CN102604864A - 一种微生物杀菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株抑菌强、杀菌谱广的拮抗菌株解淀粉芽孢杆菌，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类学命名为：解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens ，保藏编号CGMCCNo.4777。本发明解淀粉芽孢杆菌抑菌强、杀菌谱广，对稻瘟病菌、番茄灰霉病菌和辣椒疫霉病菌的抑制率高达93.5%以上；该解淀粉芽孢杆菌还具有很强的抗逆性，对酸碱具有很强的抗性，适合作为微生物杀菌剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物杀菌剂及其应用，属于微生物农药技术领域。
背景技术
生物农药是指利用生物活体或其代谢产物针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂。微生物农药是指由微生物及其代谢产物加工而成的具有杀虫、杀菌、除草、杀鼠或调节植物生长等具有农药活性的物质。微生物农药防治病虫害效果好，对人畜无毒，不污染环境，无残留，能保持农产品的优良品质，对害虫天敌和有益生物安全，有助于保持生态平衡，原料主要为农副产品，来源广泛，生产过程安全。其品质可通过现代生物技术对发酵工艺和菌种纯化、改良、基因重组得到改进和提高。微生物杀菌剂包括农用抗生素和抗病微生物，是生物农药研究的重要内容。抗病微生物可通过抗生、竞争、溶菌等作用来抑制、甚至杀灭病原微生物。
在生物防治逐渐成为植物病害防治研究热点的今天，细菌作为自然界中分布最为广泛的一类微生物，以其繁殖速度快、适应能力强、易于培养等优势，受到微生物工作者越来越多的关注。由于细菌的种类多，数量大，繁殖迅速，在占领空间及生存竞争方面占绝对优势，故此在自然界大量存在，并且在农业生态系统中作为植物根际及地上部分微生物群落的重要成员，不少细菌具有防病作用，有些类群能促进植物生长，某些菌株兼具防病和促生效果。
中国是农业大国，病虫草害的防治是农业生产中的重要环节，目前对农作物病害防治仍主要依靠化学杀菌剂，但随着科学技术发展，研究发现化学农药在防治病害的同时，对环境的污染越来越严重，同时化学农药往往毒性高，杀伤天敌，破坏生物多样性，为更严重的病虫害猖獗发生提供了条件，造成病虫害防治上的恶性循环。连续用药造成的农药残留对人体产生危害以及病原菌抗药性正引起人们极大的关注。农植物病虫害的化学防治与保护生态环境，保障人民健康形成的矛盾越来越引起关注。微生物农药对人畜安全，易于分解，与环境相容，被誉为“无公害”农药。此外，微生物农药还具有研究周期短、投入低、易于工业化和商品化开发的优势。自上个世纪90年代以来，微生物农药每年以20%速度递增，已经成为农业生物技术产业中的研究开发热点。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株抑菌强、杀菌谱广的拮抗菌株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。
本发明的目的之二是提供含有上述解淀粉芽孢杆菌的微生物杀菌剂。
本发明的目的之三是提供含有上述解淀粉芽孢杆菌的拮抗细菌发酵液的制备方法。
本发明的目的之四是提供上述解淀粉芽孢杆菌在防治农作物真菌中的应用。
本发明实现过程如下：
发明人从陕西秦岭山脉筛选到一株对水稻稻瘟病和番茄灰霉病等多种病原真菌具有很好毒杀功能的解淀粉芽孢杆菌。该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类学命名为：解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期2011年4月21日；保藏中心登记入册编号：CGMCC No.4777。
