CN102067885A - 一种木霉孢子粉剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种木霉孢子粉剂及其制备方法和应用。本发明木霉孢子粉剂包含木霉孢子粉和助干剂，其中，木霉孢子粉是棘孢木霉菌株T₁(Trichodermaasperellum T₁，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：3531)的孢子粉，其rDNA ITS区片段序列如SEQ ID NO：1所示，所述助干剂为β-环糊精、马铃薯淀粉、可溶性淀粉中的一种或几种的混合物。本发明木霉孢子粉剂可以对香蕉枯萎病起到有效防治的效果，还可以拮抗多种病原真菌，尤其对土传真菌有显著的拮抗效果。本发明制备方法节省了木霉孢子粉剂的制备时间，得到的木霉孢子粉剂密度大、萌发率高，干燥效率高，便于贮藏、运输和使用。

Description

一种木霉孢子粉剂及其制备方法和应用 

技术领域

本发明涉及微生物活性农药粉剂，具体涉及一种木霉孢子粉剂及其制备方法和应用。 

背景技术

木霉菌隶属于半知菌亚门，丛梗目，从梗孢科，是一类具有重要经济意义的生防益菌。木霉菌对环境的适应性强、生长速度远比病原真菌快、是土壤中植物病原真菌生存空间和营养源的有力竞争者。木霉菌能有效地利用植物表面或植物病原真菌侵入点附近低浓度营养物质迅速占领空间吸收营养使植物病原真菌无法入侵。近年来人为向土壤中引入木霉菌防治植物病害的研究较为活跃，例如用哈茨木霉、哈氏木霉和绿色木霉防治洋葱白腐病、棉花和黄瓜黄萎病、人参根腐病、茉莉白绢病、西洋参立枯病及多种作物的猝倒病和疫病，均取得较为理想的防治效果。不同种类木霉菌有不同的植物病害防治功效，但目前尚未有将木霉菌用于防治香蕉枯萎病的技术记载。 

木霉菌经固体发酵后可产生大量的孢子，人们通常将大量的木霉菌孢子制成木霉孢子粉剂以便于对其进行贮藏、运输和施用。目前常用的木霉孢子粉剂制备方法是用水将木霉孢子从固体培养基上洗脱下来制成孢子悬浮液，在孢子悬浮液中加入适量吸水剂后将其在室内晾干或用低于50℃的温度风干制成木霉孢子粉剂。但这种制备方法加工时间长、效率低、体积大且晾干或风干后的木霉孢子粉剂中木霉孢子的密度较低，不便于贮藏、运输和施用。喷雾干燥技术是指采用雾化法将原料液分散为雾滴并用热气体干燥雾滴而获得干粉产品 的一种干燥方法。由于成本低、易于推广、采用的设备简单且有利于干粉产品的大规模连续生产，喷雾干燥技术在食品、化工、医药、环保等领域的运用颇为广泛。鉴于喷雾干燥技术的诸多优点，人们曾试图将喷雾干燥技术应用到微生物活性农药制备领域，借以解决微生物粉剂难以在保持高活性的前提下快速制备的难题。但喷雾干燥技术的温度参数通常在140℃以上，在此高温条件下微生物容易失去活性。如木霉孢子在超过45℃的温度条件下容易失活，孢子悬浮液中的木霉孢子通过高温高压喷嘴喷出后基本丧失萌发能力。因为人们尚未找到如何在干燥喷雾技术的高温条件下保持微生物活性的解决方案，到目前为止喷雾干燥技术在微生物活性农药制备领域尚未被合理应用。 

发明内容

本发明目的在于根据现有木霉孢子及其制备方法中存在的不足，将喷雾干燥技术合理用于微生物活性农药制备，提供一种粉剂密度大，萌发率高，干燥效率高的木霉孢子粉剂。 

本发明另一目的在于提供上述木霉孢子粉剂的制备方法。 

本发明还有一个目的在于提供上述木霉孢子粉剂的应用。 

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现： 

一种木霉孢子粉剂，包含木霉孢子粉和助干剂，其中，木霉孢子粉是棘孢木霉菌株T₁(Trichoderma asperellum T₁，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO：3531，保藏日期为2009年12月17日)的孢子粉，其rDNA ITS区片段序列如SEQ ID NO：1所示。 

