CN107043720A

CN107043720A - 解淀粉芽孢杆菌hmb28388及其应用

Info

Publication number: CN107043720A
Application number: CN201710157408.3A
Authority: CN
Inventors: 鹿秀云; 马平; 李社增; 郭庆港; 张晓云; 丛蓉; 王培培; 赵卫松
Original assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Priority date: 2017-03-16
Filing date: 2017-03-16
Publication date: 2017-08-15
Anticipated expiration: 2037-03-16
Also published as: CN107043720B

Abstract

本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMB28388，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.13210。本发明还公开了利用该菌株生产的微生物菌剂，以及在防治黄瓜靶斑病等植物病害上的应用。本发明HMB28388菌株对黄瓜靶斑病的药效高，平均防效在90.0％以上；其次，利用本发明菌株防治黄瓜靶斑病不易产生抗药性，并且没有环境污染问题，制备和使用简单，成本低；此外，HMB28388菌株抑菌谱广，除黄瓜靶斑病菌外，还对棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌或番茄灰霉病菌等有很好的抑制作用。

Description

解淀粉芽孢杆菌HMB28388及其应用

技术领域

本发明属于生物防治领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌HMB28388，还涉及利用该解淀粉芽孢杆菌生产的微生物菌剂，以及它们在防治黄瓜靶斑病等植物病害上的用途。

背景技术

黄瓜靶斑病(又名棒孢叶斑病、褐斑病、“黄点子病”等)由多主棒孢霉(Corynespora cassiicola(Berk&Curt)Wei.)引起，尤以越冬温室、冬春温室、春大棚等保护地内发生严重。其症状起初为直径约1毫米的黄色水浸状斑点；发病中期病斑扩大为圆形或不规则形，易穿孔，叶正面病斑粗糙不平，病斑整体褐色，中央灰白色、半透明；后期病斑直径可达10～15毫米，病斑中央有一明显的眼状靶心，湿度大时病斑上可生有稀疏灰黑色霉状物，呈环状。黄瓜靶斑病严重影响黄瓜产量和品质，通常可造成减产20％，严重时减产达到60～70％。

对黄瓜靶斑病的防治方法有：(1)培育抗病品种：培育抗病品种是防治病害最经济有效的方法，但是由于对国内黄瓜种质资源中黄瓜靶斑病的抗性材料了解较少，培育抗性品种比较困难。(2)农业栽培措施防治：如减少种植密度、及时清理病老株叶，采用膜下滴灌降低棚室湿度等，但是防治效果较差。(3)化学防治：是目前防治黄瓜靶斑病的主要方法，主要通过喷施百菌清、甲霉灵、福美双、咪鲜胺、代森锰锌、戊唑醇和苯醚甲环唑等化学杀菌剂来防治黄瓜靶斑病。然而，长期大量使用化学农药，病原菌容易产生抗药性，致使防治效果降低；同时容易造成农产品和环境污染、引起新病害或次生病害大发生。(4)生物防治：利用微生物及其代谢产物等生物防治方法由于具有专化性强、不易产生抗药性、对人畜无毒、环境友好等优点，日益受到人们的青睐。

目前，防治黄瓜靶斑病的微生物主要有：简单芽孢杆菌(CN105002121A)、枯草芽孢杆菌(CN103131657A)和解淀粉芽孢杆菌(CN105950506A)等。由于生物的多样性以及共同进化特性，针对不同的病原菌，不同的拮抗微生物对其抗性不同，因此，需要不断选择新的生防微生物应对黄瓜靶斑病的不同病原菌以及不同的生理小种。

发明内容

本发明目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌菌株，该菌株具有高效、杀菌谱广等优点。

本发明另一目的在于提供利用上述解淀粉芽孢杆菌生产的微生物菌剂。

本发明第三目的在于提供上述微生物菌剂的制备方法。

本发明第四目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌菌株在防治黄瓜靶斑病等植物病害上的用途。

本发明第五目的在于提供上述微生物菌剂在防治黄瓜靶斑病等植物病害上的用途。

本发明通过以下技术方案实现：

一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMB28388，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.13210。

