CN103333810A - 一种粘质沙雷氏菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体公开了一种粘质沙雷氏菌及其应用。本发明所述粘质沙雷氏菌保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7416。本发明所述粘质沙雷氏菌传代至40代仍然具有较高抑制橡胶白粉病和香蕉枯萎病菌株孢子的活性，具有较高的遗传稳定性，同时其防治橡胶白粉病的效果达到化学防治的效果，对香蕉枯萎病具有显著防效，且不污染环境，生态、安全，能够广泛应用在橡胶白粉病和香蕉枯萎病的防治以及制备防治橡胶白粉病和香蕉枯萎病制剂中。

Description

一种粘质沙雷氏菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，更具体的说是涉及一种粘质沙雷氏菌及其应用。

背景技术

橡胶树又名巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell-Arg），属大戟科橡胶属，多年生异花授粉乔木，是制备天然橡胶的经济作物。香蕉是世界四大名果之一，是最重要的热带水果，具有较高的药用价值。橡胶树和香蕉均为我国海南地区特色经济作物，目前已被大面积的种植，是我国热区的重要支柱产业之一。

随着橡胶树和香蕉的大范围种植，随之而来的就是植物病害的侵袭。其中橡胶白粉病是橡胶树主要病害之一，在各植胶区广为流行，主要危害橡胶树的嫩叶、嫩芽和花序，引起落叶、落花。推迟开割时间，使乳胶减产，同时也易诱导或加重橡胶树的死皮病发生。据测定，2级白粉病造成开割树每年干胶损失量为3.43%，3级、4级、5级造成的损失量分别为8.43%、11%、43.65%。生产上的防治橡胶树白粉病的方法主要是化学预治，以喷撒硫磺粉为主。大量使用化学药剂，不仅耗力耗财、污染环境，而且易导致病原菌抗药性的产生。

香蕉枯萎病（Fusarium oxysporum f.sp.cubense）又名香蕉巴拿马病、黄叶病,是由古巴尖镰孢侵染而引起维管束坏死的一种毁灭性香蕉真菌病害和典型的土传病害。香蕉枯萎病病菌有4个生理小种,其中4号小种在亚洲、非洲的部分国家以及澳大利亚发生危害。香蕉枯萎病的危害性巨大，目前在我国植蕉区广为流传，病区3年内基本不能再种植香蕉。目前还没有找到一种有效的防治香蕉枯萎病的化学药剂，况且即使有合适的化学药剂也会遇到硫磺粉防治橡胶白粉病的问题。

生物防治具有无毒、无害、无污染、不易产生抗药性和高效等优点，因而在植物病害防治中越来越受到人们的重视与关注。目前生产上防治橡胶白粉的方法均采用化学防治为主，尚未有生物防治的报道。国内外有对香蕉枯萎病的生物防治报道，但所筛选的生防菌均为单孢杆菌、木霉等真菌，并且仅进行室内盆栽防治试验，尚缺乏大田试验结果，因此限制其作为生防制剂应用于生产。此外，现有筛选出的微生物随着传代次数的增加，其对橡胶白粉病菌和香蕉枯萎病菌的抑制活性逐渐降低，遗传稳定性较差，并且目前尚未有同时防治橡胶白粉病和香蕉枯萎病的的生物菌株。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种粘质沙雷氏菌及其应用，使得该菌株能够同时防治橡胶白粉病和香蕉枯萎病，使其防治橡胶白粉病的效果和化学防治无明显差异，对香蕉枯萎病具有显著防效，且具有较高的遗传稳定性。

橡胶树树皮会定期被开割采胶，割胶口是开放的，易于被外源微生物入侵并形成丰富的内生物资源，同时橡胶树通过芽接的方式将内生物传至子代，因此橡胶树含有丰富的内生生物资源。为实现本发明目的，本发明提供一种从橡胶树胶乳中分离得到的内生菌，命名为ITBB B5-1。

菌株ITBB B5-1在LB培养基上生长良好，菌落呈鲜红色、微隆、圆形、表面湿润光滑、粘性。该细菌形状为球形至短杆形，直径为0.5-1um，革兰氏阴性，周身鞭毛，能运动，无荚膜、无芽胞。V-P反应、接触酶、明胶液化、柠檬酸盐利用、KCN生长、硝酸盐还原反应均为阳性。淀粉水解、脲酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验均为阴性。

以细菌通用引物HNP120和HNP121扩增该菌株16S rDNA序列，序列长度为1534bp（序列参见SEQ ID NO:1所示核苷酸序列），提交GenBank，登陆号为JN896750.1。经GenBank数据库BLAST比对，与Serratia marcescensstrain L1（EF208031）、Serratia marcescens（FM179314）的同源性最高，达99%，结合生理生化特征，鉴定其为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）。