本发明解淀粉芽孢杆菌菌体呈杆状，单生，周生鞭毛，产芽孢，革兰氏染色呈阳性；在LB培养基上解淀粉芽孢杆菌菌落呈圆形，表面有明显光泽，不光滑；边缘不规则，有扩散，表面褶皱；菌落呈乳白色，不透明，沉淀、浑浊；具有一定的粘附性。培养前期菌落呈无色透明液滴，有光泽；后期呈白色不透明状，较为暗淡，菌体杆状，0.4~2.9um×1.1~11um，单生或双生，周生鞭毛，芽孢卵圆。
含有解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括下述步骤，
（1）固体培养基的制备：取黄豆饼粉3-4g，葡萄糖10g，K2HPO45.3g，琼脂17-20g，水1g，加热熔化，调pH至6.5，过滤，灭菌，冷却得固体培养基；
（2）菌落的制备：将解淀粉芽孢杆菌1-5mg接种于上述固体培养基中在31℃下培养48小时，得菌落；
（3）制作培养液：取淀粉20g，蛋白胨20g，NaCl 5.0g，水1g，加热熔化，调pH至7.2，过滤，灭菌，冷却得培养液；
（4）种子液的制备：取单菌落接种于培养液内，32℃培养48h，制成种子液；
（5）解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备：取种子液16mg接种于培养液中，32℃培养48h即可。
本发明筛选得到的解淀粉芽孢杆菌抑菌强、杀菌谱广，该菌株对稻瘟病菌、番茄灰霉病菌、梨黑星病菌、苹果腐烂病菌、辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、苹果轮纹病菌、苹果霉心病菌和杨树溃疡病菌等10多种病原真菌具有很强的拮抗作用，杀菌谱广，其中对稻瘟病菌、番茄灰霉病菌和辣椒疫霉病菌的抑制率高达93.5%以上。此外，该解淀粉芽孢杆菌具有很强的抗逆性，对酸碱具有很强的抗性，在80℃以上高温下依然能够存活，菌株生长迅速，容易培养，非常适合作为微生物杀菌剂。
具体实施方式
实施例1 拮抗菌株的单孢分离
选择杀菌谱广且拮抗性较好的菌株进行单孢分离，具体步骤如下：
（1）制作培养基平板；
（2）将菌株（不带培养基）加入到10ml的无菌水中制成1：10的菌悬液，充分振荡10分钟，然后取出1ml加入9ml无菌水中制成10-2的菌悬液，依此类推，制成10-3、10-4、10-5、10-6的菌悬液；
（3）用移液枪分别取稀释后的菌悬液0.5ml加到培养基平板上，用刮刀涂均匀，每处理设3个重复。30℃培养7h；
（4）选取出现5-20个菌落的皿，给菌落编号，分别将单孢菌落挑入LB斜面上培养3d后放入4℃保藏箱并保存。
用生长速率法测定每个单孢菌的发酵滤液的拮抗性，选出拮抗性最好的菌株作为目标菌株。单孢菌的拮抗筛选获得一株抑菌强、杀菌谱广的拮抗菌株解淀粉芽孢杆菌。
该解淀粉芽孢杆菌对稻瘟病菌、番茄灰霉病菌、梨黑星病菌、苹果腐烂病菌、辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、苹果轮纹病菌、苹果霉心病菌和杨树溃疡病菌等10多种病原真菌具有很强的拮抗作用，杀菌谱广，其中对稻瘟病菌、番茄灰霉病菌和辣椒疫霉病菌的抑制率高达93.5%以上。此外，该解淀粉芽孢杆菌具有很强的抗逆性，对酸碱具有很强的抗性，在80℃以上高温下依然能够存活，菌株生长迅速，容易培养，非常适合作为微生物杀菌剂。
实施例2 拮抗细菌解淀粉芽孢杆菌EC50的测定
EC50即指半数有效浓度，是指引起50%试验生物产生某一特定反应，或是某反应指标被抑制一半时的浓度。
以稻瘟病为测定对象
1）培养稻瘟靶标菌，制备菌饼；
2）解淀粉芽孢杆菌液体发酵，过滤得上清液，稀释一系列浓度10ul/ml、20ul/ml、40ul/ml、80ul/ml、160ul/ml，每个浓度各取1.5ml，加入到13.5ml PDA制备带毒培养基，此时发酵液的浓度为1ul/ml、2ul/ml、4ul/ml、8ul/ml、16ul/ml；
3）移植菌饼于带毒培养基，同时取1.5ml无菌水作为对照，每个处理重复3次，在28℃下培养3天；
十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率；
将抑制率换成机率值，以浓度对数为横坐标，机率值为纵坐标，用作图法求出EC50，结果如表1所示。