利用上述解淀粉芽孢杆菌HMB28388生产的微生物菌剂，其活性成分为解淀粉芽孢杆菌HMB28388菌体；还包括它的胞外代谢产物。

上述微生物菌剂可以为液体制剂。

上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化：将低温保存的HMB28388菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上，在25～35℃培养10～16小时，得活化的菌株；

(2)种子液制备：用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株接种到100mL LB液体培养基中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下培养10～16小时，得种子液；

(3)发酵培养：按照体积比为1～3％的比例将步骤(2)的种子液接入到玉米粉黄豆粉培养基(pH值为7.0)中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下发酵培养35～40h，得发酵液；

(4)检测发酵液中菌体和芽胞数量，待发酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌体总数的90％时停止发酵培养；所得即为HMB28388的液体制剂。

上述制备方法步骤(1)中所述的LB平板培养基或LB斜面培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，琼脂粉12～18g，水1000mL。

上述制备方法步骤(2)中所述的LB液体培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，水1000mL。

所述的LB平板培养基、LB斜面培养基和LB液体培养基均按照常规方法制备。

上述制备方法步骤(3)中所述的玉米粉黄豆粉培养基的组成成分及其重量百分比为：玉米粉1.0～3.0％，黄豆粉1.0～3.0％，NaCl 0.1～0.8％，MnSO₄·H₂O 0.5～1.0％，其余为水。

所述的玉米粉黄豆粉培养基的制备方法，按照重量百分比将玉米粉、黄豆粉、NaCl和MnSO₄·H₂O混合，再加水，调节pH，搅拌均匀即可。

上述微生物菌剂，其HMB28388的活菌数大于18.0×10⁸cfu/mL。

上述解淀粉芽孢杆菌HMB28388在防治黄瓜靶斑病、棉花黄萎病、棉花枯萎病、棉花立枯病或番茄灰霉病等植物病害上的应用。

上述微生物菌剂在防治黄瓜靶斑病、棉花黄萎病、棉花枯萎病、棉花立枯病或番茄灰霉病等植物病害上的应用。

上述微生物菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂用水稀释至活菌体数为10⁷cfu/mL，于黄瓜靶斑病发病前进行叶面喷雾，即可达到防治黄瓜靶斑病的目的。

HMB28388菌株的分离筛选过程

2013年1月河北省农林科学院植物保护研究所从海拔3950米的西藏自治区日喀则市仁布县雅鲁藏布江边石头山上五点采集土样，混匀后称取1g放到250mL的灭菌三角瓶中，加入100mL无菌水，放到摇床上，170rpm振荡30min，静置2h，取上清液10mL加入50mL灭菌离心管中，在80℃恒温水浴30分钟，然后取1mL加无菌水9mL，即成10mL10^-3倍土壤微生物悬液，继而将土壤悬液稀释成10^-4、10^-5、10^-6倍稀释液，取各浓度微生物悬液200μL涂于LB培养基平板上，每个浓度重复3次，在30℃恒温培养1d-3d，进行细菌的分离和纯化。并以黄瓜靶斑病为靶标，通过平板对峙法、叶盘漂浮法、盆栽试验法进行生防菌的筛选。结果从中筛选出一个对黄瓜靶斑病具有明显防治效果的菌株，定名为HMB28388。

HMB28388菌株的分类鉴定：

(1)形态特征鉴定

在LB培养基上培养菌体为杆状，培养10h后产生芽胞，芽胞中生，椭圆形，胞囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴胞晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断菌株HMB28388属于芽孢杆菌(Bacillus)。

(2)根据16S rDNA序列鉴定分类

以HMB28388的基因组DNA为模板，以F27和R1492为引物对16S rDNA进行PCR扩增，所述的引物序列为：

F27：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’(SEQ ID No.1)，

R1492：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID No.2)。

16S rDNA的扩增反应体系为50μL:10×PCR Buffer(Mg²⁺)5μL，dNTP Mixture(2.5mM)5μL，Taq(5U/μL)1μL，F27(10μmol/L)1μL，R1492(10μmol/L)1μL，HMB28388的基因组DNA 50ng，ddH₂O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，送交上海生工生物工程有限公司测序，得到HMB28388的16S rDNA序列(见SEQ ID No.3)。将所得HMB28388的16S rDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果菌株HMB28388与芽孢杆菌属的16S rDNA同源性达到95％；同时利用MEGA软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树(见图1)，HMB28388与芽孢杆菌属聚合到一起，说明HMB28388属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

