CN110982709B

CN110982709B - 一种能够抑制柑橘黑点病菌生长的棘孢木霉菌及其应用

Info

Publication number: CN110982709B
Application number: CN201911357768.3A
Authority: CN
Inventors: 王洪凯; 李红叶; 林福呈; 王秀青
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN110982709A

Abstract

本发明公开了一种能够抑制柑橘黑点病菌生长的棘孢木霉菌及其应用。本发明经筛选分离到一株棘孢木霉菌，命名为Trichoderma sp.，株号A94，保藏号为CCTCC NO：M2019869。菌株A94可以高效分泌木质素酶，对植物木质素有很好的降解作用，对柑橘黑点病菌有高效的寄生作用，同时还耐盐。不但要对病原菌具有抑制、寄生分解作用的，同时还对植物残体有强烈的分解作用，将极大减少柑橘黑点病的侵染来源，大大提高防治效果。

Description

一种能够抑制柑橘黑点病菌生长的棘孢木霉菌及其应用

技术领域

本发明涉及植物病原菌防治技术领域，特别是涉及一种能够抑制柑橘黑点病菌生长的棘孢木霉菌及其应用。

背景技术

柑橘是重要的水果，有许多病原菌为害柑橘，对柑橘的安全生产带领巨大威胁。其中柑橘黑点病菌是柑橘上的重要病原物，引起柑橘黑点病。柑橘黑点病菌可以侵染柑橘的叶片、新梢、枝干和果实。新梢感病造成树势减弱，新梢死亡；叶片感病影响光合作用；果实感病，在果面形成密集的小黑点，严重影响外观品质，是果实的商品价值大大降低，造成严重的经济损失。柑橘黑点病菌也可以在植物组织残体上进行腐生生长，并大量形成子实体。但柑橘黑点病菌在活体组织中，难以形成子实体，其子囊孢子和分上孢子都是在死亡的枝干上，其中果园中带有病菌的死亡枝干是柑橘黑点病主要的侵染来源。

公开号为CN109221152A的发明公开了一种氟唑菌酰胺和噻菌铜的杀菌农药组合物，含有活性成分氟唑菌酰胺和噻菌铜，其二者的重量比为1:49～49:1。将该组合物制备成各种农药制剂，可用于防治果树、林木、蔬菜、粮食作物等农林作物的各种细菌和真菌性病害。

文献(陈国庆等，防治柑橘黑点病药剂的离体和田间筛选，《浙江大学学报(农业与生命科学版)》2010年04期)公开了在实验室条件下比较了戊唑醇、苯醚甲环唑、咪鲜胺锰盐3种麦角甾醇合成抑制剂类杀菌剂和代森锰锌对黑点病菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制效果。结果表明：4种药剂抑制黑点病菌菌丝生长的有效中浓度(EC50)依次为0.250，0.497，0.113和1.800μg·mL-1；抑制该病原菌孢子萌发的EC50依次为72.893，42.746，20.701和0.970μg·mL-1。药剂田间防效试验表明：代森锰锌可湿性粉剂600倍稀释液使用5次和3次对黑点病的防治效果分别达79.1％和63.6％，明显优于同样次数和推荐剂量的杀菌剂戊唑醇、苯醚甲环唑和咪鲜胺锰盐。因此，可以认为在这4种药剂中代森锰锌是防治柑橘黑点病的最佳药剂。

在生产过程中，传统的农药防治往往污染环境，在柑橘果实中还有农药残留，危害人体健康。筛选有益真菌进行生物防治，是提高柑橘安全生产的重要方法。针对柑橘黑点病的侵染来源主要是带菌的死亡病残体这个特点，生物防治应该以降解死亡枝叶残体为主要处理方式。因此筛选的有益真菌不但要对病原菌具有抑制、寄生分解作用的，同时还要对植物残体有强烈的分解作用，将极大减少柑橘黑点病的侵染来源，大大提高防治效果。

