CN103695360B - 一种海洋解淀粉芽孢杆菌1a的分离方法与用途 - Google Patents
一种海洋解淀粉芽孢杆菌1a的分离方法与用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明是一种海洋解淀粉芽孢杆菌1A对果品产后病原真菌的抗菌与防病用途，所述的果品产后病原真菌为：苹果炭疽病菌，葡萄白腐病菌，梨链格孢菌，柑橘青霉菌。所述的海洋解淀粉芽孢杆菌1A的分离方法通过采集连云港海域海水、海泥、海洋漂浮物、文蛤、浒苔、跳跳鱼样品，富集后进行细菌的分离及纯化，得到若干海洋细菌纯菌株；再采用平板对峙法测定海洋细菌纯菌株对供试4种果品产后病原真菌的抑制作用，筛选得到抑菌带宽度大于5mm的菌株；再采用牛津杯法测定无菌发酵液对前述4种果品产后病原真菌的抑菌作用，筛选得到抑菌带宽度均大于10mm的解淀粉芽孢杆菌1A。本发明具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种菌株的分离方法，特别是一种海洋解淀粉芽孢杆菌1A的分离方法，本发明还涉及前述分离方法得到的解淀粉芽孢杆菌1A的用途。
背景技术
果实采后腐烂是一个全球性问题。新鲜水果在采收、分级、包装、运输、贮藏、批发、零售整个采后流通过程中都有可能腐烂损失，在世界范围内新鲜果蔬贮运过程中约有25% 的产品因腐烂变质不能利用，有些易腐水果采后腐烂损失达到30% 以上。目前控制果品产后病害主要依靠化学防治，然而化学农药的大量使用导致的农产品农药残留、病原菌抗药性产生、环境污染等问题已成为世界性难题。生物防治可弥补化学农药的不足，成为植物病害防治的重要手段。应用有益微生物防治果品产后病害引起广泛重视，并取得了许多成果。目前用于果品产后病害的微生物菌株主要来源于陆源微生物。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种来自海洋解淀粉芽孢杆菌1A的新的对果品产后病原真菌的抗菌与防病用途。
本发明所要解决的另一技术问题是提供了解淀粉芽孢杆菌1A的分离方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明公开了海洋解淀粉芽孢杆菌1A（Bacillus amyloliquefaciens）对果品产后病原真菌的抗菌与防病用途；所述的果品产后病原真菌为：苹果炭疽病菌( Colletotrichum gloeosporioides )，葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella），梨链格孢菌( Alternaria kikuchiana) ，柑橘青霉菌( Penicllium italicum)。
本发明中涉及的海洋解淀粉芽孢杆菌1A的分离方法步骤如下：
（1）样品的采集与富集：连云港海域采集海水、海泥、海洋漂浮物、文蛤、浒苔、跳跳鱼样品，置于采样袋中，注明样品名称、采集日期以及采集地点，样品进行如下处理：
海水样品：采集来的海水混匀，5mL加入到装有45mL富集培养基的250ml三角瓶中，25℃、180r/min的条件下摇床培养2d；
海泥样品：取5g海泥放入事先灭好菌的装有45ml的无菌海水的250ml的三角瓶中，混匀振荡20min，取5ml样品加入45ml富集培养基的250ml三角瓶中，25℃、180r/min的条件下摇床培养2d；
鱼体样品：鱼体解剖之后，取肠道组织5g放入无菌研砵中加少量无菌海水研磨至糊状，取研磨好的糊状样品5ml加入装有45ml富集培养基的250ml三角瓶中，25℃，180r/min的条件下摇床培养2d；
贝类样品：取其消化腺5g剪碎无菌海水浸泡过夜后，将浸泡液和消化腺放入装有入45mL富集培养基250ml三角瓶中，180r/min，25℃条件下摇床培养2d；
浒苔样品：用无菌海水冲洗浒苔样品3 次，取5g冲洗后的样品研磨至糊状，将液体加入到富集培养基中，并于25℃、180r/min的条件下摇床培养2d；
螃蟹样品：用剪刀剪取5g蟹肉或者消化腺于放入已经灭菌后的无菌研砵中研磨至糊状，取研磨好的糊状样品5ml加入45ml富集培养基的的250ml三角瓶中，并于25℃、180r/min的条件下摇床培养2d；
（2）细菌的分离及纯化：分别取1mL上述富集后的样品放入盛有9mL无菌水的试管中，进行梯度稀释，取10-4、10-5、10-6稀释度样品0.2mL涂布到直径9cm的分离培养基平板上，每个稀释梯度重复3次；观察并挑取形态、颜色不同的菌落，采用三区划线方法进行纯化，得到若干海洋细菌纯菌株；