以浓度对数为横坐标，机率值为纵坐标作图得出毒力曲线：Y=0.057x+5.551。可见，菌株的EC50在0~1ul/ml之间，当发酵液浓度为1ul/ml时，抑制率已达到73.1%。
实施例3 解淀粉芽孢杆菌对几种病原菌抑制作用
首先刮取病原菌孢子制成孢悬液，将孢悬液（1×106个/mL）与融化并冷却至45℃左右的PDA培养基混匀，制平板。挑取30℃活化培养24h的解淀粉芽孢杆菌点接于病原菌平板上，28℃培养72h，观测抑菌圈。也可将解淀粉芽孢杆菌和病原菌的排列成十字交叉排列（病原菌在十字的中央，解淀粉芽孢杆菌在十字的两端）。培养3~4天，观察抑菌圈大小。
解淀粉芽孢杆菌对稻瘟病、小麦赤霉病、番茄灰霉病、苹果腐烂病等10种真菌菌丝生长的抑制作用见表2。
从表2可以看出解淀粉芽孢杆菌对10种供试病原菌的菌丝生长都有显著的抑制作用。
实施例4 解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法
（1）固体培养基的制备：取黄豆饼粉3-4g，葡萄糖10g，K2HPO45.3g，琼脂17-20g，水1g，加热熔化，用1mol/L NaOH调pH至6.5；趁热用多层纱布过滤，分装至250mg的三角瓶中，并在三角瓶口塞上棉塞，然后包扎一层牛皮纸，将三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅内，1.05kg/cm2压力，121.3℃，20min湿热灭菌，待培养基温度降至50℃左右时，在洁净工作台上将培养基倒在培养皿中，冷却至室温得到固体培养基；
（2）菌落的制备：将解淀粉芽孢杆菌1-5mg接种于上述固体培养基中在31℃下培养48小时，得菌落；
（3）制作培养液：取淀粉20g，蛋白胨20g，NaCl 5.0g，水1g，加热熔化，用1mol/L NaOH调pH至7.2。趁热用多层纱布过滤，分装至250mg的三角瓶中，并在三角瓶口塞上棉塞，然后包扎一层牛皮纸。然后将三角瓶放入高压蒸汽灭菌锅内，1.05kg/cm2压力，121.3℃。20min湿热灭菌；待培养基温度降至50℃左右时，在洁净工作台上将培养基倒在培养皿中，冷却至室温得培养液；
（4）种子液的制备：取单菌落接种于培养液内，在32℃下200r·min-1摇床中培养48h，制成种子液；
（5）解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备：取上述方法制得的种子液16mg接种于培养液中，在32℃下200r·min-1的摇床中培养48h，制成发酵液。
实施例5 含有解淀粉芽孢杆菌微生物杀菌剂的制备方法
（1）培养基
培养基中的营养源采用碳源和氮源。其中碳源可为淀粉、糊精、葡萄糖等；氮源可为蛋白胨、黄豆饼粉、牛肉膏、玉米浆等，在此基础上再添加一些其它营养成分，如食盐、磷酸盐、钾盐、钙盐等；
（2）培养方法
本发明所述的微生物杀菌剂可通过液体深层发酵方法培养；
（3）产品后处理
培养液调制成一定的含孢量，再添加适量的防腐剂、乳化剂及紫外保护剂等即为产品，例如：
取淀粉30克、NNO萘磺酸甲醛缩合物2g、K2CO31.5g、MF甲基萘磺酸盐甲醛缩合物10g混合均匀，经粉碎后过筛得助剂填料，再将实施例4的解淀粉芽孢杆菌发酵液30g与粉碎后的助剂填料混合均匀即可。
取淀粉30g、NNO萘磺酸甲醛缩合物4g、K2CO3 1.5g、MF甲基奈磺酸盐甲醛缩合物8g混合均匀，经粉碎后过筛得助剂填料，再将实施例4的解淀粉芽孢杆菌发酵液30g与粉碎后的助剂填料混合均匀即可。
取淀粉20g、NNO萘磺酸甲醛缩合物2g、K2CO3 1g、MF甲基奈磺酸盐甲醛缩合物6g混合均匀，经粉碎后过筛得助剂填料，再将实施例4的解淀粉芽孢杆菌发酵液40g与粉碎后的助剂填料混合均匀即可。
取淀粉40g、NNO萘磺酸甲醛缩合物4g、K2CO3 3g、MF甲基奈磺酸盐甲醛缩合物4g混合均匀，经粉碎后过筛得助剂填料，再将实施例4的解淀粉芽孢杆菌发酵液20g与粉碎后的助剂填料混合均匀即可。