发明内容

本申请筛选到了一株可以分泌高效的木质素酶，对植物木质素有很好的降解作用，对柑橘黑点病菌有高效的寄生作用，同时还耐盐的棘孢木霉菌(Trichodermaasperellum)。

一种能够抑制柑橘黑点病菌生长的棘孢木霉菌，命名为Trichoderma sp.，株号A94，保藏号为CCTCC NO：M2019869。本申请菌株A94是从浙江省宁波市宁海县(北纬29.9031度，东经121.9037度)的海水土壤中分离。通过多个序列比较，A94菌株与棘孢木霉(Trichoderma asperellum)序列最接近，亲缘关系最近，此结果与形态鉴定结果相同，表明我们分离到的A94菌株是棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。将该新筛选到的A94菌株命名为Trichoderma sp.，株号A94，于2019年10月30日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019869。

本发明又提供了所述的棘孢木霉菌在抑制柑橘黑点病菌生长中的应用。

本发明又提供了所述的棘孢木霉菌在防治芸香科植物柑橘黑点病菌感染中的应用。

只要是会感染柑橘黑点病菌的植株均能够使用。所述芸香科植物可以除了柑橘外，还可以是橙子、柚子。优选的，所述芸香科植物为柑橘。

本发明又公开了一种柑橘黑点病菌抑制剂，由所述的棘孢木霉菌发酵培养后，去除菌体所得。所述的柑橘黑点病菌抑制剂，培养温度为25℃，培养时间7天。

本发明还提供了一种柑橘黑点病的防治方法，将所述棘孢木霉菌喷洒在柑橘植株上。当然，也可以将所述柑橘黑点病菌抑制剂喷洒在柑橘植株上。可以是用于预防，也可以是用于对已经感染了柑橘黑点病菌的植株进行治疗。

本发明经筛选分离到一株棘孢木霉菌，命名为Trichoderma sp.，株号A94，保藏号为CCTCC NO：M2019869。菌株A94可以高效分泌木质素酶，对植物木质素有很好的降解作用，对柑橘黑点病菌有高效的寄生作用，同时还耐盐。不但要对病原菌具有抑制、寄生分解作用的，同时还对植物残体有强烈的分解作用，将极大减少柑橘黑点病的侵染来源，大大提高防治效果。

附图说明

图1为菌株A94在PDA上生长7天的菌落形态图。

图2为菌株A94的分生孢子梗和分生孢子，各小图中为不同视野下用于展示分生孢子梗和分生孢子的形态，标尺＝10μm。

图3为六个棘孢木霉菌株对柑橘黑点病菌的寄生情况检测结果图。

图4为菌株产生木质素酶的检测结果图，其中F表示培养皿的反面，Z表示培养皿中菌落的正面，下同。

图5为菌株产生几丁质酶的检测结果图。

图6为待测菌株的耐盐性检测结果图。

图7为菌株A94和P31发酵液对黑点病菌的抑制效果检测图。

具体实施方式

实施例1菌种分离

从全国各地采集土壤样品，采用选择性培养基稀释平板法分离，过程如下：称取10g土样，放入装有小钢珠与90mL无菌水的250mL三角瓶中，在摇床上以120r·min^-1摇10min，使土样充分分散，即成10倍稀释液；再吸取10倍稀释液1mL，加入到9mL无菌水的离心管中，充分混匀；然后再从中取1mL，加入到9mL无菌水的离心管中，充分混匀，即配成稀释1000倍的稀释液。将已融化的PDA培养基倒入培养皿中，每皿15mL；待培养基冷却成平板后，吸取稀释1000倍的土样稀释液0.1mL加到PDA培养基平板上，再用无菌涂布器将稀释液涂匀，每个浓度重复3次。在25℃的光照培

养箱中培养3d后观察菌落，挑取菌落的菌丝于新的PDA平板上，待菌落直径长到3cm时再次转接到PDA平板上。

PDA培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，18g琼脂，0.3g氯霉素(chloramphenicol)，1000mL蒸馏水。