（3）初筛：采用平板对峙法测定海洋细菌纯菌株对供试4种果品产后病原真菌的抑制作用；方法如下：PDA培养基平板中央接种直径为8mm果品产后病原真菌菌苔，菌苔四周距离培养皿边缘15mm处划线接种海洋细菌纯菌株，重复3次，28℃倒置恒温培养3d，测定抑菌带宽度，筛选得到抑菌带宽度大于5mm的菌株；所述的4种果品产后病原真菌为：苹果炭疽病菌( Colletotrichum gloeosporioides )，葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella），梨链格孢菌( Alternaria kikuchiana) ，柑橘青霉菌( Penicllium italicum)；
（4）复筛：将抑菌带宽度大于5mm的菌株进行摇瓶发酵制备无菌发酵液，方法如下：接种1环菌株于盛有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养24h，调整菌液浓度为108cfu/mL，作发酵用种子液；将种子液按10%的接种量接入至装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养36h，发酵液在4℃，12000 r/min条件下离心20min，弃沉淀，上清液，用孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤，即得无菌发酵液；采用牛津杯法测定无菌发酵液对前述4种果品产后病原真菌的抑菌作用，筛选得到对4种果品产后病原真菌的抑菌带宽度均大于10mm的菌株海洋解淀粉芽孢杆菌1A，该菌株分离自海水样品；
所述的富集培养基、分离培养基、种子培养基和发酵培养基均为2216E培养基。
以下对本发明进行进一步说明。
本发明方法所涉及的材料解淀粉芽孢杆菌1A（Bacillus amyloliquefaciens strain 1A）（下称菌株1A）已经于2013年7月1日在 Genebank公开（登录号为KF112077），网址为：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KF112077。该菌株为公知公用材料，在本专利申请日起二十年内，公众如果需要，淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。
以下是发明人做的相关实验：
1材料与方法
1.1 供试病原菌
炭疽病( Colletotrichum gloeosporioides )葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella）、梨链格孢菌( Alternari a kikuchi ana) 、柑橘青霉菌( Penici l l i um i tal icum)，由中国农科院植保所提供，淮海工学院海洋学院实验室保存。
1. 2 样品的处理与富集
连云港海域采集海水、海泥、海洋漂浮物、文蛤、浒苔、跳跳鱼等样品，置于采样袋中，注明样品名称、采集日期以及采集地点，样品进行如下处理：
（1）海水样品：采集来的海水混匀， 5mL加入到装有50mL富集培养基的250ml的三角瓶中，25℃、180r/min的条件下摇床培养2d。
（2）海泥样品：取5g海泥放入事先灭好菌的装有45ml的无菌海水的250ml的三角瓶中，混匀振荡20min，取5ml样品加入45ml富集培养基的的250ml的三角瓶中，25℃、180r/min的条件下摇床培养2d。
（3）鱼体样品：鱼体解剖之后，取肠道组织5g放入无菌研砵中加少量无菌海水研磨至糊状，取研磨好的糊状样品5ml加入45ml富集培养基的的250ml的三角瓶中，25℃，180r/min的条件下摇床培养2d。
（4）贝类样品：取其消化腺5g剪碎无菌海水浸泡过夜后，将浸泡液和消化腺放入装有入45mL富集培养基250ml的三角瓶中，180r/min，25℃条件下摇床培养2d。
（5）浒苔样品：用无菌海水冲洗浒苔样品3 次，取5g冲洗后的样品研磨至糊状，将液体加入到富集培养基中。并于25℃、180r/min的条件下摇床培养2d。
（6）螃蟹样品：用剪刀剪取部分蟹肉或者消化腺于放入已经灭菌后的无菌研砵中研磨至糊状，取研磨好的糊状样品5ml加入45ml富集培养基的的250ml的三角瓶中，并于25℃、180r/min的条件下摇床培养2d。
1. 3 菌株的分离及纯化
取1mL处理好的样品放入盛有9mL无菌水的试管中，进行梯度稀释，取10-4、10-5、10-6稀释度样品0.2mL涂布到直径9cm的分离培养基平板上，每个稀释梯度重复3次。观察并挑取形态、颜色不同的菌落，采用三区划线方法进行纯化。
