CN103045483B

CN103045483B - 一种棘孢木霉菌株

Info

Publication number: CN103045483B
Application number: CN201110306017.6A
Authority: CN
Inventors: 张钰; 王承芳; 旷文丰; 干华磊; 陈娟; 毛伟力
Original assignee: SHANGHAI WANLIHUA BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI WANLIHUA BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2011-10-11
Filing date: 2011-10-11
Publication date: 2014-09-10
Anticipated expiration: 2031-10-11
Also published as: CN103045483A

Abstract

一种棘孢木霉菌株（Trichodermaasperellum），保藏号为CGMCCNo.5201。

Description

一种棘孢木霉菌株

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种具对葡萄灰霉病有高拮抗木霉菌株。

背景技术

葡萄灰霉病主要危害花序、幼果和将要成熟的果实，也可侵染果梗、新梢与幼嫩叶片。葡萄灰霉病是由半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、葡萄孢属Botrytiscinerea pers.ex Fr.侵染引起的。该病原菌是一种寄主非常广泛的兼性寄生真菌，它可寄生多种水果、蔬菜与花卉，因此该病菌的侵染原十分广泛。

对于该病，常规手段是采用喷洒灭虫剂来防治葡萄灰霉病。在中国专利CN101543217中披露了将含有嘧菌环胺和戊唑醇的杀菌组合物用来防治葡萄灰霉病，中国专利CN101731245提供了一种含有嘧菌环胺和戊唑醇的杀菌组合物用于防治该病，中国专利CN101779638提供一种含有嘧霉胺和乙烯菌核利的杀菌剂用于治疗该病。此外，中国专利CN1730455和CN1730456也分别披露了利用合成的间苯三酚乙酰基衍生物用于治疗葡萄灰霉病。

在治疗葡萄灰霉病农药使用过程中常存在用量大的问题，用量少了达不到防治灰霉病的效果，长期大用量使用农药会对葡萄生长环境产生破坏影响。虽然在短时间内可以取得很好的防止葡萄灰霉病的效果，但长久来看将农药作为防治灰霉病方法将会被淘汰。

发明内容

本发明的目的在于解决目前防治葡萄灰霉病的化学农药量多且农药对环境会产生影响，提供一种产孢量多、高效防治葡萄灰霉病的木霉菌株。

本发明提供的木霉菌株属于棘孢木霉(Trichoderma asperellum)菌株，具有防治葡萄灰霉病的特性。该菌株于2011年8月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.5201。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

棘孢木霉菌株具有以下性质：

本发明棘孢木霉菌株的分生孢子阶段为半知菌门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，木霉属，其有性态是属于子囊菌门子囊菌纲。

菌株培养特性：

本发明棘孢木霉菌株在PDA培养基上最适合的生长温度为30℃，在30℃下生长48小时形成菌落的半径约为31～47mm。菌株不产生扩散性色素，无明显气味，菌落反面为奶油色。

本发明的棘孢木霉菌株的液体培养法为，在培养瓶中加入培养液并接种孢子悬浮液，在30℃环境下振荡培养，4天后便可收获大量的孢子。在孢子中添加等体积比的硅藻土抽滤并干燥可长久保存。

本发明棘孢木霉菌落形态培养条件为在15～35℃下黑暗环境下培养7小时。在PDA培养基中，棘孢木霉菌最适合生长温度为30℃。在25℃下，菌丝生长速度最快。在PDB培养基内，在30℃的温度下，棘孢木霉菌的分生孢子产量最大。

菌株微观形态特性：

参照图1～图3，本发明棘孢木霉菌株的分生孢子簇呈棉絮状，有可见的单个的分生孢子梗分枝，至顶端可育。在分生孢子簇内，分生孢子梗上的瓶梗呈现对称分布，顶端有两个或多个瓶梗，瓶梗宽度为2.8～5.4μm，主轴顶端下面生出的初次分枝常对生，与主轴夹角近90°。随着离顶端距离的增加，初次分枝的长度也增加；二次分枝能够产生第三次分枝。瓶梗典型地产生于初次、二次、三次分枝的顶端，较少直接产生于初次和二次分枝中部，2～3个瓶梗呈旋涡状排列。瓶梗直、安瓿形，仅在中部稍微加粗，其长度为7.1～11.3μm，中部宽度为3.0～5.5μm，基部宽度为2.0～3.5μm，基部稍微有缢缩。分生孢子球形或亚球形或卵圆形，大小为3.7～6.0×3.0～5.0μm。