PDB液体培养基：200g马铃薯，20g葡萄糖，18g琼脂，1000mL蒸馏水。

从浙江省宁波市宁海县(北纬29.9031度，东经121.9037度)的海水土壤中分离到一株菌株，命名为A94。

实施例2菌种形态鉴定

PDA培养基的菌落形态和分生孢子梗分枝及孢子特征进行归类。

在PDA培养基上，25℃下，12h/12h光暗培养菌株7d以上，用一小段透明胶带粘在菌落边缘上，而后将胶带取下放在载玻片上的甘油乳酸中，上面再加上1滴甘油乳酸，加盖玻片检视(乳酸500mL，甘油1000mL，蒸馏水500mL)。

菌株A94在PDA培养基上生长迅速，平均每天直径生长超过1.5cm。初期菌丝白色，气生菌丝发达。随着孢子的大量产生，菌落逐渐变成深绿色(图1)。分生孢子梗直立或弯曲，表面光滑。分支不规则，分支近直角，瓶梗单生、对生、轮生都有。瓶梗明显，基部宽，上端尖细，(2.5–)3.0～3.5(–5.0)×(2.5–)3.0～3.5(–5.0)μm。分生孢子表面光滑，近球形，直径(2.2–)3.0～3.5(–4.7)×(3.0–)3.5～4.0(–4.7)μm(图2)。这样的形态特征符合棘孢木霉(Trichoderma asperellum)的特征。

实施例3分子鉴定

(1)DNA提取

1)在PDA平板上22℃培养A94菌株7天后，用牙签刮取平板上的菌丝，放入已灭菌的含有300μL提取缓冲液1.5mL离心管中；

提取缓冲液的配方为：1M KCl，100mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH＝8.0；

2)将挑取的菌丝用电磨机研碎，然后再加入300μL提取缓冲液，剧烈震荡2min；

3)10000rpm离心10min；

4)吸取上清液，转移至另一新的离心管中，弃沉淀；

5)在上清液中加入等体积的异丙醇(分析纯)，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心10min，沉淀核酸；

6)轻轻倒去上清液，将含有沉淀的离心管倒置在吸水纸上排干水分；

7)再加入300μL 70％乙醇，轻轻颠倒混匀数次后，12000rpm离心2min；

8)轻轻倒去上清液，重复步骤7)一次；

9)将离心管倒置在吸水纸上排干水分，置于37℃下15min，使乙醇充分挥发；

10)用50μL ddH₂O重悬沉淀，得到A94基因组DNA，浓度达到30ng/μL。

(2)真菌核糖体ITS rDNA基因、微管蛋白BenA基因、核糖体LSU rDNA基因、转录因子TEF基因、β-tubulin基因的PCR扩增

ITS引物：上游引物ITS1序列为：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，下游引物ITS4序列为：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；

微管蛋白BenA基因引物：上游引物Bt2a：GGT AAC CAA ATC GGT GCT GCT TTC，下游引物Bt2b：ACC CTC AGT GTA GTG ACC CTT GGC；

LSU引物：上游引物LR5：ATC CTG AGG GAA ACT TC，下游引物LROR：ACC CGC TGAACT TAA GC；

TEF引物：上游引物CEFF2：GGCTTCAACGTGAAGAACG；下游引物CEFR1：CCGTKCAARCCRGAGATGG(引物中字母K和R均为简并密码，K为G/T，R为A/G)；

β-tubulin引物：上游引物T12：TAACAACTGCTGGGCCAAGGGTCAC；下游引物T22；TCTGGATGTTGTTGGGAATCC。

PCR扩增在50μL反应体系中进行，体系中含有：上下游引物各2μM，dNTPs 200μM，MgCl₂ 1.5mM，10×PCR buffer 5μL，模版DNA 2μL，Taq酶2U。

PCR扩增反应在朗基MG96G型PCR仪上进行。反应条件：94℃预变性2min，然后35个循环包括：94℃变性30sec，55℃退火40sec，72℃延伸1min。最后72℃后延伸10min。