(3)根据gyrB基因序列鉴定分类

以HMB28388基因组DNA为模板，利用芽孢杆菌gyrB基因兼并引物gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的gyrB-F和gyrB-R引物的序列为：

gyrB-F：5’-TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT-3’(SEQ ID No.4),

gyrB-R：5’-TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC-3’(SEQ ID No.5).

gyrB的PCR扩增反应体系为50μL:10×PCR Buffer(Mg²⁺)5μL，dNTP Mixture(2.5mM)5μL，Taq(5U/μL)1μL，gyrB-F(10μmol/L)1μL，gyrB-R(10μmol/L)1μL，HMB28388基因组DNA 50ng，ddH₂O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，得HMB28388菌株的gyrB基因序列(见SEQ ID No.6)。将获得的HMB28388菌株的gyrB基因序列在Genbank中进行同源性比较，结果发现HMB28388与解淀粉芽孢杆菌的gyrB基因序列同源性最高，达到90.5％；同时利用MEGA软件

(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树(见图2)，HMB28388菌株与解淀粉芽孢杆菌聚合到一起，说明HMB28388为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，并且是一个新菌株。

综合以上形态特征、16S rDNA和gyrB基因序列同源性对比分析的结果，可知HMB28388属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，并且和现有的解淀粉芽孢杆菌菌株不同，是一个新的解淀粉芽孢杆菌菌株。

本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明HMB28388菌株对黄瓜靶斑病的药效高，平均防效在90.0％以上，且针对性强；(2)利用本发明HMB28388菌株防治黄瓜靶斑病不易产生抗药性，药效持久性好；(3)本发明解淀粉芽孢杆菌HMB28388抑菌谱广，除了黄瓜靶斑病菌外，对棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌和番茄灰霉病菌也有很好的抑制作用；(4)本发明微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染；(5)本发明微生物菌剂制备方法简单、成本低、使用简单。

生物保藏：本发明解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMB28388，己于2016年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.13210。

附图说明

图1为根据16S rDNA序列获得的HMB28388菌株系统发育树。

图2为根据gyrB基因序列获得的HMB28388菌株系统发育树。

具体实施方式

下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。

实施例1HMB28388微生物菌剂的制备

按照如下步骤进行：

(1)菌种活化：将保存于-80℃的解淀粉芽孢杆菌菌株HMB28388(该菌株HMB28388己于2016年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13210)在LB平板培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，琼脂粉15g，水1000mL)上进行活化(30℃)，挑取单菌落在LB斜面培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，琼脂粉15g，水1000mL)上在30℃下培养30小时，得活化的菌株；

(2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，水1000mL)，在250mL三角瓶中装入LB培养液100mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入一接种环步骤(1)活化好的菌株，在30℃、摇床转速190rpm的条件下进行振荡培养24小时，得种子液；

(3)玉米粉黄豆粉培养基的制备：按照重量百分比将玉米粉1.5％，黄豆粉2.0％，NaCl 0.5％，MnSO₄·H₂O 0.6％加入水中，搅拌混合均匀，即得玉米粉黄豆粉培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL；在121℃对玉米粉黄豆粉培养基进行灭菌30分钟，再降温到30℃备用；

(4)发酵培养：向步骤(3)所得每瓶玉米粉黄豆粉培养基200mL中接种步骤(2)所得种子液2mL；在30℃、摇床转速180rpm条件下进行发酵培养36h，以后每隔30分钟从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽胞和总菌体数进行计数，并计算芽胞率(芽胞率(％)＝成熟芽胞数/(成熟芽胞数+菌体数)×100)；芽胞率达到90％时停止发酵培养；共发酵培养约48h，得解淀粉芽孢杆菌HMB28388的液体制剂。

实施例2本发明HMB28388菌株对黄瓜靶斑病菌的拮抗作用试验

(一)供试黄瓜靶斑病菌CA-1菌株来源：黄瓜靶斑病菌CA-1菌株采自河北省保定市满城县大赛村黄瓜病叶，经河北省农林科学院植物保护研究所分离纯化，河北农业大学植物保护学院植物病理系鉴定为多主棒孢霉(Corynespora cassiicola)，致病力测定表现为强致病力。