系统发育学鉴定：

通过PCR(Polymerase Chain Reaction，多聚酶链式反应)对本发明棘孢木霉菌株进行系统发育学的鉴定，确定棘孢木霉菌株的进化关系。

将引物ITS4和ITS5扩增到ITS1-5.8S-ITS2区序列，从而得到1158bp的序列段，通过NCBI Gen Bank建立的DNA序列数据库中数据进行比对，1158bp的序列段与棘孢木霉的相似度达到100％。

1158bp的ITS序列如下：

GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAATTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGA。

提供采用引物Ef728和Tef1αR扩增Tef1α序列到1090bp的序列段，通过NCBI Gen Bank建立的DNA序列数据库中数据进行比对，1090bp的Tef1α序列与棘孢木霉的相似度达到100％。

1090bp的Tef1α序列如下：

TTCATCATTTTTGGCACAGTCATATGCCCGACAATTCTGCTCTCAGTTTTTGTCTTTTTTTTCCAGCGTCACCCCGCTTTGCCAGTCTACCTACCCCTCCTTTGGCACAGCAAAAATTTTCTGGCTGCCCTTGTTTGGCTTTTAGTGGGGTGTCAAATTTTTTGGCAGCAACCCCGCTATCGCCACTGCACCTCTTCCATCACCCACCACATGCTATTTGCTCAATCGCGTCGTCTTTTTTTGTTCATTATGCTGATCATGCTTCAATCAATAGGAAGCCGCCGAACTCGGCAAGGGTTCCTTCAAGTATGCGTGGGTTCTTGACAAGCTCAAGGCCGAGCGTGAGCGTGGTATCACCATCGACATTGCCCTCTGGAAGTTCGAGACTCCCAAGTACTATGTCACCGTCATTGGTATGTTTTGGACTCTTCTCTCTAGCTATCGACATTCCAAGTCCGCCATTCTAACATGCTCTTCCCACAGACGCTCCCGGTCACCGTGATTTCATCAAGAACATGATCACTGGTACCTCCCAGGCTGACTGCGCTATCCTGATTATCGCTGCCGGTACTGGTGAGTTCGAGGCTGGTATCTCCAAGGATGGCCAGACCCGTGAGCACGCTCTGCTCGCC

重寄生性

木霉菌对病原菌主要通过拮抗作用、竞争作用、重寄生作用、诱导抗性和促生作用来防治灰霉病的发生。重寄生性是木霉菌对病原菌的主要作用方式，通过在棘孢木霉菌株自身产生的真菌细胞壁降解酶如几丁质酶、葡聚糖酶等，溶解病原菌细胞壁并渗透进入其细胞中形成大量的分枝和有性结构，使病原真菌生长受抑制而死亡而实现的。本发明提供的棘孢木霉菌株产生的几丁质酶活OD值为0.4100，能很好的抑制病原真菌。

本发明提供的棘孢木霉菌株可以高效抑制葡萄灰霉病的病原真菌，减少葡萄灰霉病的发生，替代化学农药用于抑制葡萄灰霉病。

附图说明

图1是本发明提供的棘孢木霉菌株在PDA培养基上25℃黑暗7d的菌落形态图。

图2是本发明提供的棘孢木霉菌株的分生孢子梗、瓶梗直、安瓿形图。

图3是本发明提供的棘孢木霉菌株的分生孢子。

具体实施方式

通过借助一下实施例将更详细说明本发明。以下实施例仅是说明性的，应该明白，本发明并不受这些实施例的限制。

菌株筛选方法

称取1g土样于10ml水中，在涡旋仪上混匀后进行梯度稀释至10^-5，取1ml加入到木霉菌选择性培养基TSM培养基的表面，均匀涂布，该培养基在25℃静置培养5-7天。根据平皿上筛选到的真菌菌落的形态、颜色、大小挑选出木霉菌菌落并转移至PDA培养基，进行纯化、培养及进一步鉴定。

