CN106085885A - 一种拮抗香蕉枯萎病的棘孢木霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种拮抗香蕉枯萎病的棘孢木霉菌及其应用，所述拮抗香蕉枯萎病的棘孢木霉菌为棘孢木霉PZ6，所述棘孢木霉PZ6已于2016年1月18保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2016043，地址：中国，武汉，武汉大学。本发明的棘孢木霉PZ6，由于该菌株本身分离自植物根际土壤，是土壤习居菌，根际定殖能力强，防治效果良好，尤其对香蕉枯萎病病原菌的拮抗能力强；而且培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，有着良好的开发应用前景。

Description

一种拮抗香蕉枯萎病的棘孢木霉菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种拮抗香蕉枯萎病的棘孢木霉菌及其应用。
背景技术
香蕉，芭蕉科(Musaceae)芭蕉属(Musa)大型草本植物，又指其果实。热带地区广泛栽培食用。原产亚洲东南部，中国台湾、海南、广东、广西等地区均有栽培。香蕉味香、富于营养。
香蕉枯萎病，又名巴拿马病和黄叶病，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporum f.sp.cubense，简称Foc)引起的一种维管束坏死的一种毁灭性香蕉真菌病害和典型的土传病害。该病传播途径广，致病力强，蔓延速度快，感染率高，防治难，植株受感染后死亡率高。香蕉枯萎病一旦发生就极具毁灭性，对香蕉产业的危害十分严重。此病1874年在澳大利亚被发现，上世纪中叶在巴拿马及南美洲的几个国家大面积爆发，约有43hm2的香蕉园遭毁，使风靡全球的国际贸易香蕉品种大蜜舍(GroNichel)退出历史舞台，并通过香蕉出口传播到全世界。到上世纪50年代，除了南太平洋、地中海、马来西亚的一些岛屿外，世界其他地方均有香蕉枯萎病的发生。上世纪70年代香蕉枯萎病在中国台湾流行，使中国台湾香蕉面积从5万hm2锐减至5000hm2。我国大陆自1996年发生香蕉枯萎病4号小种以来，该病在广东、海南等蕉区以每年20％以上的速度扩大感染面积，病害以几何级数在我国主要的香蕉产区扩展。广东省香蕉枯萎病从1996年在番禺地区发生，最初面积20亩，很快在珠江三角洲香蕉产区连片发生，到2006年，其种植面积减少了近2万公顷，其中1万多公顷的蕉园不能再种植香蕉。随着香蕉产业向新区转移，香蕉枯萎病在新兴的蕉区不断扩展蔓延。2002年，菲律宾的香蕉出口基地的高山蕉园发现枯萎病4号小种，除了隔离、丢荒外，至今仍没有其他较好的防治办法。迄今为止，国内外仍未找到防治香蕉枯萎病的有效方法，国外一经发现就宣布病区为疫区。香蕉枯萎病的防治仍是尚未解决的世界难题，除公认的选育抗病品种外，而且由于化学农药的公害问题日趋严重，生物防治成为防治该病害的研究热点。
发明内容
针对以上技术问题，本发明公开了一种拮抗香蕉枯萎病的棘孢木霉菌及其应用，对香蕉枯萎病菌抑制作用强，对香蕉枯萎病具有良好的防治效果。
对此，本发明的技术方案为：
一种拮抗香蕉枯萎病的棘孢木霉菌，所述拮抗香蕉枯萎病的棘孢木霉菌为棘孢木霉PZ6，其拉丁文为Trichoderma asperellum PZ6，所述棘孢木霉PZ6已于2016年1月18保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2016043，地址：中国，武汉，武汉大学。该棘孢木霉PZ6的分类命名为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。
所述棘孢木霉PZ6的形态特征是：菌落形成同心环，在同心环上产生稠密的分生孢子，接近中央的分生孢子暗绿色，边缘的分生孢子才刚刚形成，气生菌丝缺。分生孢子梗形成垫状至半球形丛束，散布在整个菌落或聚集成2～3个同心圆环，暗绿色。菌落背面不变色。分生孢子梗细长、弯曲，次级分枝对生。瓶梗安瓶形，3个或更多个一组轮生。分生孢子球形、近球形。
