CN104611276B - 一种Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株及其应用，属于微生物技术领域。解决的问题是为了从陆源性微生物中筛选具有抗菌活性的新菌株的难题，提供一种Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2014015，具有抗菌活性，能够用于制备抗菌药物和食品防腐剂。本发明的菌株是从海底淤泥中筛选的新菌株，属于解淀粉芽孢杆菌，具有较强的抗菌活性，尤其对枯草杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果较强，解决从陆源性微生物中筛选的难题，为抗菌药物的研究开辟了一条新的途径。

Description

一种Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
抗菌药为临床上普遍应用且较为重要的一类药物，随着抗菌药的长期使用，环境细菌不断对之产生抗药性，因此要求不断开发新的抗菌药物以应对这一局面。目前临床使用的大多数抗菌化合物大多来是陆生土壤微生物所生产的初级及次级代谢产物，它们种类繁多功能各异，为人类社会的健康事业发展作出了相当大的贡献。经过人们长期的研究开发，现阶段已很难获得新型的陆生抗菌活性物质，这也是目前陆源性微生物筛选所存在的一大难题。另一方面，复杂多变的海洋生态环境蕴藏着大量的微生物资源，且海洋的特殊环境如低温、贫营养、无光照、高盐及高压等,均会导致海洋微生物菌群的生长及代谢的特异性,以致能够产生不同于陆生微生物的生物活性物质，可以弥补陆生微生物的不足。目前已经有超过上万种新的海洋天然产物被发现,这些海洋天然产物具有免疫调节、抗菌、抗氧化、细胞毒活性等作用,并已成为当今社会新药研发的热点。其中某些药物早已进入临床,同时取得了预期的效果。目前，国内外也有许多研究人员正在积极从海洋微生物代谢产物中分离具有抗菌、抗肿瘤等作用的活性化合物,且也取得了较大的成果，新颖结构和新活性化合物也被发现的研究报道也明显增多，表明海洋微生物必将成为今后寻找新药的重要来源。如中国专利申请(公开号：CN103695360A)公开了一种一种海洋解淀粉芽孢杆菌1A的分离方法与用途，该解淀粉芽孢杆菌1A是从海源性微生物中筛选到的一株菌株，但其主要是对果品产后病原真菌的抗菌与防病用途；所述的果品产后病原真菌为：苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeos porioides)，葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella)，梨链格孢菌(Alternaria kikuchiana)，柑橘青霉菌(Penicllium italicum)，而对于在制备抗菌药物方面的应用并没有涉及，而解淀粉芽孢杆菌种类繁多，不同的解淀粉芽孢杆菌其作用并不一定完全相同或相似。因此，本研究希望以海源性微生物为基础，并采用海洋泥土(海底淤泥)作为采样源，从中分离筛选出产具有抗菌活性物质的微生物，为开发出新型抗菌药物研究奠定基础。
发明内容
本发明针对以上现有技术中存在的缺陷，提出一种Baci llusamyloliquefaciens MBRC1菌株及其应用，解决的问题是实现从海源性微生物中得到具有抗菌活性的新菌株，为开发新的抗菌药物提供依据。
本发明的目的之一是通过以下技术方案得以实现的，一种Bacillusamyloliquefaciens MBRC1菌株，所述Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2014015。
本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株，是从海洋微生物中筛选并分离得到的新菌株，具有较强的抗菌活性，已于2014年01月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2014015，保藏地点为中国武汉武汉大学。
本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株的革兰氏阳染色呈阳性；在10℃～45℃温度之间可以生长，最适温度为28℃～32℃，形成的菌落类似圆形，且不透明有皱褶及隆起，表面较粗糙且呈浅黄色，边缘不规则，菌落轮廓清晰，杆状，其(G+C)mol％含量为44.2％。且本发明的Bacillus amyloliquefaci ens MBRC1菌株的厌氧生长、接触酶、淀粉水解、明胶水解、硝酸盐还原和V-P反应均为阳性；其对柠檬酸盐、吲哚产生、苯丙氨酸脱氨酶和酪氨酸水解利用均为阴性；能够利用D-葡萄糖、蔗糖和D-甘露醇。其在5％NaCl下不生长；pH 5.6条件下生长；在50℃下不生长。