(二)试验方法：

平板对峙实验：首先将黄瓜靶斑病菌CA-1菌株在PDA平板上活化培养7天，然后用直径为6mm的打孔器在菌落边缘区域打孔制成菌片，再将黄瓜靶斑病菌菌片转接在另一个PDA平板中央；将实施例1步骤(1)活化的解淀粉芽孢杆菌HMB28388点接在距指示菌菌片2.0厘米处，设空白对照(不点接HMB28388菌株的黄瓜靶斑病菌生长情况)。在25℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，测量黄瓜靶斑病菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种HMB28388后的抑制生长半径)，拮抗作用用抑菌率表示。

抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100。

结果(见表1)解淀粉芽孢杆菌HMB28388对黄瓜靶斑病菌的抑制率达81.58％；透明的抑菌带宽9.0毫米；说明本发明解淀粉芽孢杆菌HMB28388对黄瓜靶斑病菌具有明显的抑制作用，具有防治黄瓜靶斑病的生防潜力。

表1 HMB28388菌株对黄瓜靶斑病菌的拮抗作用试验结果

实施例3本发明HMB28388菌株对黄瓜靶斑病防效对比试验

(一)试验处理：

(1)HMB28388微生物菌剂：实施例1制备的HMB28388液体制剂的100倍水稀释液；

(2)空白对照：清水。

(二)试验方法：

本试验在河北省农林科学院植物保护研究所植病生防实验室内进行。

(1)培育黄瓜植株：在直径6cm的营养钵中培育津优1号黄瓜苗，育苗基质为蛭石，每个营养钵播种两粒种子，出苗后留取一棵壮苗。待黄瓜苗生长出两片真叶时移栽到直径25cm的塑料花盆中(花盆中装填蛭石与田园土按照1:1比例配成的基质)，在25℃恒温培养(光照14小时，黑暗10小时)。将黄瓜苗用竹竿支撑固定继续培养，将黄瓜幼蕾掐掉，保证植株营养生长。

(2)黄瓜靶斑病病原菌孢子悬浮液制备：将黄瓜靶斑病菌CA-1菌株在PDA平板上活化培养7天，然后用打孔器在菌落边缘区域打孔制成菌片，再将黄瓜靶斑病菌菌片转接在PSA平板中央，在25℃培养7-10天，产生分生孢子后用无菌水冲洗收集分生孢子，配成分生孢子浓度为10⁴个/mL的悬浮液，备用。

(3)叶盘漂浮法测定防治效果：取步骤(1)中无病完整相同叶位的黄瓜叶片，处理1为喷施实施例1制备的HMB28388液体制剂的100倍水稀释液；处理2为空白对照，喷施等量清水。在30℃光照培养箱中培养24小时，用打孔器切取直径15mm的叶盘，放置在加有无菌水的培养皿中，每皿10个叶盘，使叶盘漂浮在水面，在每个叶盘中部滴加10ul步骤(2)制备的黄瓜靶斑病病原菌孢子悬浮液。每个处理重复4次，每个重复30个叶盘。在25℃光照培养箱中培养13天，调查病级并且计算防治效果。分级标准：0级，无病斑；1级，少量病斑，不产生分生孢子；2级，产生分生孢子，病斑面积小于叶片面积的50％；3级，产生分生孢子，病斑面积大于叶片面积的50％。

表2本发明HMB28388菌株对黄瓜靶斑病防效对比试验结果

处理	病情指数	防效(％)
			HMB28388液体制剂	8.45b	84.86
空白对照	55.83a	--

结果(见表2)HMB28388液体制剂处理病情指数为8.45，显著低于空白对照的病情指数55.83，HMB28388液体制剂对黄瓜靶斑病的防效为84.86％。说明本发明解淀粉芽孢杆菌菌株HMB28388及其HMB28388液体制剂对黄瓜靶斑病具有突出的防治效果。