所述棘孢木霉PZ6的培养特征是：在PDA上白色匍匐菌丝生长迅速，气生菌丝不发达，2-3d后即长出绿色的分生孢子，孢子呈同心环排列，接近中央的分生孢子暗绿色，边缘的分生孢子才刚刚形成，偏淡绿色。其生理生化特征是：能利用的N源有硝酸盐、硫酸盐、尿素等，能利用果糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖，具有促进孢子萌发的作用，无糖条件下不产孢。
所述棘孢木霉PZ6的rDNA-ITS核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
木霉菌(Trichoderma spp)作为自然界中普遍存在的非植物病原菌，因为其具有广泛的适应能力、对植物病原真菌的良好的拮抗活性、对非靶标生物安全及不污染环境等优点，已成为最有开发潜力的生防微生物之一。
木霉菌对多种病原微生物引起的病害具有较好的防治效果，在生物防治和环境保护等领域具有巨大的应用前景，是目前研究最多、应用最广泛的生防菌之一。国内外关于利用木霉菌防治植物病害，特别是根腐病、枯萎病、菌核病和纹枯病等土传病害的报道很多，且均取得了良好的防效。
本发明的棘孢木霉PZ6，由于该菌株本身分离自植物根际土壤，是土壤习居菌，根际定殖能力强，防治效果良好，尤其对香蕉枯萎病病原菌的拮抗能力强。
本发明还公开了所述的拮抗香蕉枯萎病的棘孢木霉菌的应用，应用在防治香蕉枯萎病中。
本发明还公开了一种防治香蕉枯萎病的制剂，其包括如上所述拮抗香蕉枯萎病的棘孢木霉菌的固体菌剂，即包括棘孢木霉PZ6。
进一步的，所述防治香蕉枯萎病的制剂为将所述棘孢木霉PZ6经菌种活化、固体发酵工序制备获得的固体菌剂。
进一步的，所述防治香蕉枯萎病的制剂采用以下步骤制备得到：
步骤S1：将所述棘孢木霉PZ6活化，得到菌种；
步骤S2：将固体培养基质发酵，得到发酵饼；
步骤S3：将所述发酵饼干燥粉碎，与吸附载体混合，干燥，制成固体菌剂。
采用此技术方案，所述防治香蕉枯萎病的制剂制备方法工艺简单，发酵培养基无需贵重原料，成本低，容易推广。
进一步的，步骤S1还包括菌种培养。
进一步的，所述吸附载体为椰糠、米糠、花生麸、麦麸、玉米粉中的至少一种。
进一步的，所述固体培养基质包括的组分及其质量百分比为：麦麸90％，玉米粉8～9％，1～2％米糠。以上仅为本发明中优选的培养基，实际上本发明对培养条件及固体培养基的选择其实并没用特别严格的限制，只要该条件和固体培养基适合菌株的生长即可。
本发明还公开了如上所述的防治香蕉枯萎病的制剂在防治香蕉枯萎病中的应用。
本发明所述防治香蕉枯萎病的制剂在防治香蕉枯萎病时，可以将固体菌剂与普通有机肥按1:100的比例混合拌匀后作为底肥施用，每个定植穴施用5公斤，在香蕉种植前施用；在香蕉种植后的生长期，可将固体菌剂与普通有机肥按1:100混匀后，每月每株埋施2.5公斤。
与现有的技术相比，本发明的有益效果为：
第一，本发明的棘孢木霉PZ6，由于该菌株本身分离自植物根际土壤，是土壤习居菌，根际定殖能力强，防治效果良好，尤其对香蕉枯萎病病原菌的拮抗能力强。
第二，本发明以棘孢木霉PZ6作为拮抗菌株，对香蕉枯萎病菌抑制作用强，对香蕉枯萎病具有良好的防治效果；本发明的制剂对香蕉根系受枯萎病菌侵染具有保护作用。
第三，本发明的棘孢木霉PZ6培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，有着良好的开发应用前景。
第四，本发明防治香蕉枯萎病的制剂，制备工艺简单，发酵培养基无需贵重原料，成本低，容易推广。
附图说明
图1是实施例1中筛选得到的棘孢木霉菌的菌落形态图。
图2是实施例1中筛选得到的棘孢木霉菌的孢子形态图。
图3是实施例1中制备的棘孢木霉PZ6菌株对香蕉枯萎病FOC4的拮抗作用效果图，其中，A为香蕉枯萎病菌4号生理小种中加入棘孢木霉菌PZ6菌株的抑菌效果图，B为香蕉枯萎病菌4号生理小种的空白样图。
图4是实施例1中制备的棘孢木霉菌PZ6菌株抑制的指示菌香蕉枯萎病菌4号生理小种菌丝图，图中，A为菌丝断裂、消融图，B为缢缩，C是缠绕(×1.50k)。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