本发明所述粘质沙雷氏菌已于2013年4月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.7416。

本发明所述粘质沙雷氏菌传代培养的第1代、第10代、第20代、第30代、第40代对橡胶白粉病孢子萌发的抑制试验显示，所述粘质沙雷氏菌从第1代至第40代抑制橡胶白粉病孢子萌发的EC₅₀无显著差异，且均在5.72%以下，表明本发明所述粘质沙雷氏菌具有较好的抑制效果，且遗传稳定性较高，不会随传代次数的增加而降低对橡胶白粉病孢子的抑制活性。同样地，本发明所述粘质沙雷氏菌从第1代至第40代抑制香蕉枯萎病4号生理小种孢子萌发的EC₅₀无显著差异，且均在5.67%以下。

本发明所述粘质沙雷氏菌与硫磺粉对橡胶树白粉病防效试验表明，两者防效相当，无明显差别。这说明本发明所述的粘质沙雷氏菌对橡胶白粉病防效较高，达到化学防治效果，能够广泛应用在防治橡胶白粉病以及制备防治橡胶白粉病制剂中。

同时，本发明所述粘质沙雷氏菌对香蕉枯萎病生理4号小种防效的盆栽及大田试验表明，能显著降低病情指数，防治效果显著。这说明本发明所述的粘质沙雷氏菌对香蕉枯萎病生理4号小种防效好，能够广泛应用在防治香蕉枯萎病以及制备香蕉枯萎病防治制剂中，特别是由生理4号小种引发的香蕉枯萎病。

本发明还提供了一种生物制剂，包括保藏编号为CGMCC No.7416的粘质沙雷氏菌。本发明所述的生物制剂可对橡胶树进行喷雾防治，对香蕉进行灌根防治。

本发明所述的生防制剂制备方法如下：

将保藏编号为CGMCC No.7416的橡胶内生粘质沙雷氏菌于LB液体培养基中振荡培养，调节菌液细胞数为10¹⁰个/mL，即可得生防制剂制。

其中所述培养温度优选为26-28℃，更优选为28℃；所述LB培养基pH值优选为6-8，更优选为7；所述培养天数优选为3d。

由以上技术方案可知，本发明所述粘质沙雷氏菌传代至40代仍然具有较高抑制橡胶白粉病和香蕉枯萎病菌株孢子的活性，具有较高的遗传稳定性，同时其防治橡胶白粉病的效果达到化学防治的效果，对香蕉枯萎病具有显著防效，且不污染环境，生态、安全，能够广泛应用在橡胶白粉病和香蕉枯萎病的防治以及制备防治橡胶白粉病和香蕉枯萎病制剂中。

生物保藏说明

分类命名：粘质沙雷氏菌，Serratia marcescens.于2013年4月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.7416。

具体实施方式

本发明公开了一种粘质沙雷氏菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述橡胶内生粘质沙雷氏菌已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：本发明所述粘质沙雷氏菌的分离方法

用酒精消毒过的剪刀剪取健康橡胶芽接树茎段，立即用火将茎段切口处流出的胶乳烧干，阻止胶乳继续流出，将橡胶茎段带回实验室后用蒸馏水冲洗干净，切成长约4cm小段，75%的酒精浸泡1min，0.2%的升汞浸泡10min，最后灭菌水冲洗5遍。无菌滤纸吸掉多余的水分后，用灭菌手术刀将橡胶茎段切成两段，将其1滴胶乳滴到LB平板上并进行涂抹，以最后1遍冲洗液为对照，26℃培养，逐日观察。以上操作步骤均在无菌条件下操作完成。培养8d后对照中无菌落，而处理中长出1株红色的细菌菌株，命名为ITBB B5-1。

实施例2：本发明所述粘质沙雷氏菌生理生化以及16S DNA序列的测定

1、生理生化检测

检测ITBB B5-1在LB平板上的生长情况、菌落形态与颜色、革兰氏染色、芽孢染色和鞭毛染色等、接触酶、V．P．反应、淀粉水解、硝酸盐还原反应、明胶液化反应、氧化酶、苯丙氨酸脱氨酶、柠檬酸盐利用、脲酶试验、丙酸盐的利用等试验，方法参照东秀珠、蔡妙英主编的《常见细菌系统鉴定手册》353-390页的方法。

检测结果如下：

在LB培养基上生长良好，菌落呈鲜红色、微隆、圆形、表面湿润光滑、粘性。该细菌形状为球形至短杆形，直径为0.5-1um，革兰氏阴性，周身鞭毛，能运动，无荚膜、无芽胞。V-P反应、接触酶、明胶液化、柠檬酸盐利用、KCN生长、硝酸盐还原反应均为阳性。淀粉水解、脲酶试验、苯丙氨酸脱氨酶试验均为阴性。