实施例4本发明HMB28388菌株对黄瓜靶斑病防效对比试验

(一)试验处理：

(1)HMB28388微生物菌剂：实施例1制备的HMB28388液体制剂的100倍水稀释液。

(2)化学药剂：10％苯醚甲环唑水分散粒剂(世高)(苏州作物保护有限公司生产)1000倍稀释液。

(3)空白对照：清水。

(二)试验方法：

(1)培育黄瓜植株：在直径6cm的营养钵中培育津优1号黄瓜苗，育苗基质为蛭石，每个营养钵播种两粒种子，出苗后留取一棵壮苗。待黄瓜苗生长出两片真叶时移栽到直径15cm的塑料花盆中(花盆中装填蛭石与田园土按照1:1比例配成的基质)，在25℃恒温培养(光照14小时，黑暗10小时)。将黄瓜苗用竹竿支撑固定继续培养，将黄瓜幼蕾掐掉，保证植株营养生长。

(2)黄瓜靶斑病病原菌孢子悬浮液制备：将黄瓜靶斑病菌CA-1菌株在PDA平板上活化培养7天，然后用直径为6mm的打孔器在菌落边缘区域打孔制成菌片，再将黄瓜靶斑病菌菌片转接在PSA平板中央，在25℃培养7-10天，产生分生孢子后用无菌水冲洗收集分生孢子，配成分生孢子浓度为10⁴个/mL的悬浮液，备用。

(3)盆栽试验测定防治效果：取步骤(1)培养的4-6片真叶的黄瓜苗，处理1为喷施实施例1制备的HMB28388液体制剂的100倍水稀释液；处理2为化学药剂处理，喷施10％苯醚甲环唑水分散粒剂(世高)1000倍水稀释液；处理3为空白对照，喷施等量清水。在30℃恒温培养室中培养24小时，喷施步骤(2)制备的黄瓜靶斑病病原菌孢子悬浮液。每个处理重复4次，每个重复5盆黄瓜苗。共开展两批次试验。在25℃恒温培养箱中培养10-15天(光照14小时，黑暗10小时)，待空白对照充分发病后调查病级并且计算防治效果。黄瓜靶斑病级别划分标准和防效计算方法参照GB/T 17980.26-2000。

结果(见表3)第一批次试验结果中HMB28388液体制剂处理的病情指数为6.86，显著低于空白对照的病情指数65.14，HMB28388液体制剂对黄瓜靶斑病的防治效果达89.47％，与化学药剂处理的防效88.36％相当。第二批次试验结果中HMB28388液体制剂处理病情指数1.95，显著低于空白对照的病情指数52.63，HMB28388液体制剂对黄瓜靶斑病的防效96.29％，与化学药剂对照的防效97.64％相当。上述结果说明解淀粉芽孢杆菌菌株HMB28388及其HMB28388液体制剂对黄瓜靶斑病具有突出的防治效果。

表3本发明HMB28388菌株对黄瓜靶斑病防效的对比试验结果

实施例5本发明HMB28388菌株对4种植物病原真菌的抑制作用试验

(一)4种病原真菌及其来源：棉花黄萎菌(Verticillium dahliae)VD-1、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporium f.sp.vasinfectum)FOV-1、棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani)RHs-15和番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)BC-32。这4种病原真菌的菌株均由河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室保存。

(二)试验方法：

采用对峙培养法检测解淀粉芽孢杆菌HMB28388菌株对4种植物病原真菌的抑制作用。将解淀粉芽孢杆菌HMB28388在LB斜面培养基上30℃下活化24h，待测。将(一)中的4种病原真菌在PDA培养基上活化5d，然后用直径6mm的打孔器在菌落边缘打取菌龄一致的菌盘，菌丝朝下转接到另一PDA平板中央，在距菌盘2cm处呈“品”字形接种HMB28388，以不接细菌为对照，每处理3次重复，放于25℃恒温培养5d，测量处理菌落半径和细菌接种点至病原菌菌落边缘的间距(抑菌带)，确定抑菌程度，计算抑菌率。

抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100。

结果(见表4)本发明解淀粉芽孢杆菌HMB28388对供试的4种病原真菌的抑菌率为63.33％～82.23％，其中对棉花黄萎病菌的抑菌率为82.23％，对棉花立枯病菌的抑菌率最低，为63.33％，说明本发明解淀粉芽孢杆菌菌株HMB28388对棉花枯萎病菌、棉花黄萎病菌、棉花立枯病菌和番茄灰霉病菌也有很好的抑制作用，具有较广的抑菌谱。