本发明木霉孢子粉是具有萌发活性的孢子粉，其rDNA ITS区片段序列可以通过PCR扩增得到，扩增引物序列如SEQ ID NO：2～3所示，PCR反应体系 为ddH₂O 14.8μL，10×PCR buffer(with Mg²⁺)2.5μL，dNTPs(10mM each)0.5μL上游引物(5μM)3.0μL，下游引物(5μM)3.0μL，模板DNA 1.0μL，Taq酶0.2μL。PCR反应条件为：(1)94℃，5min，热变性；(2)94℃，45s，热变性；(3)55℃，45s，退火；(4)72℃，45s，延伸；(5)72℃，10min，延伸；其中(2)、(3)、(4)是循环。 

扩增出的序列如SEQ ID NO：1所示。 

上述木霉孢子粉剂中，所述助干剂为β-环糊精、马铃薯淀粉、可溶性淀粉中的一种或几种的混合物。 

本发明木霉孢子粉剂的制备方法包括如下步骤： 

(1)将棘孢木霉菌株T₁植于PDA培养基上使其复苏，再采用酵母膏蔗糖培养基进行菌种继代培养，待长出直径为5～7mm的深绿色菌落后，将菌落接种，在酵母膏蔗糖培养基和麸皮木屑培养物中进行扩大培养，直至长出白色菌丝或绿色孢子； 

(2)将白色菌丝或绿色孢子制成孢子悬浮液，过滤沉淀为浓缩孢子液； 

(3)向浓缩孢子液中添加助干剂，每升孢子液中加入助干剂的质量为50g，一边搅拌一边喷雾干燥，即得木霉孢子粉剂。 

上述制备方法中，所述酵母膏蔗糖培养基的最佳配方为：酵母膏15g，蔗糖20g，KH₂PO₄1g，麦芽膏15g，硫酸钠2g，氯化钾0.5g，维生素B0.5mg，维生素C0.5mg，七水合硫酸镁0.05g，硫酸铁0.01g，琼脂20g，水1L。 

上述酵母膏蔗糖培养基优选高温灭菌过的培养基，灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min。 

所述菌种继代培养的温度优选为30℃，湿度为70～85％，培养时间为 48～72h。 

所述扩大培养的温度优选为30℃，湿度为70～85％，培养时间为5～7d。 

所述麸皮木屑培养物是麸皮、木屑、蔗糖、维生素B和水的混合物，其中，麸皮、木屑、蔗糖三者的质量与水的体积比为2∶1∶0.02，维生素B用量为每千克麸皮木屑培养物中加入0.5mg。 

步骤(3)所述喷雾干燥是将浓缩孢子液添加助干剂后在磁力搅拌器上一边搅拌一边进行喷雾干燥，在90～130℃范围内设定进风温度、出风温度在41～55℃，控制进料量为1～20wt％。作为一种优选方案，喷雾干燥过程中进风温度为110℃，出风温度为53℃，进料量为10wt％。 

由于木霉菌对环境的适应性强且生长速度远比病原真菌快，能对病原真菌产生营养或空间的竞争，能有效利用植物表面的病原真菌侵入点附近的低浓度营养物质迅速生长占领空间消耗掉营养物质，从而抑制了病原真菌的生长和对寄主植物的入侵，达到对植物病害的防治效果。本发明木霉孢子粉剂作为微生物活性农药，不仅能有效防治香蕉枯萎病，还因为棘孢木霉菌株T₁具有广谱性拮抗能力，能拮抗多种病原真菌，防治其他多种植物病害。 

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 

(1)本发明采用棘孢木霉菌株T₁作为生产菌株，其孢子粉生存能力强，适应性广，具有广谱性拮抗能力，除了能对香蕉枯萎病起到有效防治，还能够拮抗多种病原真菌，尤其对土传真菌有显著的拮抗效果； 

