CN103865805B - 发酵黑曲霉抑制烟草青枯病菌的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用发酵拮抗菌对烟草青枯病进行防治，所述拮抗菌为黑曲霉(Aspergillus？niger？xj)：由贵州大学真菌资源研究所分离，现保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCCNO：M206021。利用本发明所述的发酵黑曲霉(Aspergillus？niger？xj)可有效地防治烟草青枯病。

Description

发酵黑曲霉抑制烟草青枯病菌的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及黑曲霉(Aspergillusnigerxj)在抑制烟草青枯病菌方面的用途。

背景技术

烟草青枯病是一类重要的烟草土传病害，它通常浸染烟草根部，引起作物根部乃至全株的病害，造成重大的经济损失。烟草青枯病使用一种由布可氏杆菌(Ralstoniasolanacearum)引起的系统性浸染病，烟株一旦染病往往造成整株死亡，其危害往往是毁灭性的，因此常常给烟草生产造成重大经济损失。烟草青枯病原菌主要随植物残体遗落于土壤中越冬，也能在种子内货田间其它寄主体内越冬，带菌的土壤、病残组织和含有病菌的有机肥料等是该病的主要初染源，病害的传播主要靠灌溉水、雨水、带病苗、农具、病土以及人畜的活动等。

目前生产上主要采用抗病品种和作物轮作等农业措施来防治烟草土传病害病，但是由于抗病品种需要抗病基因多样化，并且受环境的影响比较大，防治效果不理想。作物轮作也是防治烟草青枯病的有效方法之一，但是由于我国人多地少，生产中正常的轮作措施无法实现。植物病理学家认为植物发病与寄主、病原菌和环境这三个因素有密切关系，当病原菌与易感寄主相遇在适宜的环境中，植物就开始发病，如果修改货根除这三者中的任何一个，就可以减轻或控制植物病害。

大量研究表明，烟田土壤中不仅存在引起烟草病害的微生物而且也存在多种多样的非致病性的、提高烟草生命力的有益微生物，因而

烟草的生物防治以及生态防治日益受到重视。生物防治措施是利用有益微生物降低植物病原菌对植物的危害，生态防治这是通过想土壤中引入拮抗微生物、培肥土壤和提高土壤中生物多样性等措施，进而使土壤微生态达到平衡，最终通过土壤中不同生物之间的拮抗与竞争实现对土壤病害的防治。

黑曲霉是一种常见的真菌，属于半知类曲霉属。黑曲霉可以广泛用于加工蛋白制品，饲料加工和废物处理。本申请是利用黑曲霉在生长过程中所产生的次生代谢产物来对烟草青枯病菌进行抑制。现有技术中有通过黑曲霉防治烟草情况病的实例，如中国专利CN103146600A公开了利用黑曲霉(Aspergillusniger)Ty-3防治烟草青枯病。但该申请在病原菌分离以及真菌培养条件方面描述并不清楚，如烟草青枯病菌为细菌，为单菌落，不可能长出菌丝，而且细菌的种子培养基一般为NA或NB，培养条件偏碱性，而真菌的种子培养基一般为PDA，培养条件偏酸性。因此，上述文献中培养细菌的成分和条件来培养真菌并不合适。黑曲霉虽然是FDA公认的制酶安全菌种，但黑曲霉活体应用于田间的安全性是值得考虑和推敲的。黑曲霉也是一些植物病害的病原菌，如黑曲霉引起的剑麻茎腐病是一种毁灭性病害，对我国的剑麻产业造成极大的威胁。因此，将黑曲霉活体应用到田间是有风险的，但它所蕴含的代谢产物又是值得我们去开发应用的。考虑到田间的安全因素，我们采用的主要是黑曲霉产生的抗菌物质，即将发酵后的发酵液高温灭菌，而不是活体应用。对比文件，虽然也是使用发酵产物，但没有杀灭黑曲霉活体，这样施加于田间，大大增加了田间风险。此外，烟农烤制烤烟后时极易将黑曲霉带入贮藏间，而黑曲霉污染是导致烤烟变质发霉的主要因素。因此，施用活体菌液对烤烟的后期制作是极其危险的！