在上述的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株中，所述Bacillusamyloliquefaciens MBRC1菌株的16S rRNA序列如SEQ.NO 1所示。本发明人通过对16SrRNA序列比对分析，并通过使用BioEdit(V7.01)和MEGA(V5.1)采用邻位相连法(neighbor-joinging,NJ)构建系统发育树，分析结果表明与Bacillus sp.Q216S(JN132107.1)，Endophytic bacterium MD3(HM160161.1)等遗传距离较近。因此，可以确定本发明的菌株属于芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌。研究表明解淀粉芽孢杆菌在代谢过程中可产生多种抑菌物质，如通过产生抗菌蛋白、多肽及抗生素等活性物质以抑制线虫、植物病原菌、真菌和病毒等，从而起到生物防治的作用。可见，本发明筛选的菌株在抗菌药物中的应用具有一定的潜在价值，为开发新型的抗菌药物奠定了研究基础。
在上述的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株中，所述Bacillusamyloliquefaciens MBRC1菌株具有抗菌活性。作为进一步的优选，所述Bacillusamyloliquefaciens MBRC1菌株对枯草杆菌(B.subtili)、大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌具有抗菌活性。本发明的菌株对上述菌的抑菌性能较好，抑菌圈的直径都能够达到15mm～30mm之间。
在上述的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株中，作为优选，所述Bacillusamyloliquefaciens MBRC1菌株采用海水配制的培养基进行培养。由于海源性微生物生长在海洋环境，因此，本发明通过采用海水配置的培养基进行培养是为了使菌株与培养基之间的渗透压不会发生变化，能够更好的保持一种相对平衡的状态，从而更好的保证在培养过程中菌株不会丢失和保证菌株存活率的作用，提高培养的准确性和选择性。
本发明的目的之二是通过以下技术方案得以实现的，一种Bacillusamyloliquefaciens MBRC1菌株的应用，所述Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株在制备抗菌药物中的应用。
本发明的目的之三是通过以下技术方案得以实现的，一种Bacillusamyloliquefaciens MBRC1菌株的应用，其特征在于，所述Bacillus amyloliquefaciensMBRC1菌株用于食品的防腐剂。由于本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株是属于解淀芽孢杆菌是一种非致病性细菌，从而可以将其作为一种高效的天然生物防腐剂加以开发应用。所述防腐剂中除了Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌外，还可以添加一些常规的添加剂和辅料。
综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株，是本发明人从海底淤泥中筛选到的一株新菌株，属于解淀粉芽孢杆菌，具有较强的抗菌活性，尤其对枯草杆菌(B.subtili)、大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抑菌效果较强，同时也解决了现有的大多是从陆源性微生物中筛选的难题，为抗菌药物的研究开辟了一条新的途径。且本发明的菌株通过采用海水配制的培养基进行培养，能够强化优势菌株的筛选和培养，提高筛选的准确性和选择性。
附图说明
图1是本发明Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株的菌落形态图。
图2是本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株的菌丝形态图。
图3是本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株的和相近菌株的16SrDNA序列进行同源性比对构建的系统发育树图。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明，但是本发明并不限于这些实施例。
以下实施例中所用的斜面培养基(LB固体培养基)、平板基础培养基(LB固体培养基)、液体种子液培养基(LB液体培养基)、发酵培养基Ⅰ、发酵培养基Ⅱ、发酵培养基Ⅲ、发酵培养基Ⅳ和琼脂双层固体培养基均采用海水配制而成。
实施例1
本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株的获得
本实施例中所用的样品海底淤泥采集自浙江省台州市剑门港海区(28°1′57″N,121°36′38″E)海底淤泥。
本实施例中所用的LB固体培养基、LB液体培养基、发酵培养基Ⅰ、发酵培养基Ⅱ、发酵培养基Ⅲ、发酵培养基Ⅳ和琼脂双层固体培养基均采用海水配制而成；
本实施例中所述LB固体培养基具体包括以下成分的重量配比：
酵母提取物：5.0g/L；胰蛋白胨：10.0g/L；氯化钠：10.0g/L；琼脂：15.0g/L；PH 7.2～7.4。
本实施例中所述液体种子培养基(LB液体培养基)具体包括以下成分的重量配比：
酵母提取物：5.0g/L；胰蛋白胨：10.0g/L；氯化钠：10.0g/L；PH 7.2～7.4。
本实施例中所述发酵培养基Ⅰ具体包括以下成分的重量配比：
葡萄糖：5.5g/L；氯化铵：1.2g/L；氯化镁：3.0g/L；牛肉膏：1.0g/L；pH 6.8～7.0。