(2)本发明将喷雾干燥技术合理用于微生物活性农药木霉孢子粉剂的制备中，解决了干燥喷雾技术的高温条件下难以保持微生物活性的技术难题，使得微生物粉剂可以在保持高活性的前提下快速制备，制备工艺简单易行，采用 的设备简单，有助于降低干粉产品的制备成本，易于推广，有利于干粉产品的大规模连续生产，节省了孢子粉剂的制备时间； 

(3)本发明木霉孢子粉剂木霉孢子密度大，萌发率高，干燥效率高，贮藏空间小，方便人们对其进行贮藏、运输和使用。 

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。 

实施例1 

1.菌株的复苏和扩大培养 

(1)将冷藏的棘孢木霉菌株T1(Trichoderma asperellum T₁)植于PDA培养基上使其复苏； 

(2)采用酵母膏蔗糖培养基，并设定培养温度为30℃、湿度为70～85％，对经过步骤(1)复苏后的菌株采用平板进行菌种继代培养48～72h，直至长出直径约为5～7mm的深绿色菌落； 

(3)将由步骤(2)平板继代培养成的菌落用无菌水洗下，接种于装有经高温灭菌的由麸皮、木屑、蔗糖、维生素B和水组成的培养料的茄形瓶中进行孢子扩大培养，设定培养温度为30℃、湿度为70～85％，培养时间为5～7d，每天翻动拍打茄形瓶，至培养物上长出白色菌丝并在其上长出绿色孢子。 

2.分离洗涤 

用无菌水将茄形瓶中的菌丝和孢子洗下制成孢子悬浮液，再将孢子悬浮液经过滤处理后沉淀为浓缩孢子液，然后将浓缩孢子液装瓶在4～10℃的温度条件下贮藏。 

3.喷雾干燥 

向浓缩孢子液中添加助干剂后在磁力搅拌器上一边搅拌一边进行喷雾干燥，设定干燥器进风温度为110℃、出风温度为53℃，进料量为10wt％。 

其中酵母膏蔗糖培养基的主要配方：酵母膏15g，蔗糖20g，KH₂PO₄ 1g，麦芽膏15g，硫酸钠2g，氯化钾0.5g，维生素B0.5mg，维生素C0.5mg，七水合硫酸镁0.05g，硫酸铁0.01g，琼脂20g，水1000ml。麸皮木屑培养料的每瓶装瓶量为15g，每瓶加水量5ml，其中麸皮、木屑、蔗糖干重比为2∶1∶0.02，维生素B用量为每千克麸皮木屑培养物中含0.5mg。助干剂为β-环糊精，含量：50g/L孢子悬浮液。用于酵母膏蔗糖培养基和麸皮木屑培养物灭菌的温度为121℃，灭菌时间为30min。 

实施例2 

以下进一步说明进风温度、进料量、助干剂类型、助干剂含量等参数的变化对木霉孢子粉剂制备的影响。 

以萌发率为指标对喷雾干燥的进风温度和进料量做单因素分析，制备过程中变化进风温度、进料量测得不同进风温度、进料量对所制备孢子粉的影响，从而对比并选择利于保证孢子高萌发率、干燥效果好的进风温度和进料量范围。在进料量为5wt％时，设定90℃，100℃，110℃、120℃和130℃等五个进风温度，测定各温度所制备的孢子粉的萌发率并记录干燥效果；在进风温度为120℃时，设定1wt％、5wt％、10wt％、15wt％和20wt％等五个进料量，测定各进料量所制备的孢子粉的萌发率并记录干燥效果；测得结果如表1、2： 