2、16S rDNA序列的测定

细菌基因组DNA提取采用CTAB法，用细菌16S rDNA通用引物HNP120和HNP121进行PCR扩增，PCR反应体系为50μl，其中10×PCR Buffer5μl，HNP120和HNP121(10pm/ml)各1μl，dNTP Mixture(2.5mM)4μl，Taq DNA Polymerase(5U/μl)0.5μl，DNA模板1μl，ddH₂O37.5μl。PCR扩增反应条件：94℃5min；94℃45s，60℃50s，72℃2min，34个循环，72℃保持10min。用TAKARA Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0试剂盒进行回收，回收的PCR目的片段经电泳检测大小正确的，将产物直接送交上海生工，完成测序（序列参见SEQ ID NO:1所示核苷酸序列）。所得序列进行BLAST比对分析。

检测结果如下：

将扩增序列提交GenBank，登陆号为JN896750.1。经GenBank数据库BLAST比对，与Serratia marcescens strain L1（EF208031）、Serratia marcescens（FM179314）的同源性最高，达99%，结合生理生化特征，鉴定其为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）。

实施例3：本发明所述粘质沙雷氏菌对橡胶白粉病孢子萌发的抑制试验

试验设计：将本发明所述粘质沙雷氏菌接种于LB培养皿中进行活化，每隔24h转皿一次，每次作为培养一代，共转皿40次。用悬滴法测定第1代、第10代、第20代、第30代和第40代的内生粘质沙雷氏菌对橡胶白粉病孢子萌发的抑制效果，结果见表1。

表1本发明所述粘质沙雷氏菌对橡胶白粉病孢子萌发的抑制试验

由表1可知，本发明所述粘质沙雷氏菌从第1代至第40代抑制橡胶白粉病孢子萌发的EC₅₀范围为4.29-5.72%，差异较小，表明本发明所述粘质沙雷氏菌不会随着培养代数的增加而会降低对橡胶白粉病孢子的抑制活性，具有较好的遗传稳定性。同时本发明所述粘质沙雷氏菌抑制橡胶白粉病孢子萌发的EC₅₀均为5.72%以下，表明具有较好的抑制效果。

实施例4：本发明所述粘质沙雷氏菌对香蕉枯萎病4号生理小种孢子萌发的抑制试验

试验设计：将本发明所述粘质沙雷氏菌接种于LB培养皿中进行活化，每隔24h转皿一次，每次作为培养一代，共转皿40次。用悬滴法测定第1代、第10代、第20代、第30代和第40代的内生粘质沙雷氏菌对香蕉枯萎病4号生理小种孢子萌发的抑制效果，结果见表2。

表2本发明所述粘质沙雷氏菌对香蕉枯萎病4号生理小种孢子萌发的抑制试验

由表2可知，本发明所述粘质沙雷氏菌从第1代至第40代抑制香蕉枯萎病4号生理小种孢子萌发的EC₅₀范围为4.52-5.67%，无显著差异，表明本发明所述粘质沙雷氏菌不会随着培养代数的增加而会降低对香蕉枯萎病4号生理小种孢子的抑制活性，具有较好的遗传稳定性。同时本发明所述粘质沙雷氏菌抑制香蕉枯萎病4号生理小种孢子萌发的EC₅₀均为5.67%以下，表明具有较好的抑制效果。

实施例5：本发明所述粘质沙雷氏菌对橡胶白粉病的防效试验

试验设计：试验设计3个处理，分别为本发明所述粘质沙雷氏菌悬浮液（细胞数为10¹⁰个/mL）500倍稀释液、硫磺粉、清水。分别在一年龄的橡胶树幼苗喷洒3种处理药液，1d后接种新鲜的橡胶树白粉病孢子。每个处理3个重复，每个重复10株幼苗，每株幼苗接种3片古铜期叶片。14d后按表3分级标准统计病情。

表3病情严重度分级标准

0级	无病斑
		1级	病斑面积占整片叶面积的1/8
2级	病斑面积占整片叶面积的1/6
		3级	病斑面积占整片叶面积的1/4，或轻度皱缩
4级	病斑面积占整片叶面积的1/2，或中度皱缩
		5级	病斑面积占整片叶面积的3/4，严重皱缩或落叶

其中，病情指数%=∑（各病情级别值×该级别病叶数）/（最高级别值×调查总叶片数）×100，防治效果%=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100。防治效果采用SAS统计软件进行方差分析。结果见表4。

表4本发明所述粘质沙雷氏菌对橡胶白粉病的防治结果

由表4结果可知，喷洒本发明所述粘质沙雷氏菌能极显著降低橡胶白粉病的病情指数，与硫磺粉病情指数相当，无明显差异，同时本发明所述粘质沙雷氏菌对橡胶白粉病的防治效果达68.5%，与硫磺粉防治效果也无明显差异。这说明本发明所述粘质沙雷氏菌橡胶白粉病防效较高，达到化学防治效果。

