CN101525633B - 一种乳杆菌产抗植物致病真菌发酵液的制备方法 - Google Patents

一种乳杆菌产抗植物致病真菌发酵液的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种乳杆菌产抗植物致病真菌发酵液的制备方法，步骤是(1)种子发酵液的制备：用MRS液体培养基将乳杆菌菌株活化1-2次后，接种于三角瓶中，35～40℃恒温静置厌氧培养24～48h，成为种子发酵液；(2)发酵物的制备：在装有发酵培养基和中和剂发酵罐中按照10％的体积比接入上述种子发酵液进行发酵，培养方式为分批补料发酵培养，35～39℃静置厌氧培养40～60h，控制pH值在6.4～6.7，发酵结束后，即可获得发酵物；(3)发酵液成品的制备：将发酵物过滤，去除细胞，即得到该乳杆菌的发酵液。本发明能够稳定地获得乳杆菌发酵物，该乳杆菌发酵液具有较高的生物量和抗植物致病真菌活性，可用于制备防治植物真菌病害杀菌剂，为天然生物农药的开发提供了新的资源。

Description

一种乳杆菌产抗植物致病真菌发酵液的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及乳杆菌，尤其是一种乳杆菌产抗植物致病真菌发酵液的制备方法。
背景技术
在世界范围内，农业生产每年因病虫草害造成巨大损失，其中由真菌引起的病害占80％。长期以来，人们主要采用化学农药来控制农作物的病虫草害以保证农作物的稳产和高产。但化学农药的大量使用，不仅给土壤、水体和大气带来了污染，而且，农副产品中化学农药的残留，将直接危害人类的健康及生存；同时，由于化学农药的长期、大量和反复使用，越来越多的植物病原真菌对化学合成抗真菌剂和抗生素产生了抗性。因此，开发新型的、天然的抗真菌剂非常必要。
乳杆菌与人类的生活关系密切，无论在食品发酵，还是在工业乳酸发酵以及医疗保健领域，乳杆菌的菌株都被广泛应用。
我们发现乳杆菌能产生多种代谢产物，这些代谢产物不仅具有多种化学结构，而且在农业以及食品工业上具有广泛的生物活性如较强的抗植物致病真菌活力，为天然生物农药的开发提供了新的资源。目前，对乳杆菌产抗植物致病真菌活性物质的发酵条件和发酵物应用的相关技术和方法的文献或专利未见报道。
发明内容：
本发明的目的是针对乳杆菌(Latobacillus)产抗真菌活性物质的属性，分别以四种乳杆菌为出发菌株，提供上述乳杆菌产抗植物致病真菌发酵液的制备方法。
本发明实现目的的技术方案是：
一种乳杆菌产抗植物致病真菌发酵液的制备方法，其制备方法的步骤是：
(1)种子发酵液的制备：用MRS液体培养基将乳杆菌菌株活化1-2次后，接种于三角瓶中，35～40℃恒温静置厌氧培养24～48h，成为种子发酵液；
(2)发酵物的制备：在装有发酵培养基和中和剂发酵罐中按照10％的体积比接入上述种子发酵液进行发酵，培养方式为分批补料发酵培养，35～39℃静置厌氧培养40～60h，控制pH值在6.4～6.7，发酵结束后，即可获得发酵物；
(3)发酵液成品的制备：将发酵物过滤，去除细胞，即得到该乳杆菌的发酵液。
而且，所述乳杆菌菌株包括如下四种，这四种乳杆菌均保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，名称及保藏编号分别为：植物乳杆菌CGMCC 1.119；干酪乳杆菌CGMCC 1.62；发酵乳杆菌CGMCC1.2133；嗜酸乳杆菌CGMCC 1.2686。
而且，所述的MRS培养基的构成为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，吐温-80 1ml，柠檬酸三铵2g，K2HPO4 2g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，MgSO4·7H2O 0.1g，MnSO4 0.05g，水1.0L，其pH为6.4～6.7。
而且，所述的发酵培养基的构成为：豆饼粉水解液100ml，玉米浆粉10.0g，葡萄糖6.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，K2HPO4，MnSO4 50ppm，水1.0L，pH6.4～6.7。
而且，所述的豆饼粉水解液是将20.0g豆饼粉溶解于100ml水中后，加入10mg活力单位为2×105U/g的中性蛋白酶，45℃水浴1h得到的。
而且，所述的中和剂为Ca(OH)2，是控制发酵液pH值的中和剂。
而且，所述的分批补料发酵培养方式为：每12h补加50ml 1000g/L的葡萄糖一次。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明所涉及的乳杆菌产抗植物致病真菌发酵液的制备方法，工艺简单，生产成本相对较低，能够用于批量生产。
2、本发明能够稳定地获得乳杆菌发酵物，该乳杆菌发酵液具有较高的生物量和抗植物致病真菌活性，可用于制备防治植物真菌病害杀菌剂，为天然生物农药的开发提供了新的资源。
具体实施方式
以下将本发明的内容通过下列的较优的实施例作进一步的阐述，但这些实施例并不限制本发明的保护范围。
本发明所涉及的乳杆菌包括如下四种，这四种乳杆菌均保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，名称及保藏编号分别为：植物乳杆菌CGMCC 1.119；干酪乳杆菌CGMCC 1.62；发酵乳杆菌CGMCC1.2133；嗜酸乳杆菌CGMCC 1.2686。
由于本发明所涉及的四种乳杆菌的发酵工艺基本相同，只是抑菌活性有差异，因此，本发明的实施例以植物乳杆菌(CGMCC 1.119)为例进行叙述，其他乳杆菌不再叙述。
实施例1：
一种乳杆菌产抗植物致病真菌发酵液的制备方法，制备方法的步骤是：
(1)种子发酵液的制备：用MRS液体培养基将植物乳杆菌菌株活化两次后，接种于250ml三角瓶中，每瓶装液量100ml，37℃恒温静置厌氧培养24～48h，成为种子发酵液。
本步骤中，所述的MRS培养基的构成为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，吐温-80 1ml，柠檬酸三铵2g，K2HPO4 2g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，MgSO4·7H2O 0.1g，MnSO4 0.05g，水1.0L，其pH为6.4～6.7。
(2)发酵物的制备：在装有5L发酵培养基和用于控制发酵液pH值的中和剂的7L发酵罐中按照10％的体积比接入上述种子发酵液进行发酵，每12h补加50ml 1000g/L的葡萄糖一次，37℃静置厌氧培养48h，控制pH值在6.4～6.7。发酵结束后，即可获得发酵物。
本步骤中，发酵培养基的构成为：豆饼粉水解液100ml，玉米浆粉10.0g，葡萄糖6.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，K2HPO4，MnSO4 50ppm，水1.0L，pH6.4～6.7。其中，豆饼粉水解液是将20.0g豆饼粉溶解于100ml水中后，加入10mg活力单位为2×105U/g的中性蛋白酶，45℃水浴1h得到的。
本步骤中，所述控制发酵液pH值的中和剂为：Ca(OH)2。
(3)发酵液成品的制备：将发酵物过滤，去除细胞，即得到该乳杆菌的发酵液。
实施例2：
只是在步骤2中的37℃静置厌氧培养48h改变为39℃静置厌氧培养48h。其他均同于实施例1。
下面通过本发明制备方法所制备的四种乳杆菌发酵液，分别进行离体抑菌试验(生长速率抑制法)：
(1)将得到的四种乳杆菌的发酵液分别在14000r/min、4℃离心10min，分别收集四种乳杆菌的上清液。
(2)在融化的9ml PDA培养基中分别加入1ml的上述四种上清液，将得到的10ml培养基倒入直径9.0cm的灭菌培养皿内，制成平板，以加无菌培养基的PDA为对照。从培养3～6d的植物病原真菌菌落边缘，用打孔器切成直径5mm的菌块，置于平板中央，于24℃培养箱培养6d，测量病原菌菌落直径。
(3)将上述四种乳杆菌发酵物上清液，分别在100～200ml(发酵液)/L对番茄早疫菌、番茄灰霉、黄瓜疫霉菌、甜瓜枯萎菌、苹果炭疽菌的菌丝生长均有较强的抑制作用，抑制率在40～100％。
抑菌率如下表所示。
Figure G2009100684537D00041
通过上述表格所显示的抑菌率，得出如下结论：
(1)所得到的四种乳杆菌的发酵液均具有广泛的生物活性如较强的抑菌活力。
(2)所得到的四种乳杆菌的发酵液在制备用于防治甜瓜疫霉等真菌病害的杀菌剂方面有较好的应用前景。