表4本发明HMB28388对4种植物病原真菌的抑制作用试验结果

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省农林科学院植物保护研究所

<120> 解淀粉芽孢杆菌HMB28388及其应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 27F

<400> 1

agagtttgat catggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R1492

<400> 2

ggctaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 968

<212> DNA

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<400> 3

ggccggggcg ctgctataca tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt 60

agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120

aaaccggggc taataccgga tggttgtctg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct 180

tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240

ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300

ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360

ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag 420

aacaagtgcc gttcaaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540

gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600

gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660

ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720

ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc 840

attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960

tcttgaca 968

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gyrB-F

<400> 4

ttgrcgghrg ygghtataaa gt 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gyrB-R

<400> 5

tccdccstca gartcwccct c 21

<210> 6

<211> 964

<212> DNA

<213> Bacillus amyloliquefaciens

<400> 6

cccttgggcc ttaggtgtac ggcatccgtc gtaacgcctt gtcgaccact cttgacgtta 60

cggttcatcg tgacggaaaa atccattatc aggcgtacga gcgcggtgta cctgtggccg 120

atcttgaagt gatcggcgaa actgataaga ccggaacgat tacgcacttc gttccggacc 180

cggaaatttt caaagaaaca actgtatatg actatgatct gctttcaaac cgtgtccggg 240

aattggcctt cctgacaaaa ggcgtaaaca tcacgattga agacaaacgt gaaggacaag 300

aacggaaaaa cgagtaccac tacgaaggcg gaatcaaaag ctatgttgag tacttaaacc 360

gttccaaaga agtcgttcat gaagagccga tttatatcga aggcgagaaa gacggcataa 420

cggttgaagt tgcattgcaa tacaacgaca gctatacaag caatatttat tctttcacaa 480

ataatatcaa cacatacgaa ggcggcacgc acgaggccgg atttaaaacc ggtctgaccc 540

gtgtcataaa cgactatgca agaagaaaag ggattttcaa agaaaatgat ccgaatttaa 600

gcggggatga tgtgagagaa gggctgactg ccattatttc aattaagcac cctgatccgc 660

aattcgaagg gcagacgaaa accaagctcg gcaactccga agcgagaacg atcactgata 720

cgctgttttc ttctgcgctg gaaacattcc ttcttgaaaa tccggactca gcccgcaaaa 780

tcgttgaaaa aggtttaatg gccgcaagag cgcggatggc ggcgaaaaaa gcccgggaat 840

tgacccggcg caaaagtgcg cttgagattt ccaatctgcc gggcaaactg gcggactgtt 900

cttctaaaga tccgagcatt tccgagctgt atatcgtaga gggagactct ggaacgggcg 960

gaaa 964

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株HMB28388，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.13210。

2.利用权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌HMB28388生产的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为解淀粉芽孢杆菌HMB28388菌体。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于所述的微生物菌剂为液体制剂。

4.权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将低温保存的HMB28388菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上，在25～35℃培养10～16小时，得活化的菌株；

(2)用无菌的接种环刮取一环步骤(1)活化的菌株接种到100mL LB液体培养基中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下培养10～16小时，得种子液；

(3)按照体积比为1～3％的比例将步骤(2)的种子液接入到玉米粉黄豆粉培养基(pH值为7.0)中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下发酵培养35～40h，得发酵液；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤(1)中所述的LB平板培养基或LB斜面培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，琼脂粉12～18g，水1000mL。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤(2)中所述的LB液体培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，水1000mL。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于其步骤(3)中所述的玉米粉黄豆粉培养基的组成成分及其重量百分比为：玉米粉1.0～3.0％，黄豆粉1.0～3.0％，NaCl 0.1～0.8％，MnSO₄·H₂O 0.5～1.0％，其余为水。

8.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌HMB28388在防治黄瓜靶斑病、棉花黄萎病、棉花枯萎病、棉花立枯病或番茄灰霉病上的应用。

9.权利要求2所述的微生物菌剂在防治黄瓜靶斑病、棉花黄萎病、棉花枯萎病、棉花立枯病或番茄灰霉病上的应用。