实施例1
本实施例中的生棘孢木霉PZ6是从广西钦州市浦北县大成镇香蕉园土壤中筛选分离到的一株木霉菌，该菌株对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)具有强烈的抑制作用，于2016年1月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M2016043，经鉴定命名为棘孢木霉PZ6(Trichoderma asperellum PZ6)。
菌株PZ6的分离筛选过程如下：
将采集到的根际土壤称取10g，用无菌水稀释适当倍数后涂布于孟加拉红培养基上，28℃培养5天左右，待筛选平板上长出真菌后，再于平板上适当位置接入1个或多个指示菌香蕉枯萎病菌菌饼，当某个真菌具有拮抗作用时，指示菌便不能越过此真菌生长，呈现明显的拮抗带，挑取具有拮抗作用的真菌，以“孢子稀释法”进行分离纯化培养。待纯化出菌株后，再进行平板对峙实验，选择具有拮抗作用的真菌作为候选菌株，对候选菌株进行液体发酵后，再于香蕉室内盆栽接菌试验考察其室内防效，并进一步对该菌株的田间防效进行试验，由此筛选出田间防治效果良好的拮抗菌株PZ6。
菌株PZ6的鉴定过程如下：
首先对其进行rDNA-ITS序列分析，将本菌株的rDNA-ITS序列在线提交到genebank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中进行Blast比对，发现其与棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)处于同一进化分支，同源性达99％以上，本菌株的rDNA-ITS部分基因序列593bp，其核苷酸序列SEQ ID NO:1所示。
然后对PZ6菌株进行形态学特征、培养特性和生理生化特性分析鉴定，经分析其形态特征是：菌落形成同心环，在同心环上产生稠密的分生孢子，接近中央的分生孢子暗绿色，边缘的分生孢子才刚刚形成，气生菌丝缺。分生孢子梗形成垫状至半球形丛束，散布在整个菌落或聚集成2～3个同心圆环，暗绿色。菌落背面不变色。分生孢子梗细长、弯曲，次级分枝对生。瓶梗安瓶形，3个或更多个一组轮生。分生孢子球形、近球形，如图1和图2所示。
其培养特征是：在PDA上白色匍匐菌丝生长迅速，气生菌丝不发达，2-3d后即长出绿色的分生孢子，孢子呈同心环排列，接近中央的分生孢子暗绿色，边缘的分生孢子才刚刚形成，偏淡绿色；其生理生化特征是：能利用的N源有硝酸盐、硫酸盐、尿素等，能利用果糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖，具有促进孢子萌发的作用，无糖条件下不产孢。结果表明：本菌株的形态学特征和培养特征与棘孢木霉菌完全相同，生理生化特性绝大部分和棘孢木霉菌相同。因此，综合rDNA-ITS序列的比对结果、形态学特征、培养特征和生理生化特性分析的结果，将PZ6菌株鉴定为棘孢木霉菌，命名为棘孢木霉PZ6菌株(Trichoderma asperellumPZ6)。
该菌株抑菌作用强，在室内平板对峙培养实验中平均抑菌作用达到96.16％，实施例1中制备的棘孢木霉菌PZ6菌株对香蕉枯萎病FOC4的拮抗作用的抑菌效果图对比图如图3所示，由图3中A和B对比可见，棘孢木霉菌PZ6菌株的抑菌作用强。如图4所示，被抑制的指示菌香蕉枯萎病菌4号生理小种菌丝出现缠绕、消融、断裂、溢缩等现象，说明该菌株对病原菌菌丝具杀死作用。
实施例2
固体菌剂及其制备方法。
本实施例提供的含有上述棘孢木霉PZ6的固体菌剂通过如下方法制备获得：
(1)菌株活化：将棘孢木霉PZ6接种到PDA固体培养基上，培养3——4d。
(2)种子培养：将活化菌株接种到液体培养基，配方为：葡萄糖1％，马铃薯汁2％，按质量百分含量计，其余为水；pH值为自然状态；在28℃下三角瓶120rpm摇瓶发酵培养72小时。
(3)固体培养：将种子培养液与固体培养基混合，固体培养基配方为：麦麸90％，玉米粉8～9％，1～2％米糠，按质量百分含量计。本实施例中采用的为较佳的培养基，其它培养基也可以，并无特别的限制；28℃—30℃培养时间5天左右，此时固体培养基应充分生长且大量产孢。