实施例6：本发明所述粘质沙雷氏菌对香蕉枯萎病的防效的盆栽试验

试验设计：将根系完好的3-4叶期巴西种香蕉苗载入花盆中，每盆定植1株，接种香蕉枯萎病生理4号小种，遮阳2d，温室中培养15d后，以浇灌清水为对照，以灌注粘质沙雷氏菌ITBB B5-1悬浮液（细胞数为10¹⁰个/mL）500倍稀释液为处理。每处理3次重复，每一重复20株香蕉苗。接种60d后按表5分级标准进行病情调查。

表5香蕉苗被枯萎病菌侵染发病的病情分级标准

病级	发病程度	代表数值
			1	假茎基部无褐色	0
2	假茎基部变褐程度只有针鼻大小	1
			3	假茎基部变褐程度小于假茎直径的1/2，外围叶片出现小面积黄色斑块	2
4	假茎基部变褐程度大于假茎直径的1/2，外围叶片出现大面积黄色斑块	3

其中，病情指数%=[∑（病级株数×代表数值）/（株数总和×发病最重级的代表数值）]×100，防病效果%=[（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数]×100。病情指数采用SAS统计软件进行方差分析。结果见表6。

表6本发明所述粘质沙雷氏菌对香蕉枯萎病的盆栽防治效果

由表6结果可知，本发明所述粘质沙雷氏菌能极显著降低生理4号引发的香蕉枯萎病的病情指数，盆栽防治效果显著，达78.2%。

实施例7：本发明所述粘质沙雷氏菌对香蕉枯萎病的防效的大田试验

试验设计：将4-5片叶巴西种香蕉袋装苗置于温室中，接种香蕉枯萎病生理4号小种，3d后再接种一次，15d后，以灌注透粘质沙雷氏菌悬浮液（细胞数为10¹⁰个/mL）500倍稀释液为处理，以浇灌清水为对照，3d后重复灌注粘质沙雷氏菌菌液一次，15d后移植至大田，按株行距2m×2m进行定植。每个处理重复10次，每个重复20株香蕉苗。八个月后按表5分级标准进行病情调查以及统计香蕉枯萎病发病率和防病效果，结果见表7。

其中，发病率%=发病植株数/总定植植株数×100，防病效果%=[（对照发病率-处理发病率）/对照发病率]×100。病情指数采用SAS统计软件进行方差分析。

表7本发明所述粘质沙雷氏菌对香蕉枯萎病的大田防治效果

由表7结果可知，本发明所述粘质沙雷氏菌ITBB B5-1能极显著降低生理4号引发的香蕉枯萎病的病情指数，大田防治效果显著，达69.2%。

实施例8：制备本发明所述生防制剂

将保藏编号为CGMCC No.7416的粘质沙雷氏菌于pH值为7的LB培养液中培养，培养温度为28℃，天数为3d，转速为220rpm，然后调节菌液细胞数为10¹⁰个/mL，即得生防制剂成品。

实施例9：制备本发明所述生防制剂

将保藏编号为CGMCC No.7416的粘质沙雷氏菌于pH值为6的LB培养液中培养，培养温度为27℃，天数为3d，转速为220rpm，然后调节菌液细胞数为10¹⁰个/mL，即得生防制剂成品。

实施例10：制备本发明所述生防制剂

将保藏编号为CGMCC No.7416的粘质沙雷氏菌于pH值为8的LB培养液中培养，培养温度为26℃，天数为3d，转速为220rpm，然后调节菌液细胞数为10¹⁰个/mL，即得生防制剂成品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens.），其特征在于，保藏编号为CGMCC No.7416。

2.权利要求1所述粘质沙雷氏菌在防治橡胶白粉病和香蕉枯萎病中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述香蕉枯萎病为由香蕉枯萎病菌4号生理小种引发的香蕉枯萎病。

4.权利要求1所述粘质沙雷氏菌在制备防治橡胶白粉病和香蕉枯萎病制剂中的应用。

5.一种生防制剂，其特征在于，包括保藏编号为CGMCC No.7416的粘质沙雷氏菌。

6.权利要求5所述生防制剂在防治橡胶白粉病和香蕉枯萎病中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述香蕉枯萎病为由香蕉枯萎病菌4号生理小种引发的香蕉枯萎病。

8.一种生防制剂的制备方法，其特征在于，将保藏编号为CGMCCNo.7416的粘质沙雷氏菌于LB液体培养基中培养，然后调节菌液细胞数为10¹⁰个/mL，即得生防制剂成品。

9.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，所述培养的温度为26-28℃。

10.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，所述LB培养基的pH值为6-8。