(3)PCR产物的回收纯化

PCR反应结束后，PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测后，采用爱思进生物技术公司的DNA凝胶纯化试剂盒，按照试剂盒说明书的步骤进行，步骤如下：

1)将50μL PCR产物全部加到1％的琼脂糖凝胶的点样孔中，按5V/CM的电泳条件电泳30min；

2)电泳结束后，在紫外灯下用刀片切取含目的DNA片段的凝胶，置于2mL离心管中，称重；

3)按照1mg凝胶加入3mL的DE-A缓冲液的标准，加入DE-A缓冲液到收集凝胶的2mL离心管中，75℃保温10min，期间振荡数次，至完全融化；

4)加入0.5倍DE-A体积的DE-B缓冲液，混合均匀；

5)将DNA制备管放入2mL离心管中，将混合液转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min，弃上清；

6)将DNA制备管放回2mL离心管中，加500μL缓冲液W1，12000rpm离心30s；

7)将DNA制备管放回2mL离心管中，加700μL缓冲液W2，12000rpm离心30s；

8)重复步骤7)一次；

9)将DNA制备管放回2mL离心管中，12000rpm离心2min。以排干膜上洗涤液；

10)将DNA制备管放回2mL离心管中，加50μL的ddH₂O，10000rpm离心1min，洗脱DNA置-20℃下保存。

(4)基因的测序和序列分析

经电泳检测后的已经纯化回收的目的DNA片段送至上海生工用ABIPRISMA377型自动测序仪进行测序。测序结果经过严格核对后，得到如SEQ ID No.1-SEQ ID No.5所示的DNA片段序列。其中，真菌核糖体ITS rDNA基因的PCR扩增产物(SEQ ID No.1)、微管蛋白BenA基因的PCR扩增产物(SEQ ID No.2)、核糖体LSU rDNA基因的PCR扩增产物(SEQ IDNo.3)、转录因子TEF基因的PCR扩增产物(SEQ ID No.4)、β-tubulin基因的PCR扩增产物(SEQ ID No.5)。

在NCBI网站上，将测得A94菌株的ITS的核苷酸序列用BLAST在GenBank数据库中查找和比对同源或相似的核苷酸序列。对比结果显示，此序列与登录号为MN585685、MN585683、MN585674、MK377321等属于Trichoderma asperellum的菌株的覆盖率达99％以上，相似度达到100％。也与登录号为MG266013的Trichoderma koningiopsis，与登录号为MK764992的Trichoderma viride达到99.8％的相似度。

而用A94的LSU基因序列检索GenBank数据库，对比结果显示，此序列与登录号为MH874069的Trichoderma pubescens，登录号为MH333256的Trichoderma viride，登录号为KF723005的Trichoderma asperellum等相似性都达到100％。

而用A94的BenA基因序列检索GenBank数据库，对比结果显示，此序列与登录号为MG744497的Trichoderma asperellum，登录号为XM_024907730的Trichoderma asperellum相似性超过98.29％。

用A94的TEF序列检索GenBank数据库，对比结果显示，此序列与登录号为KT302162、KP262478、KP696458等的Trichoderma asperellum相似性超过99％。

用A94的tubulin序列检索GenBank数据库，对比结果显示，此序列与登录号为XM_024907730的Trichoderma asperellum，相似性超过98％，与登录号为XM_014090918的Trichoderma atroviride相似性达到96.14％；与登录号为Z15055的Trichoderma viride相似性达到95.31％。与其他种的相似性都在95％以下。

通过多个序列比较，A94菌株与棘孢木霉(Trichoderma asperellum)序列最接近，亲缘关系最近，此结果与形态鉴定结果相同，表明我们分离到的A94菌株是棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。将该新筛选到的A94菌株命名为Trichoderma sp.，株号A94，于2019年10月30日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019869。