1．4菌株对几种水果储藏病原菌的抑制作用测定
采用平板对峙法测定分离菌株对供试4种病原真菌的抑制作用。PDA培养基平板中央接种直径为8mm病原真菌菌苔，菌苔四周距离培养皿边缘15mm处划线接种分离菌株，重复3次， 28℃倒置恒温培养3d，测定抑菌带宽度。抑菌作用较强的菌株进行摇瓶发酵制备无菌发酵液，测定发酵液的抑菌作用。
将抑菌带宽度大于5mm的菌株进行摇瓶发酵制备无菌发酵液，方法如下：接种1环菌株于盛有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养24h，调整菌液浓度为108cfu/mL，作发酵用种子液；将种子液按10%的接种量接入至装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养36h，发酵液在4℃，12000 r/min条件下离心20min，弃沉淀，上清液，用孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤，即得无菌发酵液。
1.5菌株对几种水果储藏病原菌的菌丝破坏作用观察
液体共培养法：病原真菌在PDA平板中培养5d后，用直径为5 mm的打孔器在培养好的病原真菌的菌落边缘打取菌苔5块，放入装有50mL海水PD培养基的250mL的三角瓶中，再向三角瓶中接种菌体浓度为1.0 ×108 个/ mL的1A菌株悬浮液1mL，在28℃、180 r/min条件下恒温震荡培养5d，显微镜下观察病原真菌的菌丝形态。
1.6菌株无菌发酵液对病原真菌孢子萌发的抑制作用
用5mL无菌水洗下培养5 d的梨供试的水果产后病原真的菌落，用4层无菌纱布过滤除去菌丝，滤液在室温，4000 r/min下离心10min ，沉淀即为分生孢子，用制备好的无菌发酵液配制孢子悬浮液，浓度为106个孢子/mL，取20μL孢子悬浮液滴加在无菌玻片上，置于铺有湿润滤纸的培养皿内，28℃下恒温保湿培养，分别于2，4，6，8，10h观察孢子萌发情况，测定芽管长度，计算孢子萌发率和抑制率。
孢子萌发率（%）=（萌发孢子数/观察孢子总数）×100%。
抑制率（%）=（对照孢子萌发率或芽管长度 - 孢子萌发率或芽管长度）/对照孢子萌发率或芽管长度×100%
1.7菌株无菌发酵液对几种水果防腐作用测定
取无病无伤、大小和成熟度相似的新鲜苹果、梨、柑橘，用2 %的NaClO 溶液表面消毒后，清水洗净晾干。在果实腰部9cm2的区域用无菌针刺成微孔，进行如下处理：
（1）涂抹接种100μL 的菌株1A菌悬液，2 h 后接种病原菌孢子悬液100μL；
（2）先接种病原菌的孢子悬液100μL，2 h 后涂抹100μL 的菌株1A菌悬液；
（3）单纯接种病原菌的孢子悬液100μL；
（4）只涂抹接种100μL 的菌株1A菌悬液。处理后的果实放到保湿缸内，保持95 %的湿度，在25 ℃条件下恒温保湿培养，7 d后统计果实的发病率和病斑直径，每个处理10个果实。
葡萄的处理：取健康无病葡萄果实50 粒, 75% 酒精表面消毒2min，无菌水冲洗3 次进行如下处理：
（1） 从葡萄的基部涂抹菌株1A发酵液20μL ， 干燥后接种葡萄白腐病菌的菌悬液10μL；
（2）从葡萄的基部接种葡萄白腐病菌的菌悬液10μL，2 h 后涂抹菌株1A发酵液20μL ；
（3）只接种菌株1A菌悬液20μL；
（4）只接种葡萄白腐病菌菌悬液10μL, 25 ℃条件下保湿培养, 观察果实始病时间, 计算果腐率。试验重复3 次。
抑制率（%）=（对照发病面积或果腐率 - 处理发病面积或果腐率）/对照发病面积或果腐率×100%
1.8菌株的鉴定
1.8.1形态学观察
对分离到有较强抗菌作用的菌株接种于LB培养基平板上，28℃恒温培养24h，观察记录菌落形态，测定菌体大小，并进行革兰氏染色、芽孢染色和鞭毛染色。
1.8.2生理生化鉴定
生理生化试验参考文献方法，测定吲哚试验、M.R.试验、V.P.试验、硫化氢试验、油脂水解试验、石蕊牛奶试验、接触酶试验、糖醇发酵试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、半固体琼脂穿刺试验、好氧性和明胶液化等生理生化指标 。
1.8.3 16SrDNA序列的扩增分析
采用CTAB法提取不同菌株的基因组DNA ，应用细菌16SrDNA基因通用引物：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1492R： 5’-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3’扩增16SrDNA序列，PCR反应体系见表1。