表1  进风温度对萌发率和干燥效果的影响 

注： 

表2  进料量对萌发率和干燥效果的影响 

注： 

结果表明，当进料量不变时，进风温度越高对木霉孢子萌发的影响越大。在进风温度为110℃时，孢子萌发率在30～33％之间，而进风温度为110～130℃时孢子萌发率急剧下降，最低仅为2.99％。当在进风温度低于110℃时出风口温度低于41℃，此时集粉瓶中会鼓入大量水汽，使干燥难以顺利进行，收集到的产品呈糊状；只有将进风温度调高至110℃以上，出风口温度才能满足成粉要求。当进风温度不变时木霉孢子的萌发率是随进料量增大而增大的，但并不呈现线性关系。当进料量在1～15％时，单位时间进入干燥室的孢子液体积小，平均受热大，因此干燥所得孢子的萌发率不足14％；而当进料量增大至20％时，萌发率提高到25％。进风温度一定的情况下，增加进料量可以降低出风口的温度，可在一定程度上降低高温给孢子带来的损伤。但进料量过大，则会使进料变得困难，甚至使喷出的液滴难以完全蒸发或造成粘壁现象，影响干燥效果，这是因为随着进料量的增加单位时间内悬浊液转化为粉剂需要的热量越多，在单位时间供热量不变的情况下，进料量越大干燥效率越低。 

实施例3 

以助干剂种类、助干剂含量、进风温度和进料量为四个影响因素设计L9(3⁴)正交试验，以产品的萌发率、收集率、集粉率和活孢含量为评价指标，选择合适的制备工艺。本试验以助干剂(A)、助干剂含量(B)、进风温度(C)和进料量(D)4个因素设计L9(3⁴)正交试验，如表3、4所示： 

表3  孢子粉剂配方优化正交试验因素水平表 

表4  孢子粉剂配方工艺正交试验结果 

注： 

由表4可见，在A¹B¹C¹D²配方工艺下，即5wt％的β-环糊精、进风温度为110℃、进料量为10wt％，产品中活孢含量最高。通过比较指标的极差(R)，影响活孢含量因素的主次顺序为A＞C＞D＞B，即助干剂种类是主要影响因素，其次的顺序为进风温度、进料量、助干剂含量。集粉率充分反映干燥过程中的粘壁程度，通过直观分析最佳组合A¹B²C³D¹，即10wt％的β-环糊精、进风温度为130℃、进料量为5wt％时，干燥情况良好产率高。通过比较指标的极差(R)，影响集粉率因素的主次顺序为D＞A＞C＞B，即进料量是主要因素，其次的顺序为助干剂种类、进风温度、助干剂含量。 

上述仅为本发明优选实施例，这些实施例仅仅用于解释本发明而不能理解为对本发明的限制，在不背离本发明权利要求中所请求保护的范围的情况下，可以对上述实施方案进行各种改进和变化。 

实施例4  木霉菌株与FOC的拮抗试验 

分别将斜面中保存的香蕉枯萎病菌和木霉菌接种于PDA平板上培养(木霉培养2天，镰刀菌培养7天)，待木霉菌产孢后，轻轻刮去木霉孢子，将木霉菌孢子配成10²/ml、10⁵/ml、10⁸/ml的孢子悬浮液，各取1ml孢子悬浮液加入含有未凝固的PDA培养基的培养皿中摇匀，将培养后的镰刀菌用打孔器打取菌饼(d＝0.70cm)置于培养皿中央，每种木霉菌株设二十个重复，28℃黑暗培养，以只有镰刀菌的平板作对照，计算木霉菌对镰刀菌菌株生长的抑制率。 

(公式1) 

平板对峙实验结果： 

通过邓肯多重比较法对数据进行统计分析，在1％显著水平上T1和T068的10⁸个/皿孢子浓度时，与其它处理相比对镰刀菌拮抗效果较好，抑菌率达到80％。孢子浓度高低对拮抗效果影响很大，为10⁸＞10⁵＞10²；同等孢子浓度下木霉各菌株之间一定差异；从抑制百分率看，高浓度时T1、T3菌株效果最好，而低浓度时T1、T2菌株效果较好。 

表5  木霉菌株不同孢子浓度对香蕉枯萎病镰刀菌的平板抑制试验结果 

注：小写字母表示显著水平a＝0.05，大写字母表示显著水平a＝0.01. 