实施例4 A94菌株对柑橘黑点病菌的寄生作用

将A94菌株与我们分离到的其他5个棘孢木霉菌株与柑橘黑点病菌进行对峙培养：在直径为9CM的PDA平板上，将柑橘黑点病菌与测试的棘孢木霉菌株分别接种到平板两侧，两个菌株相距4cm。对峙培养5天后，检查各个测试菌株对柑橘黑点病菌的抑制寄生情况。结果表明，测试的6个棘孢木霉菌株对柑橘黑点病菌都有寄生抑制作用，但是A94菌株明显比其他菌株寄生作用强(图3)。而P31、W222两个菌株也比另外的其他3个菌株寄生能力稍强。我们以柑橘黑点病菌被棘孢木霉菌株寄生后剩余的菌落面积(被寄生的菌落面积难以测量)做比较，以寄生强度评估寄生的强弱，寄生强度按以下公式计算：

A94寄生强度＝(对比菌株的未寄生面积-A94的未寄生面积)/对比菌株的未寄生面积×100％

结果如表1所示，A94菌株菌株比其他菌株的寄生能力强53％以上。

表1三个菌株的寄生强度比较

菌株	W222	P31	A94
				未寄生面积	14.6	12.4	5.8
A94寄生强度	60.3	53	0

实施例5 A94菌株产生木质素酶和几丁质酶的能力检测

鉴于木质素酶和几丁质酶在生防菌对植物病原菌的寄生、防治方面起到重要作用，我们比较了A94菌株与P31、W222的产酶能力。

(1)A94菌株产生木质素酶的能力检测

平板检测：将待测菌株接种在添加了1％的愈创木酚的PDA培养基平板上，4天后观察培养基中的红色情况。颜色越红，说明木质素酶活性越高。

结果表明，与P31、W222相比，A94菌株的产酶活性明显比其他菌株高(图4)。从培养皿的菌落形态可见，A94菌株菌丝旺盛，产孢多。

木质素酶1,3-葡聚糖酶酶活的测定：

将待测菌株接种到100mL的PDB中，25℃的摇床上150rpm震荡培养7天。培养液经过0.22μm孔径的细菌过滤器过滤后，即为待测的酶粗提液。

1)准备96孔微板，每孔分别加入10μL酶粗提液、20μL的0.25％海带多(laminarin)，混合均匀。

2)混合液在PCR仪40℃反应15min。

3)静置后，加入100μL DNS试剂(0.687％(W/V)DNS，1.28％(V/V)酚，19.92％(W/V)酒石酸钾钠，1.226％NaOH(W/V))。混合后，封膜在PCR仪95℃反应5min。

4)在25℃下冷却2min，取100μL反应混合液加入96孔加样板，在540nm测定吸光度。每个处理三次重复。一个酶活单位为每分钟反应混合液产生1μmol还原糖所需酶量(1μmol·min^-1)。

结果见表2，A94菌株的产酶活性比其他菌株高一倍以上。

表2三个菌株的木质素酶活性

菌株	W222	P31	A94
				1,3-葡聚糖酶酶活	3.5	3.1	7.2
A94的酶活提高度	106％	132％

(2)A94菌株产生几丁质酶的能力检测

平板检测：制备基础培养基：MgSO₄.7H₂O 0.3g，(NH4)₂SO₄ 3g，KH₂PO₄ 2g，一水柠檬酸1.0g，琼脂15g，Tween-80 200μl，胶体几丁质4.5g，溴甲酚紫0.15g，pH4.7，121℃灭菌15min，制平板，凝固，接种木霉菌饼，25±2℃培养，观察菌落色泽。

结果见图5，与P31、W222相比，A94菌株的产酶活性明显比其他菌株高。A94菌株菌丝旺盛，产孢多。

A94外切几丁质酶酶活测定：底物采用4-甲基伞形酮-N-乙酰-β-d-葡萄糖胺(4-methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide)。用50mM醋酸钠缓冲液(pH 5.0)配制0.1mM底物反应混合液。步骤如下：