Claims (4)

1.一种乳杆菌产抗植物致病真菌发酵液的制备方法，其特征在于：制备方法的步骤是：
(1)种子发酵液的制备：用MRS液体培养基将乳杆菌菌株活化1-2次后，接种于三角瓶中，35～40℃恒温静置厌氧培养24～48h，成为种子发酵液；
(2)发酵物的制备：在装有发酵培养基和中和剂发酵罐中按照10％的体积比接入上述种子发酵液进行发酵，培养方式为分批补料发酵培养，35～39℃静置厌氧培养40～60h，控制pH值在6.4～6.7，发酵结束后，即可获得发酵物；
(3)发酵液成品的制备：将发酵物过滤，去除细胞，即得到该乳杆菌的发酵液；
所述的MRS培养基的构成为：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，吐温-80 1ml，柠檬酸三铵2g，K2HPO4 2g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，MgSO4·7H2O 0.1g，MnSO4 0.05g，水1.0L，其pH为6.4～6.7；
所述的发酵培养基的构成为：豆饼粉水解液100ml，玉米浆粉10.0g，葡萄糖6.0g，MgSO4·7H2O 1.0g，K2HPO4，MnSO4 50ppm，水1.0L，pH6.4～6.7；
所述的中和剂为Ca(OH)2，是控制发酵液pH值的中和剂。
2.根据权利要求1所述的一种乳杆菌产抗植物致病真菌发酵液的制备方法，其特征在于：所述乳杆菌菌株包括如下四种，这四种乳杆菌均保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，名称及保藏编号分别为：植物乳杆菌CGMCC 1.119；干酪乳杆菌CGMCC 1.62；发酵乳杆菌CGMCC 1.2133；嗜酸乳杆菌CGMCC 1.2686。
3.根据权利要求1所述的一种乳杆菌产抗植物致病真菌发酵液的制备方法，其特征在于：所述的豆饼粉水解液是将20.0g豆饼粉溶解于100ml水中后，加入10mg活力单位为2×105U/g的中性蛋白酶，45℃水浴1h得到的。
4.根据权利要求1所述的一种乳杆菌产抗植物致病真菌发酵液的制备方法，其特征在于：所述的分批补料发酵培养方式为：每12h补加50ml1000g/L的葡萄糖一次。
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