所述发酵培养基Ⅱ具体包括以下成分的重量配比：
葡萄糖：4.0g/L，酵母膏：5.5g/L；蛋白胨：7.5g/L；(NH4)2SO4：5g/L；NaCl：5g/L；pH7.0～7.2。
所述发酵培养基Ⅲ具体包括以下成分的重量配比：
酵母膏：8g/L；蔗糖：12g/L；NaCl：5g/L；pH：5.8-6.0。
所述发酵培养基Ⅳ具体包括以下成分的重量配比：
葡萄糖：1g/L；NaCl：5g/L；酵母膏：3g/L；蛋白胨：10g/L；pH：7.2～7.4。
所述琼脂双层固体培养基包括以下成分的重量配比：
NaCl：5g/L；牛肉膏：3g/L；蛋白胨：10g/L；琼脂：15～20g/L；pH：7.4～7.6。
对于以上各培养基的成分用量情况，本领域的技术人员可以根据实际情况进行适当的调整，均可适用于作为本发明的培养基使用。
将选取的海底淤泥样品混合均匀，称取5.0g海底淤泥样品，加入已经灭菌且装有适量的玻璃珠及45mL生理盐水的三角烧瓶中，于室温下在250rpm条件下振荡20min，然后用已灭菌的生理盐水依次将上述海底淤泥悬浮液稀释成10-2-10-6倍，然后移取10-4、10-5和10-6三个稀释倍数的样品各0.1mL分别涂布到LB固体培养基平板上，在37℃培养箱中培养2天后观察，挑取单菌落在LB固体培养基平板上划线转接3-4次，直至获取单菌落纯培养物。
将筛选获得的单菌落纯培养物分别点接种至含指示菌(所述指示菌分别为枯草杆菌(B.subtili)、大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus))的LB固体培养基上进行初筛，于37℃条件下倒置培养24-48小时后观察，然后以斜面保存能形成抑菌圈的菌株，得到具有抗菌活性的菌株。
从上述保存斜面上挑几环菌体接种到液体种子培养基(LB液体培养基)中，然后在30℃条件下培养16小时后，移2mL种子液至液体发酵培养基中，所述液体发酵培养基可以选自发酵培养基Ⅰ、发酵培养基Ⅱ、发酵培养基Ⅲ或发酵培养基Ⅳ，于37℃条件下培养38小时，即得到相应的发酵液。以上所述液体种子培养基和液体发酵液培养基的装液量为25mL/250mL摇瓶，摇床转速为200rpm，然后，取上述发酵液5mL在10000rpm，20min的条件下离心分离即可得上清液作为抗菌粗提液，在含有指示菌(所述指示菌分别为枯草杆菌(B.subtili)、大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus))的琼脂双层固体培养基的平皿上放置牛津杯，再移入200uL抗菌粗提液，盖上陶瓦盖，于37℃下培养24h，测出透明抑菌圈直径，进行目标菌株的筛选，得到本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株，该菌株已于2014年01月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2014015，保藏地点为中国武汉武汉大学。
实施例2
本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株形态学、生理生化鉴定及系统发育分析：
本实施例中所用的LB固体培养基采用海水配制而成，其包括以下成分的重量配比：
酵母提取物：5.0g/L；胰蛋白胨：10.0g/L；氯化钠：10.0g/L；琼脂：15.0g/L；PH 7.2～7.4。
将本发明得到的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株接种到LB固体培养基平板上，在30℃条件下倒置培养24小时，观察其菌落生长状态。
菌株形态及生理生化实验可以参照工业微生物实验生物(诸葛健、王正祥，工业微生物实验技术手册[M]，中国轻工业出版社，1994年)和伯杰氏细菌鉴定手册(R.E.布坎南，N.E.吉本斯，伯杰细菌鉴定手册[M]，科学出版社，北京，1984年)，在恒温培养箱中观察其在5℃～40℃(间隔5℃)的生长情况。
上述的的菌株形态学、生理生化特征鉴定结果表明：
本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株的革兰氏阳染色呈阳性；在10℃～45℃温度之间可以生长，最适温度为28℃～32℃，结合图1和图2所示，所形成的菌落类似圆形，且不透明有皱褶及隆起，表面较粗糙且呈浅黄色，边缘不规则，菌落轮廓清晰，杆状；通过采用常规的高效液相法进行测定，表明本发明Bacillus amyloliquefaciensMBRC1菌株的(G+C)mol％含量为44.2％。
本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株的主要生理生化特征如下表1可知，Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株的厌氧生长、接触酶、淀粉水解、明胶水解、硝酸盐还原和V-P反应均为阳性；柠檬酸盐、吲哚产生、苯丙氨酸脱氨酶、酪氨酸水解利用均为阴性；能利用D-葡萄糖、蔗糖、D-甘露醇。通过观察可知，本发明的Bacillus amyloliquefaciensMBRC1菌株在5％NaCl下不生长；pH为5.6的条件下生长；在50℃下不生长。因此，结合本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株的形态特征以及染色结果，同时参照参考文献，可判断Bacillus amyloliquefaciens MBRC1为芽孢杆菌或类芽孢杆菌属。
