防治柑橘溃疡病的生防菌株CH01制备的生防菌剂。

高效防治高效防治柑橘溃疡病的生防菌株CH01的制备方法为：

将防治柑橘溃疡病的生防菌株CH01在LB(LB配方：氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.2)平板上划线，28℃培养24h，待长出单菌落后，挑取单菌落分别接入三支含有5mL的LB液体培养基的管中，置于28℃，200r/min的摇床中培养24h，制成种子液。以1％的接种量将种子液接种于装有500mL的LB液体培养基的三角瓶里，置于28℃，200r/min的摇床中培养48h，制成微生物合剂，其活菌总浓度为5×10⁹～1×10¹⁰CFU/mL。

本发明所述的生防菌剂在防治柑橘属植物溃疡病方面的应用。

其应用方法为：在柑橘属植物种植过程中将菌株制剂稀释后灌根使用，同时进行叶面、树梢喷施。

有益效果：

本发明与现有防治柑橘溃疡病的技术相比，其优点和积极效果表现在：本发明是专门针对防治柑橘溃疡病和促生长开发的生防微生物菌剂，因此在防治柑橘溃疡病及促生长方面与目前其他措施效果显著提高。由于是生防微生物制剂，完全没有其它措施所带来的一系列问题，因而有利于作物的无公害、绿色、有机生产，农民可以不用或减少应用其他防治柑橘溃疡病以及促生长的措施，这不仅可为农民种植减轻负担，而且有利于水果农产品的出口。同时，微生物菌剂还具有作物增产功效，可为农民增加收入。

微生物菌剂CH01在柑橘种植过程中，伴随灌根水稀释施用，同时进行叶面及果树枝干喷施，进行全面防护，因此能高效防治柑橘溃疡病，具有促进柑橘生长的效果。试验结果表明，微生物菌剂CH01在体外叶片，果实防病试验及大田能够高效防治柑橘溃疡病，其生防效果高达65％以上。除此之外，微生物菌剂CH01在田间对柑橘的生长具有一定的促进作用。因此微生物菌剂CH01能作为一种生防制剂，高效防治柑橘溃疡病。

附图说明

图1蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CH01对多种病原菌的拮抗试验结果。

图2蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CH01多种水解酶活性检测结果。

图3蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CH01体外防病效果。

生物材料保藏信息

CH01,分类命名为蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus，于2015年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.11677。

具体实施方式

实施例1

1)样品采集

CH01由江西省定南县脐橙园脐橙植株根围土壤中分离得到。

2)菌株分离方法

采用平板稀释法(参考中国科学院南京土壤所微生物室.土壤微生物研究法[M].北京：科学出版社，1985)。

3)平板拮抗测定

病原真菌：采用平板对峙法：将在25℃培养箱中培养5d的赤霉菌、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌古巴专化型、尖孢镰刀菌西瓜专化型、瓜类球腔菌，边缘打取直径0.6cm菌碟，赤霉菌、灰葡萄孢、尖孢镰刀菌古巴专化型、尖孢镰刀菌西瓜专化型、瓜类球腔菌接种在PDA平板的中央，然后在距其等距离的四个角用无菌牙签点接供试生防菌，每个处理设3个重复，平板倒置于25℃下培养4d，测量各处理生防菌半径r₁和生防菌边缘到病原真菌边缘的半径r₂，以此平均值菌株CH01对各种病原真菌的抑菌能力(图1)。

病原细菌：以0.5％的接种量取柑橘溃疡病病原菌菌液(2×10⁷CFU/mL)与50℃NA培养基混合均匀后，用50mL离心管每次量取20mL倒入灭菌的培养皿中，制成均匀混有病原菌的平板，待冷凝固20min，然后等距离在平板上用无菌牙签点接供试生防菌CH01，每个处理设3个重复，平板倒置于28℃下培养48h，测量生防菌半径r₁和生防菌边缘到透明圈边缘的半径r₂(即透明圈的宽度)，以此平均值评价菌株CH01对病原细菌的抑菌能力(图1)。

4)水解酶活性测定

4.1蛋白酶活性测定

在蛋白酶平板上(A：脱脂奶粉8g，溶于300mL水中，115℃灭菌10min，B：琼脂8g，定容至300mL，121℃灭菌20min，A与B分别灭菌后混合)接菌，30℃培养3d后观察透明圈有无，并记录大小。

4.2几丁质酶活性测定

将生防细菌在以胶体状几丁质为唯一碳源的培养基(Chi-Ayers)：(NH₄H₂PO₄1.0g，KCl 0.2g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，胶体状几丁质1％(w/v)，定容至1000mL，pH7.0，琼脂20g)上培养，接菌后30℃培养3d，测透明圈的大小。

胶体状几丁质的制备：20g甲壳素溶于350ml浓盐酸，4℃放置24h，玻璃棉过滤，滤液加入2L冰无水乙醇(－20℃过夜)，同时连续搅拌，充分搅拌均匀，研磨均匀，加入500mL50％(v/v)的乙醇，不断搅拌，直到胶体充分析出；将胶体置于低速离心机，3000rpm/min离心10min；弃上清，沉淀用蒸馏水冲洗，3000rpm/min离心10min，重复上述步骤，直至pH为中性，最终用蒸馏水定容至500mL，配成2％(v/v)的几丁质胶体，4℃保存备用。

4.3纤维素酶活性测定

纤维素酶活性测定参照Ghose T.K的方法。把准备好的生防菌株接到纤维素酶活性测定平板(蛋白胨10g，酵母粉10g，羧甲基纤维素钠10g，氯化钠5g，磷酸二氢钾1g，琼脂18g，定容至1000mL，pH＝7.0)，30℃培养3d后，用1g/L的刚果红染1h后，倒掉染液后，用1M的NaCl浸泡1h。检测透明圈的有无。并记录大小。