取淀粉50g、NNO萘磺酸甲醛缩合物6g、K2CO3 4g、MF甲基奈磺酸盐甲醛缩合物20g混合均匀，经粉碎后过筛得助剂填料，再将实施例4的解淀粉芽孢杆菌发酵液50g与粉碎后的助剂填料混合均匀即可。
取淀粉10g、NNO萘磺酸甲醛缩合物1g、K2CO3 1g、MF甲基萘磺酸盐甲醛缩合物3g混合均匀，经粉碎后过筛得助剂填料，再将实施例4的解淀粉芽孢杆菌发酵液10g与粉碎后的助剂填料混合均匀即可。
Claims (6)
1.一株具有抑菌作用的解淀粉芽孢杆菌，其分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.4777。
2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于该菌株具有以下特性：菌体呈杆状，单生，周生鞭毛，产芽孢，革兰氏染色呈阳性；在LB培养基上菌落呈圆形，表面有明显光泽，不光滑，边缘不规则，有扩散，表面褶皱；菌落呈乳白色，不透明，沉淀、浑浊，具有粘附性；培养前期菌落呈无色透明液滴，有光泽，后期呈白色不透明状，暗淡，菌体杆状，单生或双生，周生鞭毛，芽孢卵圆。
3.含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的微生物杀菌剂。
4.含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌的发酵液。
5.权利要求4所述含解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法，包括下述步骤，
（1）固体培养基的制备：取黄豆饼粉3-4g，葡萄糖10g，K2HPO45.3g，琼脂17-20g，水1g，加热熔化，调pH至6.5，过滤，灭菌，冷却得固体培养基；
（2）菌落的制备：将解淀粉芽孢杆菌1-5mg接种于上述固体培养基中在31℃培养48小时，得菌落；
（3）制作培养液：取淀粉20g，蛋白胨20g，NaCl 5.0g，水1g，加热熔化，调pH至7.2，过滤，灭菌，冷却得培养液；
（4）种子液的制备：取单菌落接种于培养液内，32℃培养48h，制成种子液；
（5）解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备：取种子液16mg接种于培养液中，32℃培养48h即可。
6.权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌在防治作物真菌中的应用。
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Denomination of invention: Microbial bactericide and application thereof Effective date of registration: 20191210 Granted publication date: 20130605 Pledgee: Xi'an innovation financing Company limited by guarantee Pledgor: Shanxi Xiannong Biology Science Co.,Ltd. Registration number: Y2019990000680 |
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Date of cancellation: 20220302 Granted publication date: 20130605 Pledgee: Xi'an innovation financing Company limited by guarantee Pledgor: SHAANXI XIANNONG BIOLOGY SCIENCE CO.,LTD. Registration number: Y2019990000680 |
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