综上所述，考虑到田间安全及烤烟烤制后安全贮藏等诸多因素，我们采用灭过菌的黑曲霉发酵液，在抑制青枯菌的同时，降低田间与烤烟贮藏风险。

本发明人目的在于提供一种易于生产、剂型加工，又利于存活、的拮抗菌，将其发酵代谢产物灭菌后用于烟草青枯病的防治，对环境安全、友好。所述拮抗菌为黑曲霉(Aspergillusnigerxj)由贵州大学真菌资源研究所分离，已经于2006年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCCNO：M206021。

发明内容

本发明目的是防治利用发酵的黑曲霉防治烟草青枯病。

为了实现上述目的，本发明提供了一种拮抗菌，所述拮抗菌为黑曲霉(Aspergillusnigerxj)由贵州大学真菌资源研究所分离，已经于2006年3月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCCNO：M206021。

本发明防治烟草青枯病拮抗菌的筛选方法，包括以下步骤：

1)病原菌的分离：

稀释划线分离：将病株基部的茎杆表面用清水洗净风干，再用75％的酒精擦拭，迅速过火烧尽酒精，用消过毒的解剖刀剥去表面皮层，反复刮取褐色部位组织，将刮下的碎末置于无菌培养皿中，滴入两滴无菌水，用无菌玻棒捣碎碎末，静置5min后取菌液在NA上划线，30℃培养48h。

溢菌分离：将病株基部的茎杆两端用清水洗净晾干，再用75％的酒精擦拭，迅速过火烧尽酒精，用消过毒的解剖刀削平茎杆两端，将下端插入盛有灭菌水的三角瓶中，罩上无菌烧杯，室温条件下放置，待有菌脓从端部溢出后，用接种环蘸取少量菌脓在NA平板上划线，30℃培养48h。

2)病原菌致病性鉴定

使用叶腋针刺接种法接种：用无菌的注射针头从烟草植株顶端向下数第三张完全展开的叶片叶腋处刺入茎内维管束部位注入0.2mL细菌悬液，然后抽出注射针，用消毒脱脂棉花沾菌液覆盖注射部位，再用一片消毒脱脂棉包住保湿48h，设5个重复，每个重复5株，用无菌水做对照，保持30℃温室，10d后观察发病情况。

3)抗菌作用测定

制备烟草青枯病病原菌悬液，并将菌悬液与LB培养基混和，采用滤纸片扩散法对发酵液抗菌活性进行测定。

4)抑菌条件优化

先通过单因素实验确定出两种最佳碳源和氮源，即可溶性淀粉、果糖，蛋白胨及牛肉膏。其次是根据单因素筛选的结果进行L3⁴的正交实验，得出碳氮最佳组合：2wt％的淀粉、3wt％的果糖、4wt％的蛋白胨、2wt％牛肉膏。然后在此基础上分别对接种量、温度和初始pH进行筛选，即确定出最佳接种量、温度和起始pH为分别为10％(v/v)、25℃和6。最后得出2wt％的淀粉、3wt％的果糖、4wt％的蛋白胨、2wt％牛肉膏、pH为6，10％(v/v)的接种量和25℃温度为黑曲霉抑菌成分发酵最优条件，对烟草青枯病菌的抑菌圈直径为29.8mm。

附图说明

图1是发酵液对温度的稳定性实验结果，其中横坐标为处理温度(℃)，纵坐标为抑菌直径(mm)。

图2是发酵液对紫外光的稳定性实验结果，其中其中横坐标为光照时间(h)，纵坐标为抑菌直径(mm)。

具体实施方式

本发明根据下述实施例做进一步的描述，本领域技术人员可以明了的是，下述实施例对本发明仅仅起到说明的作用。在不背离本发明精神的前提下，对本发明所做的任意改进和替代均在本发明保护的范围之内。

实施例1：病原菌的分离

将分离得到的菌株分别在NA培养基和TTC培养基上进行人工培养，观察其细菌形态，其中有若干分离株在NA培养基上单菌落为小圆形，稍隆起，白色稀汤状有光泽，与青枯菌在NA培养基上生长形态描述一致；若干分离株在TTC培养基上的菌落中央呈粉红色，周围白色流动性较强，与青枯菌在TTC培养基上生长形态描述一致。