实施例5  木霉次生代谢物对香蕉枯萎病菌的抑制作用 

将菌株转移PDA平板上活化一天，用挑针挑取木霉菌落边缘菌丝接种到含有200ml液体发酵培养基的三角瓶中，各设五个重复，发酵7天。7天后滤去菌丝，将发酵液在4℃下，12000r/min离心30min；将上清液用装有0.22μm滤膜的细菌滤器过滤，得到无菌滤液；然后用旋转蒸发仪55℃低压浓缩得1/10体积发酵液；分别取1ml和0.5ml浓缩发酵液，混匀到融化后的PDA培养基中，以香蕉枯萎病菌做抑制对象。灭菌水处理为对照，每处理重复5次，测量菌落直径，按公式1计算抑菌率。 

木霉次生代谢产物抑菌试验结果： 

供试菌落生长情况表明木霉T1菌株的发酵液对镰刀菌的生长有明显的抑制作用，加入1ml发酵液的抑菌效果明显好于加入0.5ml发酵液的抑菌效果。 

表6  T1菌株10倍发酵液抑菌比较 

实施例6  盆栽接种试验 

1木霉生防菌的扩大培养 

将供试木霉菌株，接种到PDA培养基上，28℃，日光灯下培养7d，待产生绿色孢子后用无菌水洗脱配成1x10⁷个/ml的接种液，用喷壶喷入0.5kg棉籽壳麦麸培养基袋中(棉籽壳80wt％，麦麸20wt％)，25℃黑暗培养25～30d， 至袋中央的培养基产生大量分生孢子时施用。 

2 盆栽接种试验方法 

将产生较多孢子后的培养基掺合自然土，按1∶1的比例混合均匀，移入灭菌消毒的80×50cm的泡沫箱中，将无毒巴西蕉(cv.Cavendish)组培苗移栽到泡沫箱中定植，设两个加无菌棉籽壳麦麸培养基作对照组，对照组I接种香蕉枯萎病菌，对照组II不接种香蕉枯萎病。每月取土样检查木霉在土壤中的定植情况，待香蕉苗生长正常后，刮取培养七天的香蕉镰刀菌枯萎病菌孢子配制成浓度为1x10⁷个/ml的接种液备用。接种采用伤根接种法，植株自然情况下大棚内培养五个月，每个处理设8株香蕉苗，整个试验设三个重复。 

3 实验结果调查方法 

病情指数标准如下：0级，无病症；1级，剖检球茎内有零星黑褐色斑点；2级，剖检球茎内变褐坏死小于1/3；3级，剖检假球茎内变褐坏死1/3-1/2；4级，剖检假球茎变褐坏死大于1/2小于2/3；5级，球茎内2/3以上坏死或整株枯死。通过受害植株的病情指数计算防效，按下面公式计算病情指数和防效： 

盆栽接种试验结果： 

表3为盆栽防治试验数据统计结果，其中防效按病情指数计算得出。从表3中可以看出，防治效最高的为木霉T1菌株，防效达65.67％，其次为T3菌株，防效均在59.60％，最差的为T2菌株，防效低于50％。发病率最低的为T3处理组，发病率为66.67％，对照组全部发病，病情指数高达82.5。 

表7 盆栽接种试验结果 

SEQUENCE LISTING

<110>惠州市南天生物科技有限公司

     华南农业大学

     广东省植物保护总站

 

<120>一种木霉孢子粉剂及其制备方法和应用

 

<130>

 

<160>3

 

<170>PatentIn version 3.2

 