1)加入100μL底物和200μL酶粗提液，混合均匀，在25℃下反应30min；

2)利用酶标仪(Cytofluor II)在360nm激发波长、460nm发射波长下测定荧光。一个酶活单位为每分钟反应混合液产生1μmol 4-甲基伞形酮所需酶量(1μmol·min^-1)。

结果见表3，A94菌株比其他棘孢木霉的产几丁质酶活高78％以上。

表3三个菌株的几丁质酶活性

菌株	W222	P31	A94
				外切几丁质酶活	13.2	14.2	25.3
A94的酶活提高度	92％	78％

实施例6 A94菌株耐盐能力检测

盐胁迫是一种重要的环境胁迫因子，耐盐性好的菌株，其抗逆性强，特别是从不良环境(水分少)中获取水分的能力强，适应性好。

我们在PDA培养基中分别加入6％、8％、10％的NaCl，将A94菌株和W222菌株转接到其上，4天后观察生长情况。

结果发现A94菌株比P31菌株更耐盐。A94菌株在含盐量为6％、8％的情况下，菌落比P31菌株明显增大；A94在10％的NaCl条件下还可以生长，而P31菌株则不能生长(图6)。

实施例7 A94菌株对柑橘黑点病菌的抑制作用检测

木霉接种于100mL PDB培养基/250mL锥形瓶，25℃150rpm，培养7d，离心取上清液即为发酵液，过滤除菌后添加1mL到15mL PDA培养基中，制成发酵液-PDA平板，接种柑橘黑点病菌，5天观察抑菌效果。

实验结果见图7所示，菌株A94的抑菌效果明显高于P31，说明菌株A94的抑菌效果好。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种能够抑制柑橘黑点病菌生长的棘孢木霉菌及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 548

<212> DNA

<213> 棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)

<400> 1

cccaacccaa tgtgaacgtt accaaactgt tgcctcggcg gggtcacgcc ccgggtgcgt 60

cgcagccccg gaaccaggcg cccgccggag gaaccaacca aactctttct gtagtcccct 120

cgcggacgta tttctttaca gctctgagca aaaattcaaa atgaatcaaa actttcaaca 180

acggatctct tggttctggc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa 240

ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat tgcgcccgcc agtattctgg 300

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acacccaact ttctgaaatg ttgacctcgg atcaggtagg aatacccgct gaacttaagc 540

atatctaa 548

<210> 2

<211> 323

<212> DNA

<213> 棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)

<400> 2

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tggagcgcat gaacgtctac ttcaacgagg tatgtctggc tgcgccaaaa gaggacacct 120

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caagggtcac tacactgagg gta 323

<210> 3

<211> 871

<212> DNA

<213> 棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)

<400> 3

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tggcgtaatg gtcaccagcg acccgtcttg aaacacggac caaggagtcg tcttcgtatg 600

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acccgaaaga aggtgaacta tgcctgtata gggtgaagcc agaggaaact ctggtggagg 780

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atcgaacctt ctagtagctg gtttccgccg a 871

<210> 4

<211> 944

<212> DNA

<213> 棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)