以下表1是本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1的生理生化特征，具体如下表1所示：
表1：
实施例3
本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株的分子生物学研究
本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株16S rRNA的PCR扩增采用本领域常规的方法即可。更具体的说，本发明的PCR扩增中DNA提取采用上海赛百盛基因技术有限公司的细菌基因组提取试剂盒，具体的提取方法按照试剂盒的方法进行，扩增采用的引物为通用引物，由上海赛百盛基因技术有限公司合成，引物为：
5’-ACAAGCCCTGGAAACGGGGT-3’；
5’-CACCAGGAATTCCGATCT-3’；
PCR扩增反应的条件为：94℃预变性4min，进入循环，94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min后保存4℃状态。PCR产物用UltraClean PCRClean-up kit纯化得到。并由上海生物工程有限公司完成测序，测序如果测序如SEQ NO.1所示。将本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株的16S rRNA基因序列进行同源性分析，分析结果表明本发明的菌株属于芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌，选用与本发明的菌株同源性较高的相关菌株，使用BioEit(V7.01)和MEGA(V5.1)采用邻位相连法(neighbor-joining),NJ)构建系统发育树进行验证，系统发育树具体如图3所示，根据图3的结果表明，本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1菌株与Bacillus sp.Q2 16S(JN132107.1)，Endophytic bacterium MD3(HM160161.1)等遗传距离较近。
实施例4
本发明的Bacillus amyloliquefaciens MBRC1抑菌活性的分析
采用不同的发酵培养基对Bacillus amyloliquefaciens MBRC1进行发酵培养获得相应的抗菌活性物质，再用含指示菌的琼脂双层管碟法复筛得到相应的Bacillusamyloliquefaciens MBRC1菌株，再进行抑菌活性分析，具体的分析结果如下表2所示：
表2：
以上表2中所述的发酵培养基Ⅰ、发酵培养基Ⅱ、发酵培养基Ⅲ和发酵培养基Ⅳ均采用海水配制而成；
上述表2中的发酵培养基Ⅰ包括以下成分的重量配比：
葡萄糖：5.5g/L；氯化铵：1.2g/L；氯化镁：3.0g/L；牛肉膏：1.0g/L；pH 6.8～7.0。
上述表2中的发酵培养基Ⅱ包括以下成分的重量配比：
葡萄糖：4.0g/L，酵母膏：5.5g/L；蛋白胨：7.5g/L；(NH4)2SO4：5g/L；NaCl：5g/L；pH7.0～7.2。
上述表2中的发酵培养基Ⅲ包括以下成分的重量配比：
酵母膏：8g/L；蔗糖：12g/L；NaCl：5g/L；pH：5.8～6.0。
上述表2中的发酵培养基Ⅳ包括以下成分的重量配比：
葡萄糖：1g/L；NaCl：5g/L；酵母膏：3g/L；蛋白胨：10g/L；pH：7.2～7.4。
从上述表2中抑菌活性分析结果可以看出，本发明的Bacillusamyloliquefaciens MBRC1菌株在不同的发酵培养基中进行培养，均可产生较强的抑菌活性物质，且对3种指示菌都有较明显的抑菌作用。因此，本发明的菌株在抗菌药物方面具有潜在的应用前景。
本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (5)

1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)MBRC1菌株，其特征在于，所述菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2014015；所述菌株的16SrRNA序列如SEQ.NO 1所示。
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)MBRC1菌株，其特征在于，所述菌株具有抗菌活性。
3.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)MBRC1菌株，其特征在于，所述菌株采用海水配制的培养基进行培养。
4.一种如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)MBRC1菌株的应用，其特征在于，所述菌株在制备抗菌药物中的应用。
5.一种如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)MBRC1菌株的应用，其特征在于，所述菌株用于制备食品的防腐剂。
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