<210>1

<211>1092

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>1

cggagggatc attaccgagt ttacaactcc caaacccaat gtgaacgtta ccaaactgtt  60

gcctcggcgg ggtcacgccc cgggtgcgtc gcagccccgg aaccaggcgc ccgccggagg  120

aaccaaccaa actctttctg tagtcccctc gcggacgtat ttcttacagc tctgagcaaa  180

aattcaaaat gaatcaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa  240

cgcagcgaaa tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga  300

acgcacattg cgcccgccag tattctggcg ggcatgcctg tccgagcgtc atttcaaccc  360

tcgaacccct ccgggggatc ggcgttgggg atcgggaccc ctcacacggg tgccggcccc  420

gaaatacagt ggcggtctcg ccgcagcctc tcctgcgcag tagtttgcac aactcgcacc  480

gggagcgcgg cgcgtccacg tccgtaaaac acccaacttt ctgaaatgtt gacctcggat  540

caggtacgga gggatcatta ccgagtttac aactcccaaa cccaatgtga acgttaccaa  600

actgttgcct cggcggggtc acgccccggg tgcgtcgcag ccccggaacc aggcgcccgc  660

cggaggaacc aaccaaactc tttctgtagt cccctcgcgg acgtatttct tacagctctg  720

agcaaaaatt caaaatgaat caaaactttc aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat   780

gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat   840

ctttgaacgc acattgcgcc cgccagtatt ctggcgggca tgcctgtccg agcgtcattt   900

caaccctcga acccctccgg gggatcggcg ttggggatcg ggacccctca cacgggtgcc   960

ggccccgaaa tacagtggcg gtctcgccgc agcctctcct gcgcagtagt ttgcacaact   1020

cgcaccggga gcgcggcgcg tccacgtccg taaaacaccc aactttctga aatgttgacc   1080

tcggatcagg ta                                                       1092

 

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>2

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg                                            22

 

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

 

<400>3

tcctccgctt attgatatgc                                               20

Claims (10)

1.一种木霉孢子粉剂，其特征在于包含木霉孢子粉和助干剂，其中，木霉孢子粉是棘孢木霉菌株T₁(Trichoderma asperellum T₁，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：3531)的孢子粉，其rDNA ITS区片段序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的木霉孢子粉剂，其特征在于所述助干剂为β-环糊精、马铃薯淀粉、可溶性淀粉中的一种或几种的混合物。

3.权利要求1或2所述木霉孢子粉剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将棘孢木霉菌株T₁植于PDA培养基上使其复苏，再采用酵母膏蔗糖培养基进行菌种继代培养，待长出直径为5～7mm的深绿色菌落后，将菌落接种，在酵母膏蔗糖培养基和麸皮木屑培养物中进行扩大培养，直至长出白色菌丝或绿色孢子；

(2)将白色菌丝或绿色孢子制成孢子悬浮液，过滤沉淀为浓缩孢子液；

(3)向浓缩孢子液中添加助干剂，每升孢子液中加入助干剂的质量为50g，一边搅拌一边喷雾干燥，即得木霉孢子粉剂。

4.根据权利要求3所述木霉孢子粉剂的制备方法，其特征在于步骤(1)中所述酵母膏蔗糖培养基的配方为：酵母膏15g，蔗糖20g，KH₂PO₄1g，麦芽膏15g，硫酸钠2g，氯化钾0.5g，维生素B0.5mg，维生素C0.5mg，七水合硫酸镁0.05g，硫酸铁0.01g，琼脂20g，水1L。

5.根据权利要求4所述木霉孢子粉剂的制备方法，其特征在于所述酵母膏蔗糖培养基为高温灭菌过的培养基，灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min。

6.根据权利要求3所述木霉孢子粉剂的制备方法，其特征在于步骤(1)中 所述菌种继代培养的温度为30℃，湿度为70～85％，培养时间为48～72h；所述扩大培养的温度为30℃，湿度为70～85％，培养时间为5～7d。

7.根据权利要求3所述木霉孢子粉剂的制备方法，其特征在于所述麸皮木屑培养物是麸皮、木屑、蔗糖、维生素B和水的混合物，其中，麸皮、木屑、蔗糖三者的质量与水的体积比为2∶1∶0.02，维生素B用量为每千克麸皮木屑培养物中加入0.5mg。

8.根据权利要求3所述木霉孢子粉剂的制备方法，其特征在于步骤(3)所述喷雾干燥的进风温度为110℃，出风温度为53℃，进料量为10wt％。

9.权利要求1或2所述木霉孢子粉剂的应用，其特征在于所述木霉孢子粉剂用于拮抗病原真菌。

10.根据权利要求1或2所述木霉孢子粉剂的应用，其特征在于所述木霉孢子粉剂用于防治香蕉枯萎病。