<400> 4

atcaacgtcg tcgtcatcgt aagttgcaat cccattgttc ccatcagcgg ccttttctct 60

gccgttgact gtgaacgaca ttgtgctgac cttcatcgtc tctaggggtt cgtatttctc 120

caccagactg ctatcgaccg actccaatac tgacttgcta caacagccac gtcgactccg 180

gcaagtctac caccgtgagt aatacccaat tccccaagca ccgtctgctc tcgactctgt 240

cgggtggcgc ggggcaactt gattatggaa gcatccagct aacgtttttc ctaatagact 300

ggtcacttga tctaccagtg cggtggtatt gacaagcgta ccatcgagaa gttcgagaag 360

gtaagctaat ttcactgctt ttcccatcaa tttttggcac aattatatgc ccgacaattc 420

tgttctcagt tttgtctttc ttttttcagc atcaccccgc tttgccagcc tacctacccc 480

tcctttggca cagcaaaaaa ttttctcgct gccttgtttg gcttttagtg gggtgtcaat 540

tttgtttgac ggcaacccca ctatcgccac tgtacctctt tccatcatcc accacatgct 600

tttgttcaat cgcatcgtct attttcaata tctcttgttc attatgctga tcatgcttca 660

atcaatagga agccgccgaa ctcggcaagg gttccttcaa gtatgcgtgg gttcttgaca 720

agctcaaggc cgagcgtgag cgtggtatca ccatcgacat tgccctctgg aagttcgaga 780

ctcccaagta ctatgtcacc gtcattggta tgttttggac acttcagtcg acattgcaag 840

atcgtcattc taacattctc tccccacaga cgctcccggt caccgtgatt tcatcaagaa 900

catgatcact ggtacctccc aggctgactg cgctatcctc atca 944

<210> 5

<211> 768

<212> DNA

<213> 棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)

<400> 5

ggtgagctcg tctgacacgt cctcgacgtt gtccgccgtg aggccgaagg ttgcgactgc 60

ctccagggct tccagatcac ccactctctc ggtggtggta ctggatctgg tatgggaact 120

ctcctgctct ccaagatccg cgaggaattc cccgaccgaa tgatggccac tttctccgtt 180

gtcccatccc ccaaggtgtc cgacaccgtc gttgaaccct acaacgccac cctctccgtc 240

caccagcttg tcgagaactc cgacgaaacc ttctgcattg ataacgaggc tctctacgac 300

atctgcatgc acaccctcaa gctgaacaac cctgcctacg gtgacctgaa ctacctcgtc 360

tccgctgtca tgtcaggcat caccacctgc ttgcgattcc ccggtcagct caactctgat 420

ctccgcaagc tggctgtcaa catggttcct ttccctcgtc tccacttctt catggtcggc 480

ttcgctcctc tgaccagccc cggtgctcac tctttccgtg ccgtcaccgt gcccgagctc 540

acccagcaga tgttcgaccc caagaacatg atggctgctt ccgacttccg caacggtcgc 600

tacctgactt gctgctctat cttgtaagtg acgatgatgc cttggcgtag tgacatgcag 660

tgctaacaga tatatctagc cgtggcaagg tcgccatgaa ggaggttgag gaccagatgc 720

caaacgtgca gaacaagaac tccacctact tcgttgagtg gattccca 768

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtaaccaaa tcggtgctgc tttc 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

accctcagtg tagtgaccct tggc 24

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atcctgaggg aaacttc 17

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acccgctgaa cttaagc 17

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggcttcaacg tgaagaacg 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> variation

<222> (5)..(5)

<223> k is g/t

<220>

<221> variation

<222> (9)..(12)

<223> r is a/g

<400> 13

ccgtkcaarc crgagatgg 19

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

taacaactgc tgggccaagg gtcac 25

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tctggatgtt gttgggaatc c 21

Claims

1.一种能够抑制柑橘黑点病菌生长的棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)，其特征在于，命名为Trichoderma sp.，株号A94，保藏号为CCTCC NO：M2019869。

2.如权利要求1所述的棘孢木霉菌在抑制柑橘黑点病菌生长中的应用。

3.如权利要求1所述的棘孢木霉菌在防治芸香科植物柑橘黑点病菌感染中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述芸香科植物为柑橘。

5.一种柑橘黑点病菌抑制剂，其特征在于，由权利要求1所述的棘孢木霉菌发酵培养后，去除菌体所得。

6.如权利要求5所述的柑橘黑点病菌抑制剂，其特征在于，培养温度为25℃，培养时间7天。

7.一种柑橘黑点病的防治方法，其特征在于，将权利要求1所述棘孢木霉菌喷洒在柑橘植株上。

8.一种柑橘黑点病的防治方法，其特征在于，将权利要求5或6所述柑橘黑点病菌抑制剂喷洒在柑橘植株上。