TSM培养基配方(单位为g/l)：MgSO₄·7H₂O0.2g、KH₂PO₄0.9g、KCl0.15g、NH₄NO₃1.0g、葡萄糖3g、氯霉素0.25g、甲基磺0.3g、五氯硝基苯0.2g，玫瑰红0.15g、琼脂20g。

菌株培养

在每250mL三角瓶中加100mL的PDB培养液，每瓶内接种孢子悬浮液1mL。在30℃温度下、150r/min振荡下培养菌株，第5天便可收获大量的棘孢木霉菌株孢子。在孢子中添加等体积的硅藻土，抽滤粉碎干燥备用。图1和图2是棘孢木霉菌株的菌落形态图和分生孢子梗、瓶梗直、安瓿形图。

葡萄灰霉病的大田防治：

将棘孢木霉菌株制剂、施佳乐、枯草芽孢杆菌和速克灵对葡萄灰霉病进行防治，实验期间共施药3次，第一次时间为开花前一星期(2010年05月12日)；第二次时间为开花期(2010年05月20日)；第三次时间为初果期(2010年05月31日)。用背负式手动喷雾器将菌株制剂喷洒在花穗、果穗及其附近葡萄叶背面上。每个处理喷30L水，每个田间规格、品种及肥水管理等条件一致。每次施药后当天均无降雨发生，试验期间未进行任何施肥、灌溉及其他病虫害的防治。

对病害严重度分级调查。对每小区采用随机取样，每点调查20～40株。采用定株调查法在每小区调查中间2垄，从每垄的第3株开始调查20株。按以下分级标准记录发病情况、统计病情级数。病情级数如下：0级，花穗无病斑；1级，花穗初现零星小病斑病花蕾占1/4以下；2级，病斑占花穗1/2以下；3级，病斑占花穗1/2～3/4；4级，病斑占花穗3/4以上。计算相关病情指数和防效，并用邓肯氏新复极差法测定差异显著性。调查发病花穗或果穗的病级在最后一次施药后第3天，每个处理随机读取36个花穗的病指。所计算得到的指数计入下表。

表1各处理对葡萄灰霉病防治效果表

处理方式	病情指数	防效效果
			施佳乐	25.67	69.66％
棘孢木霉菌株	26.66	68.48％
			枯草芽孢杆菌	33.22	60.73％
速克灵	37.02	56.24％

空白对照

81.85

-

从上表可以看出，空白对照处理与全部药物处理之间存在显著性差异。其中棘孢木霉菌制剂和施佳乐处理的防治效果较好，枯草芽孢杆菌和速克灵的效果较差。棘孢木霉菌制剂和施佳乐使用效果相当，棘孢木霉菌制剂可以代替农药施佳乐用于葡萄灰霉病防治中。

葡萄灰霉病平皿对峙试验：

对棘孢木霉菌与葡萄灰霉病进行平板对峙试验，以测试棘孢木霉菌对葡萄灰霉病的抑菌效果。图3是棘孢木霉菌株的分生孢子。

将棘孢木霉菌和病菌菌株用打孔器打成5mm²行的菌丝饼，分别接入9cm的PDA培养基的两端，以只接种病原菌、不接种棘孢木霉菌为对照，并测量菌落直径计算抑菌率。实验结束后，计算得出对葡萄灰霉病的抑菌率为93.33％。

根据以上试验可以证明，以本发明所提供的棘孢木霉菌株可以有效抑制葡萄灰霉病的发生，可以作为目前常用农药施佳乐的替代物，对环境不会造成影响。

本发明所述棘孢木霉菌株(Trichoderma asperellum)，于2011年8月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.5201，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims

1.一种棘孢木霉菌株（Trichoderma asperellum），该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5201。

2.一种如权利要求1所述的棘孢木霉菌株在防治葡萄灰霉病中的应用。