实施例2：致病性鉴定

菌株从无菌水中移至NA斜面培养基上，培养48小时，加无菌水悬浮，倒入装有NA培养液的三角瓶里，经30℃恒温摇床180r/min震荡培养48h，用无菌水稀释成1x10⁸cfu/mL的细菌悬浮液。

使用叶腋针刺接种法接种：用无菌的注射针头从烟草植株顶端向下数第三张完全展开的叶片叶腋处刺入茎内维管束部位注入0.2mL细菌悬液，然后抽出注射针，用消毒脱脂棉花沾菌液覆盖注射部位，再用一片消毒脱脂棉包住保湿48h，设5个重复，每个重复5株，用无菌水做对照，30℃温室诱导发病。分离菌株用叶腋针刺接种法接种云烟87，若干分离株使烟苗茎部明显变褐，叶片上出现水渍状黄化斑，叶片萎蔫，后期整株枯死。

实施例3：抗菌作用测定：

培养方法：

实验用菌株：黑曲霉(Aspergillusnigerxj)：由贵州大学真菌资源研究所分离，现保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号：CCTCCNO：M206021。

烟草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)：保存于贵州大学生命科学学院微生物实验室。

PDA斜面培养基：马铃薯200g切块，用水煮沸30min，过滤取汁，加葡萄糖20g，琼脂20g，水补足1000mL，pH自然。灭菌条件：121℃，30min(以下灭菌条件与此相同)。

LB培养基(Luria-Bertan培养基)：胰蛋白胨1％，NaC10.5％，酵母膏1％，pH7.2。灭菌。

烟草青枯病菌培养方法：无菌条件下，将烟草青枯病菌接种于LB培养基斜面的试管中，32℃培养18-20h。用接种环挑取菌苔表面3-5环移种到装有4mL的LB液体培养基试管内，35℃培养2-6h，用生理盐水稀释到0.5麦氏比浊度，约含1×108-2×108cfu/mL。

发酵黑曲霉培养方法：将xj菌株转接于试管斜面，27℃培养4-5d，用无菌吐温生理盐水将孢子洗下，转入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，振荡，充分打散孢子，用4层无菌孢子纸过滤除去菌丝，制成106孢子/mL的孢子悬液。取制好的孢子悬液，以2％(v/v)接入到PDA液体培养基中，28℃、150r/min条件下，进行摇床发酵培养3d，作为种子液备用。将制备好的种子液，以10％(v/v)的接种量添加到发酵培养基中(装液量为50mL/250mL)，调整起始pH为6，25℃、150r/min条件下，进行摇床发酵培养5天。

抗菌活性测定：

(1)指示菌平板的制备

将制备的烟草青枯病菌密度为1×10⁸-2×10⁸cfu/mL的菌悬液吸取200μL菌悬液注入平皿中，并倒入10mL冷却至50℃左右的LB培养基充分混匀。

(2)抗菌活性的测定

以烟草青枯病菌为指示菌，采用滤纸片扩散法对发酵液抗菌活性进行测定，活性大小以抑菌圈直径(mm)表示。以未接种孢子悬液培养的无菌发酵培养基为空白对照。将待测样品在紫外光下照射30min，吸取20μL于无菌圆滤纸片(直径6mm)上，在酒精灯前略微干燥，轻轻放在指示菌平板上，35℃培养36h，观察并测定抑菌圈大小，用十字交叉法测量抑菌圈直径，取平均值为试验结果。以上步骤均按无菌要求操作，每个处理设6个平行，2个重复，以平均值报告。

实施例4：抑菌条件优化

4.1黑曲霉抑菌成分发酵条件优化

4.1.1单因素的筛选

(1)碳源的筛选

以3wt％的蛋白胨为基础氮源，分别加入2wt％的葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖，淀粉和甘油配制培养基，pH自然，接种量10％(v/v)，装液量20％(v/v)，25℃，150r/min，培养5天。

(2)氮源的筛选

以2wt％的葡萄糖为基础碳源，分别加入3wt％的牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、氯化铵、硝酸铵和脲素配制培养基，pH自然，接种量10％(v/v)，装液量20％(v/v)，25℃，150r/min，培养5天。