4.4产吲哚乙酸活性测定

参照Sawar和Kremer的方法，取二甲氨基苯甲醛8g，溶于760mL 95％的酒精和160mL浓盐酸中，制得艾利希氏试剂，以1％胰蛋白胨水溶液(PH＝7.2～7.6)为培养液，将生防细菌培养2d后加入3～5mL艾利希氏试剂,观察液面是否变红。

4.5产嗜铁素活性测定

测定嗜铁素是否产生，参照Shin et al等人的方法。A：1，60.5mg CAS(铬天青S)溶于50mL去离子水；2，10mL三价铁溶液(1mM FeCl₃.6H₂O，10mM盐酸为溶剂)；3，72.9mg HDTMA溶于40mL去离子水。上述三个溶液混合定容至100mL，pH调至中性，121℃灭菌20min。B：30.24g Pipes加入900mL Waker agar培养基，12g 50％(W/V)的NaOH溶液将培养基pH调至6.8，121℃灭菌20min。A、B液混合倒平板，接菌30℃培养3d观察，记录结果。

以上实验结果显示，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)CH01具有多种水解酶活性，由此保证了生防菌剂CH01具有良好的生防潜力(图2)。

5)菌株的鉴定

利用原核生物16S rRNA编码基因片段序列测序方法鉴定。

16S rRNA编码基因扩增和序列分析:

1.菌株在LB培养基中28℃培养至对数期，以12000r/min离心5min收集菌体，采用上海赛百盛基因技术有限公司的基因组DNA快速提取试剂盒，提取细菌的基因组DNA，以提取的DNA产物为模板，用细菌16S rRNA编码基因扩增通用引物Forward:U8-27(5’-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3’)、Reverse:L1494-1514(5’-CTACGG(AG)TACCTTGTTACGAC-3’)以基因组DNA为模板，进行16SrRNA编码基因基因片段。纯化PCR产物后，送样至上海生工生物工程有限公司进行测序。将测序结果通过NCBI BLAST软件进行同源性比较，最终鉴定生防菌株CH01经测序鉴定，为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，于2015年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.11677。

6)温室评估实验

病原菌菌悬液的制备：将分离得到的柑橘溃疡病菌地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)在NA培养基上进行活化，置于28℃培养箱中暗培养然后用接种环挑取适量菌体接种于无菌水中，混匀得到柑橘溃疡病菌的菌悬液，用麦氏比浊法调节菌液浓度为3×10⁸CFU/mL。

生防菌生防效果评估：将生防菌株CH01菌悬液均匀喷施于柑橘叶片，果实(橙子、柠檬)，风干30min后，将浓度为3×10⁸CFU/mL的柑橘溃疡病菌的菌悬液用针刺法离体接种于新鲜的柑橘叶片的背面或果实(橙子、柠檬)表皮，然后将叶片或果实(橙子、柠檬)放入塾有滤纸的培养皿中，28℃保湿培养，7d后观察发病情况，以接种无菌水的叶片为空白对照。

从培养箱中取出针刺离体接种后的柑橘叶片和橙子、柠檬果实观察，叶片及果实表面出现针头大小的黄绿色油渍状斑点，病斑呈火山口状的灰白色隆起，且在隆起处有近圆形的褐色病斑，完全符合柑橘溃疡病的发病症状，而接种无菌水的对照叶片则不发病。统计病斑数量及病斑的大小。结果显示，与对照相比，生防菌株CH01处理组病害病斑较小，防治效果达70％左右(图3、表1)。

表1温室条件下生防菌对柑橘溃疡病病害严重度影响及防治效果统计

注：数值为平均值±标准误，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。

7)大田防治柑橘溃疡病实验

本次大田实验在江西省定南县脐橙园进行，实验分为2个处理，处理间设立2m的保护行，按常规栽培管理技术进行田间管理，小区面积100m²，长25m、宽4m，小区间与四周均开好排灌沟，做到能排能灌，排灌方便。利用浓度为5×10⁶CFU/mL微生物菌剂CH01进行稀释灌根处理，每株苗500mL，以清水为对照。同时利用生物菌剂CH01稀释液进行喷雾，喷雾用量为叶片表面完全湿透并滴落为止。等对照发病后，观察发病情况。

大田防病试验结果表明生物菌剂CH01对柑橘溃疡病具有显著的防治效果。结果显示，微生物菌剂CH01对柑橘溃疡病的防治效果达65.46％(表2)。

表2田间条件下生防菌对柑橘溃疡病病害严重度影响及防治效果统计

注：数值为平均值±标准误，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。

Claims (6)

1.一种防治柑橘溃疡病的生防菌株CH01，其特征在于，生防菌株CH01经测序鉴定，为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，于2015年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.11677。

2.权利要求1所述的防治柑橘溃疡病的生防菌株CH01在防治柑橘属植物溃疡病方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的柑橘属植物包括柑橘、橙子、柠檬、香橼中的任意一种。

4.权利要求1所述防治柑橘溃疡病的生防菌株CH01制备的生防菌剂。

5.权利要求4所述生防菌剂的制备方法，其特征在于：

将权利要求1所述防治柑橘溃疡病的生防菌株CH01在LB平板上划线，28℃培养24h，待长出单菌落后，挑取单菌落分别接入LB液体培养基的管中，置于28℃，200r/min的摇床中培养24h，制成种子液；以1％的接种量将种子液接种于LB液体培养基中，于28℃，200r/min摇床培养48h，制成生防菌剂，其活菌总浓度为5×10⁹～1×10¹⁰CFU/mL。

6.权利要求4所述的生防菌剂在防治柑橘属植物溃疡病方面的应用。