表1 菌株16SrDNA序列扩增PCR反应体系
PCR扩增条件为： 94℃预变性4min；94℃变性50s，53℃退火50s，72℃延伸1 min 30s，35个循环；72℃延伸10 min。采用1.0%琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，PCR扩增产物送上海生工生物工程技术服务公司测序，应用BLAST程序与NCBI数据库中的细菌16S rDNA序列进行比对，采用MEGA5软件包Neighbour-joining（bootstrap1000）法构建系统发育树，进行同源性分析。
1.8.4 gyrB基因序列的扩增分析
采用通用引物：
UP-1：5’-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGGNGGNAARTTYGA-3’
UP-2：5’-AGCAGGCTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCKTCNGTCAT-3’
PCR反应体系见表2。
表2 gyrB序列扩增PCR反应体系
PCR扩增条件为：95℃预变性5min，94℃1min，60℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环，72℃10min。采用1.0%琼脂糖对PCR扩增产物进行电泳检测。
扩增产物送上海生工生物工程技术服务公司测序。应用BLAST程序与数据库中已有的细菌gyrB序列进行相似性比较，采用MEGA5软件包Neighbour-joining（bootstrap1000）法进行序列同源性分析，构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 菌株的分离
从连云港近海域共采集样品共17份，分离到76株海洋细菌。其中16株菌株分离自3份海水样品，12株分离自3份海泥样品，18株分离自6份动物样品，7株分离自2份植物样品，6 株分离自2份海洋漂浮物样品。
2.2 菌株对几种水果病原真菌的抑制作用测定
分离得到的76株菌株中有8株对供试水果产后病原真菌均具有明显的抑制作用。不同菌株对不同真菌的抑制作用不同，其中菌株1A的抑菌活性较强，对4种病原菌的抑菌带宽度均达到了15mm以上，对苹果炭疽病菌的抑制作用最强，抑菌带宽度为23.8mm。结果见表3。
表3 分离细菌对4种真菌菌丝生长的抑制作用（抑菌带宽/mm）
8个菌株发酵液对不同病原真菌的抑制作用明显不同，菌株1A发酵液的抑菌活性最强，对供试的植物病原真菌的抑菌带宽度均达到了10mm以上。同一菌株发酵液的抑菌作用低于菌株的抑制作用，结果见表4。
表4菌株发酵液对4种真菌菌丝生长的抑菌作用（抑菌带宽度/mm）
2.3 菌株1A对几种水果病原真菌菌丝破坏作用测定
菌株1A对供试的几种水果病原真菌的菌丝具有破坏作用，导致病原真菌菌丝畸形，菌丝体内原生质浓缩，细胞内原生质形成多个小球，生长点断裂。而对照菌丝形态饱满，细胞壁光滑，菌丝内细胞质均匀透明。
2.4菌株1A发酵液对病原菌孢子萌发的抑制作用
孢子萌发实验结果表明，菌株1A发酵液处理的不同病菌孢子萌发率和芽管长度都明显低于对照。10h不同病原真菌的孢子萌发率和芽管长度均达到了90%和200μm以上，对孢子萌发的抑制率和对芽管长度的抑制率均达到了60%以上。结果见表5。
表5 海洋细菌无菌发酵液处理后病原真菌孢子的萌发率和芽管长度（10h）
2.5 菌株无菌发酵液对几种水果防腐作用测定
表6 菌株1A发酵液处理后不同水果病害的发病面积和抑制率
从表6的结果可以看出，单纯接种病原菌的处理果实发病面积明显高于菌株1A发酵液处理的果实，而单纯涂抹菌株1A发酵液处理的果实未发病，说明菌株1A对四种水果果实无不良影响，而对供试的几种产后果实病害具有明显的抑制作用，抑制率均达到了50%以上，先涂抹菌株1A发酵液的抑制率高于先接种病原菌的处理，其中对梨轮纹病的抑制作用最强，两种菌株1A发酵液方法抑制率分别达到了66.7%和76.1%。
2.6 抗真菌海洋细菌优良菌株的种类鉴定
对抑菌作用较强的菌株1A进行种类鉴定。
2.6.1 形态学观察
光学显微镜下菌株1A菌落椭圆，米黄色，不透明，表面湿润光滑，边缘不整齐，革兰氏染色阳性，有芽孢，无鞭毛，细胞杆状，大小为（0.5～0.8）×（2.0~5.0）μm。
2.6.2生理生化试验结果