4.1.2L₃ ⁴正交试验

在单因素筛选的基础上取2个碳源(淀粉和果糖)，2个氮源(牛肉膏和蛋白胨)，分别在其原基础上下浮动1个单位。即碳源的第一水平为1wt％，第二水平为2wt％，第三水平为3wt％；氮源第一水平为2wt％，第二水平为3wt％，第三水平为4wt％。接种量10％(v/v)，装液量20％(v/v)，25℃，150r/min，培养5天。

4.1.3接种量的筛选

按淀粉2wt％，果糖3wt％，蛋白胨4wt％，牛肉膏2wt％配制培养基，接种量分别为5％(v/v)，10％(v/v)，15％(v/v)，20％(v/v)，装液量20％(v/v)，放入25℃的温箱中培养5天。

4.1.4温度的筛选

按淀粉2wt％，果糖3wt％，蛋白胨4wt％，牛肉膏2wt％配制培养基，接种量为10％(v/v)，装液量20％(v/v)，分别放入15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的温箱中培养5天。

4.1.5初始pH的研究

根据正交试验得出的最佳方案来配制培养基，即淀粉2wt％、果糖3wt％、蛋白胨4wt％、牛肉膏2wt％、装液量20％(v/v)，并把pH调为4、5、6、7、8、9进行pH的筛选，接种量为10％，25℃，150r/min，培养5天。

表1碳源对黑曲霉抑菌成分的影响

由表1可知，碳源对黑曲霉的生物活性的影响是很大的，从而选择黑曲霉菌丝球生长所需的碳源首先应考虑抑菌圈的大小，其次再考虑菌丝球生物量的大小。一般是选择抑菌圈大的，如果抑菌效果差不多的情况下，则选生物量大的。故最终选择的碳源是：淀粉和果糖。

表2氮源对黑曲霉抑菌成分的影响

由表2可见，氮源对黑曲霉的生物活性影响比较小，从而在选择黑曲霉菌丝球生长所需的氮源首先应考虑菌丝球生物量的大小，其次才考虑抑菌圈的大小。在生物量相似的条件下，主要考虑抑菌圈的大小，故最终选择的氮源是牛肉膏和蛋白胨。

表3L₃ ⁴的正交实验对黑曲霉抑菌成分的影响

由表3可知，A是可溶性性淀粉，B是果糖，C是蛋白胨，D是牛肉膏，由上表得淀粉对黑曲霉的抑菌效果的影响最大，果糖其次，牛肉膏对黑曲霉的影响最小，蛋白胨对黑曲霉的影响较牛肉膏大一些。上表再一次表明碳源对黑曲霉的影响要比氮源的要大得多，这一点跟前面的单因素筛选正好吻合。从正交试验表中，可以得到，A2，B3，C3，D1的效果最好。从极差的大小得到：淀粉的影响最大，果糖次之，再次是蛋白胨，最小是牛肉膏。从正交试验得出：淀粉2wt％，果糖3wt％，蛋白胨4wt％，牛肉膏2wt％为最佳方案。

表4接种量对黑曲霉抑菌成分的影响

由表4得黑曲霉的最适接种量为10％。

表5温度对黑曲霉抑菌成分的影响

由表5得黑曲霉发酵的最适温度为25℃。

表6初始pH对黑曲霉抑菌成分的影响

由表6得黑曲霉发酵的最适pH为6。

最后得出黑曲霉抗菌物质的最优发酵条件为：2wt％的淀粉、3wt％的果糖、4wt％的蛋白胨、2wt％牛肉膏，pH为6，10％的接种量(v/v)添加到发酵培养基中，装液量优选为50mL/250mL，25℃，150r/min，培养5天，发酵滤液对烟草青枯病菌的抑菌圈直径为29.8mm。

实施例5：防治烟草青枯病效果分析

(1)实施地点

2012年在毕节市黔西县对拮抗真菌进行小区浓度筛选实验。小区浓度筛选实验显示：拮抗真菌xj菌株的无菌发酵液5000倍稀释，相对防效为58.5％，优于化学药农药链霉素的防效(52.6％)，当无菌发酵液1000倍稀释(10^-3)，田间相对防效达到了86.8％，当无菌发酵液100倍稀释(10^-2)，田间相对防效达到了95.7％。可见，拮抗真菌xj菌株的防治效果突出，但从节约生产成本考虑，我们在进行大田推广时，仅发病严重的地块，采用100倍稀释，其余的采用1000倍稀释。