菌剂制备：将已充分发酵的固体培养物与滤泥、米糠、桐麸、草炭土、花生壳(打粉)、烟梗(打粉)、草木灰等植物残渣按任意比例混合，干燥后粉碎，即制成固体菌剂。
实施例3
固体菌剂对香蕉枯萎病田间防治效果：
试验用菌剂：实施例2中制备的棘孢木霉PZ6固体菌剂，清水对照。
试验地点：广西南宁市武鸣区伏塘新村香蕉枯萎病基地。
供试香蕉品种：感枯萎病品种“桂蕉1号”。
施药方法：
定植穴预处理：固体菌剂每个定植穴用5公斤，与穴内土壤充分拌匀，其他种植要求按常规管理进行。
定植：于2月初定植。
管理：定期施肥，每月用固体菌剂按每穴2.5公斤使用。10月下旬调查并记录植株病情指数、发病率，并计算防治效果。
发病率％＝发病株数×100/调查总株数
病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/调查总株数×最高级值
防治效果％＝(对照病情指数-处理病情指数)×100/对照病情指数
香蕉枯萎病病情调查分级标准：0级外观无症状，解剖假茎维管束组织未见变褐；1级外观无可见症状，解剖假茎维管束组织变褐，2级叶片黄化或倒垂；3级假茎基部开裂，但病株尚未枯死；4级病株枯死。
试验结果：
对照区在香蕉苗定植后120天后开始出现香蕉枯萎病症状，经棘孢木霉固体菌剂处理的香蕉在处理180天后才有个别植株基部叶片表现轻度黄叶症状，防治效果如表1所示；9个月后的防效效果为78.38％，表明对香蕉枯萎病的具有较好的防治效果。
表1棘孢木霉PZ6固体菌剂对香蕉枯萎病的防治效果对比表
处理 发病率(％) 病情指数 防治效果
CK 66.67 0.62 ——
固体菌剂 26.67 0.13 78.38
本发明的优点是发酵生长快，孢子量大，培育周期短等，实施例1的棘孢木霉在PDA培养基于28±2℃下培养3天，菌落直径达到7.97cm，孢子量即达到6.18×107个。将培养3天的2100ml发酵液加入到7500g固体培养基中，在30℃条件下培养7天后，取0.28g固体培养基，加无菌水100ml，采用梯度稀释法检测。结果显示，每克固体培养基中含棘孢木霉孢子数为6.51×108个。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种拮抗香蕉枯萎病的棘孢木霉菌，其特征在于：所述拮抗香蕉枯萎病的棘孢木霉菌为棘孢木霉PZ6，所述棘孢木霉PZ6已于2016年1月18保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2016043，地址：中国，武汉，武汉大学。
2.根据权利要求1所述的拮抗香蕉枯萎病的棘孢木霉菌，其特征在于：所述棘孢木霉PZ6的rDNA-ITS核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1或2所述的拮抗香蕉枯萎病的棘孢木霉菌的应用，其特征在于：应用在防治香蕉枯萎病中。
4.一种防治香蕉枯萎病的制剂，其特征在于：其包括权利要求1或2所述拮抗香蕉枯萎病的棘孢木霉菌的固体菌剂。
5.权利要求4所述的防治香蕉枯萎病的制剂，其特征在于：其为将所述棘孢木霉PZ6经菌种活化、固体发酵工序制备获得的固体菌剂。
6.权利要求5所述的防治香蕉枯萎病的制剂，其特征在于：其采用以下步骤制备得到：
步骤S1：将所述棘孢木霉PZ6活化，得到菌种；
步骤S2：将固体培养基质发酵，得到发酵饼；
步骤S3：将所述发酵饼干燥粉碎，与吸附载体混合，干燥，制成固体菌剂。
7.权利要求6所述的防治香蕉枯萎病的制剂，其特征在于：步骤S1还包括菌种培养。
8.权利要求6所述的防治香蕉枯萎病的制剂，其特征在于：所述吸附载体为椰糠、米糠、花生麸、麦麸、玉米粉中的至少一种。
9.权利要求6所述的防治香蕉枯萎病的制剂，其特征在于：所述固体培养基质包括的组分及其质量百分比为：麦麸90%，玉米粉8～9%，1～2%米糠。
10.权利要求4~9任意一项所述的防治香蕉枯萎病的制剂在防治香蕉枯萎病中的应用。
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