生理生化试验结果表明，菌株1A的生理生化试验结果与文献的有关解淀粉芽孢杆菌特征一致，能利用葡萄糖、蔗糖、木糖醇、果糖、阿拉伯糖，接触酶试验、VP试验和淀粉水解试验为阳性，苯丙氨酸、MR试验和氧化酶试验为阴性，与作为对照的大肠杆菌特性明显不同，结果见表7。
表7 菌株1A的生理生化特性
注：“＋”表示阳性，“－”表示阴性
根据形态学观察结果和生理生化特性，查阅《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版等相关文献，初步认为菌株1A属于芽孢杆菌属。
2.6.3 16S rRNA基因序列分析
以不同菌株的基因组DNA为模板，利用16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测，得到菌株1A的16SrRNA基因序列大小为1450bp左右，参见图1。
扩增产物进行测序，所得序列在GeneBank中进行比对，用Mega4.0软件，以NJ法，Kimura-2 parameter模型，bootstrap自检1000次构建的16SrDNA序列的进化树。参见图2，从进化树可以看出，菌株1A处于解淀粉酶芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌之间，表明该菌株属于芽孢杆菌属，无法据此判断其种类。
在现代微生物分类学上，16SrDNA序列已广泛地应用于研究细菌的系统发育关系。然而，在芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌组中，不同菌株的16SrDNA序列相似性都超过了97%。因此，单纯依据16SrDNA序列难以将菌株1A准确鉴定到种的水平。
2.6.4 gyrB基因序列分析
以菌株1A的基因组DNA为模板，利用gyrB基因引物进行PCR扩增，扩增产物测序得到大小为1213bp的片段。
根据测序胶图将测序所得的正反向序列用DNAStar软件包进行手工编
辑、拼接获得长度为1152bp的序列。用Blast在线程序进行同源比较(http：结果//www.ncbi.nlm.gov/BLAST)，结果表明，所测得序列与数据库中Bacillus
amyloliquefaciens来源的DNA gyrase subunit B基因序列的一致性很高（最高达99%），初步推测所得序列为Bacillus amyloliquefaciens的DNA gyrase subunit B基因序列。
从Blast比对结果中选取一致性高的序列，都编辑到1152bp的长度，且保持编码框未移码，用Clustal1.83软件进行完全比对后，利用MEGA4软件，采用MP（maximum parsimony）法，bootstrap自检1000次，以Bacillus subtilis为root，构建了系统进化树。参见图3，结果显示所有的Bacillus amyloliquefaciens序列单独成一个群，且菌株1A与Bacillus amyloliquefaciens strain chenj-1（JN859131.1）和Bacillus amyloliquefaciens strain chenj-5（JN859131.1）聚在同一支，序列一致性最高达99%，表明这三者亲缘关系最近。
结合形态学观察、生理生化特性、16SrRNA基因以及gyrB基因序列分析结果，认为菌株1A属于芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）。
3. 结论与讨论
从连云港海域海水、海泥以及海洋动植物等样品中共分离得到76个海洋细菌菌株，采用对峙培养法和牛津杯法测定不同菌株对4种主要水果产后病原真菌菌丝生长抑制作用，筛选到8个海洋细菌菌株对供试的病原真菌具有较强的抑制作用，其中菌株1A的抑菌作用最强，菌株和发酵液的抑菌带宽度均达到10mm以上，该菌株发酵液能抑制供试病原真菌的孢子萌发和芽管的伸长，并对菌丝结构具有明显的破坏作用，菌株1A对苹果炭疽病、梨轮纹病、葡萄白腐病柑橘青霉病具有显著的抑制作用，抑制率均达到了50%以上。
附图说明
图1为菌株1A 的16SrRNA的PCR扩增产物电泳检测结果图，泳道从左至右分别为：Maker 、菌株1A（4、5泳道）；
图2 为菌株1A的16SrDNA序列进化树；
图3为菌株1A gyrB基因序列BLAST结果构建的系统进化树。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，海洋解淀粉芽孢杆菌1A对果品产后病原真菌具有的抗菌与防病作用；所述的果品产后病原真菌为：苹果炭疽病菌( Colletotrichum gloeosporioides )，葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella），梨链格孢菌( Alternaria kikuchiana) ，柑橘青霉菌( Penicllium italicum)。