2013年在毕节市的大方县响水镇和七星关区燕子口镇进行拮抗菌的推广应用实验。在自然感病的情况下，拮抗真菌的防效都达到了90％以上。

(2)苗期施用方法

将黑曲霉xj发酵液灭菌后(无菌发酵液)与基质按1：10搅拌混匀，然后植苗，所述基质为烟草基质育苗标准YC/T310-2009中所用基质，另外，所述比例为：1ml发酵液加到10g基质中。

(3)大田施用方法

将无菌发酵液按比例1：100(体积比)与水冲兑后，采用灌根的方式进行田间施用2次，每株灌根20毫升。

(4)病情调查

病情指数的调查共分3次，第1次调查在大田移栽前，第2次和第3次调查分别在施药后7～14天。方法为每块试验地采用对角线取样，取5点，每点100株烟株，记录下烟株的为害级数，并计算病情指数。

病害分级标准按国家行业标准YC/T391996规定执行。

表7xj菌株发酵液的浓度梯度筛选

实施例6：与CN103146600A抑菌效果的对比

用无菌水洗出培养24h的青枯病的病原菌，制成菌悬液，吸取1mL的菌悬液于灭菌后的培养皿中，然后倒入45-50℃的NA培养基15mL，放置2h凝固后平板，将本发明发酵黑曲霉(Aspergillusnigerxj)点接或划单线接种在平板上培养，每种重复3皿，于32℃下培养2d后观察病原菌的生长情况，并测定其对病菌的抑菌斑或抑菌带的大小，经测定本发明的发酵黑曲霉(Aspergillusnigerxj)点接后对青枯病菌的抑菌斑直径为22mm，而抑菌带达到24mm。

实施例7：发酵液中抗菌物质稳定性研究

(1)发酵液中抗菌物质热稳定性的测定

将发酵液于40℃、60℃、80℃、100℃、121℃下分别处理0.5h后，以烟草青枯病菌作为指示菌，以室温(25℃)下不经处理的发酵原液作为对照，采用滤纸片扩散法测定其抑菌圈直径，根据抑菌圈直径变化情况确定发酵液中抗菌物质的热稳定性。

由图1可知，发酵液具有较强的热稳定性，与对照相比，即使发酵液在121℃下处理30min，其抗菌活性仍然保持稳定，经方差分析，并无显著性差异(P>0.05)。结果表明，xj-1菌株代谢合成的抗菌物质对热具有较好的稳定性。

(2)发酵液中抗菌物质紫外光稳定性的测定

将发酵液于15W紫外灯下，距离40cm，分别照射0.5h、1h、2h、4h、6h，以烟草青枯病菌作为指示菌，以室温下不经处理的发酵原液作为对照，采用滤纸片扩散法测定其抑菌圈直径，根据抑菌圈直径变化情况来确定发酵液中抗菌物质的紫外光稳定性。

由图2可知，发酵液具有较强的紫外光稳定性，与对照相比，即使发酵液在15W、距离40cm紫外光照6h后，其抑菌活性基本不变，方差分析并无显著性差异(P>0.05)。结果表明，在紫外光照的条件下发酵液能够很好地保持稳定的抑菌活性。

因为发酵代谢产物对温度及紫外都很稳定，因此，给制备和应用都带来了优势，制备只需要发酵后灭菌就可得到安全的制剂，直接应用于大田。

Claims (4)

1.黑曲霉在防治烟草青枯病方面的用途，所述黑曲霉(Aspergillusniger)xj，保藏号为CCTCCNO：M206021，并通过下述方法制备得到：将黑曲霉菌株培养，用无菌吐温生理盐水将孢子洗下，过滤除去菌丝，制成孢子悬液；将孢子悬液接入到培养基中，发酵培养，作为种子液；将制备好的种子液，添加到发酵培养基中进行发酵。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：当在苗期施用时，将所述黑曲霉发酵液灭菌后(无菌发酵液)与基质按1∶10搅拌混匀，然后植苗，所述基质为烟草基质育苗标准YC/T310-2009中所用基质。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：当在大田施用时，将无菌发酵液按比例1∶100与水冲兑后，采用灌根的方式进行田间施用。

4.根据权利要求3所述的用途，所述施用的次数为2次，每株灌根20毫升。