所述的海洋解淀粉芽孢杆菌1A（Bacillus amyloliquefaciens）的分离方法步骤如下：
（1）样品的采集与富集：连云港海域采集海水、海泥、海洋漂浮物、文蛤、浒苔、跳跳鱼样品，置于采样袋中，注明样品名称、采集日期以及采集地点，样品进行如下处理：
海水样品：采集来的海水混匀，5mL加入到装有50mL富集培养基的250ml的三角瓶中，25℃、180r/min的条件下摇床培养2d；
海泥样品：取5g海泥放入事先灭好菌的装有45ml的无菌海水的250ml的三角瓶中，混匀振荡20min，取5ml样品加入45ml富集培养基的的250ml的三角瓶中，25℃、180r/min的条件下摇床培养2d；
鱼体样品：鱼体解剖之后，取肠道组织5g放入无菌研砵中加少量无菌海水研磨至糊状，取研磨好的糊状样品5ml加入45ml富集培养基的250ml的三角瓶中，25℃，180r/min的条件下摇床培养2d；
贝类样品：取其消化腺5g剪碎无菌海水浸泡过夜后，将浸泡液和消化腺放入装有入45mL富集培养基250ml的三角瓶中，180r/min，25℃条件下摇床培养2d；
浒苔样品：用无菌海水冲洗浒苔样品3 次，取5g冲洗后的样品研磨至糊状，将液体加入到富集培养基中，并于25℃、180r/min的条件下摇床培养2d；
螃蟹样品：用剪刀剪取部分蟹肉或者消化腺于放入已经灭菌后的无菌研砵中研磨至糊状，取研磨好的糊状样品5ml加入45ml富集培养基的的250ml的三角瓶中，并于25℃、180r/min的条件下摇床培养2d；
（2）细菌的分离及纯化：分别取1mL上述富集后的样品放入盛有9mL无菌水的试管中，进行梯度稀释，取10-4、10-5、10-6稀释度样品0.2mL涂布到直径9cm的分离培养基平板上，每个稀释梯度重复3次；观察并挑取形态、颜色不同的菌落，采用三区划线方法进行纯化，得到若干海洋细菌纯菌株；
（3）初筛：采用平板对峙法测定海洋细菌纯菌株对供试4种果品产后病原真菌的抑制作用；方法如下：PDA培养基平板中央接种直径为8mm果品产后病原真菌菌苔，菌苔四周距离培养皿边缘15mm处划线接种海洋细菌纯菌株，重复3次，28℃倒置恒温培养3d，测定抑菌带宽度，筛选得到抑菌带宽度大于5mm的菌株；所述的4种果品产后病原真菌为：苹果炭疽病菌( Colletotrichum gloeosporioides )，葡萄白腐病菌（Coniella diplodiella），梨链格孢菌( Alternaria kikuchiana) ，柑橘青霉菌( Penicllium italicum)；
（4）复筛：将抑菌带宽度大于5mm的菌株进行摇瓶发酵制备无菌发酵液，方法如下：接种1环菌株于盛有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养24h，调整菌液浓度为108cfu/mL，作发酵用种子液；将种子液按10%的接种量接入至装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养36h，发酵液在4℃，12000 r/min条件下离心20min，弃沉淀，上清液，用孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤，即得无菌发酵液；采用牛津杯法测定无菌发酵液对前述4种果品产后病原真菌的抑菌作用，筛选得到对4种果品产后病原真菌的抑菌带宽度均大于10mm的菌株海洋解淀粉芽孢杆菌1A，该菌株分离自海水样品；
所述的富集培养基、分离培养基、种子培养基和发酵培养基均为2216E培养基。
Claims (1)
1.一种海洋解淀粉芽孢杆菌1A(Bacillus amyloliquefaciens)对果品产后病原真菌的抗菌与防病用途；所述的果品产后病原真菌为：苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)，葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella)，梨链格孢菌(Alternaria kikuchiana)，柑橘青霉菌(Penicllium italicum)。
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