CN106754426A

CN106754426A - 一种棘孢木霉及其应用

Info

Publication number: CN106754426A
Application number: CN201710035544.5A
Authority: CN
Inventors: 颜坤; 赵世杰; 任承钢; 边兰星; 李萌; 陈小兵
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2017-01-17
Filing date: 2017-01-17
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2037-01-17
Also published as: CN106754426B

Abstract

本发明属于微生物和生物肥料领域，特别涉及一种棘孢木霉及其在防治苹果果树重茬病害中的应用。棘孢木霉为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)4A‑5，其以于2016年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13187。所述棘孢木霉在防治苹果果树重茬病害中的应用。本发明提供的棘孢木霉菌株来源于烟台苹果果园土壤，在微观形态和培养特性上有一定的特点，能适应当地果园环境。该菌株棘孢木霉菌株生长迅速，培养条件简单，对尖胞镰刀菌和腐皮镰刀菌有显著的抑制作用。该菌株能有效防治尖胞镰刀菌和腐皮镰刀菌引起的苹果幼苗重茬病害，而且环保无毒性。

Description

一种棘孢木霉及其应用

技术领域

本发明属于微生物和生物肥料领域，特别涉及一种棘孢木霉及其在防治苹果果树重茬病害中的应用。

背景技术

苹果重茬病害是一种连作障碍，即连续两茬种植苹果树的地块引起后茬果树发生的病害。苹果重茬病害抑制果树生长，影响果实产量和质量，在世界各个产区均有发生，造成了巨大的经济损失。

土壤病原真菌引起的土传病害是导致苹果重茬障碍最直接和最重要的原因[Mazzola M,Manici LM.Apple replant disease:role of microbial ecology in causeand control.Annu.Rev.Phytopathol.2012,50:45-65.]。为克服苹果果树重茬病害，可以采用作物间作、轮作或土壤消毒等措施。作物间作的效果不明显，而作物轮作所需周期长，影响种植收益。土壤消毒虽能杀灭病原菌，但采用氯化苦、溴甲烷等毒性药品，不仅成本高，而且污染环境。筛选拮抗菌株，配制生防菌剂，抑制土壤中病原菌的生长繁殖，防止病原菌侵染果树根系，是一种有效且环保的生物防治措施。

木霉菌是一种丝状真菌，属于半知菌亚门丛梗孢科，包含哈茨木霉、绿色木霉、康宁木霉、棘孢木霉和钩状木霉等菌种。木霉菌适应环境能力强，能有效拮抗多种病原菌，广泛应用于植物病害的防治。目前，相对于哈茨木霉和绿色木霉，棘孢木霉的相关专利和应用较少。专利“一种棘孢木霉菌株”公布号为CN103045483A，提供一种高效防治葡萄灰霉病的棘孢木霉菌株；专利“一株棘孢木霉及其应用”公布号为CN103184162A，提供一种能过防治棉花枯萎病等土传病害的棘孢木霉菌株；专利“一株棘孢木霉及其生物制剂和在防治黄瓜疫霉病中的应用”公布号为CN103289902A，提供一株分离自黄瓜根际土壤的棘孢木霉，该菌株对黄瓜疫霉病菌具有显著的寄生抑制作用；专利“一种新的棘孢木霉及其用途”公布号为CN105695334A，公开了一种棘孢木霉，其代谢产物具有抑制大肠杆菌、沙门氏菌的活性，可用于制备抗菌药物。因此，棘孢木霉也是一类重要的生防菌种，具有开发生物农药和菌肥的潜力。但是，目前仍未有在苹果果园土壤中分离获得棘孢木霉菌株的报道，也没有棘孢木霉应用于防治苹果重茬病害的专利。

烟台是我国苹果的主产区之一，苹果是烟台的传统优势产业。目前，烟台地区很多果园面临换茬更新，新茬果树存在重茬病害的风险。烟台当地果农主要通过深翻土壤以及增施有机肥等常规措施预防重茬病害，效果有限。因此，有必要从果园土壤中分离筛选生防菌株，应用于苹果重茬病害的防治，保障该地区苹果产业的稳定发展。

发明内容

为克服上述现有技术防治苹果果树重茬病害的缺点与不足，本发明的目的是一种棘孢木霉及其在防治苹果果树重茬病害中的应用。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种棘孢木霉，棘孢木霉为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)4A-5，其以于2016年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.13187。

所述棘孢木霉菌落生长迅速，28℃黑暗下培养3天可铺满整个直径为90mm的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板。菌落初期为白色，中心浅绿色，气生菌丝纤细、羊毛状，由中心向四周散布，菌落背面无色。菌落中期逐渐转变为浅绿色，中心呈深绿色，气生菌丝转变为棉絮状。菌落后期整体呈深绿色，棉絮状菌丝减少，菌落背面无色。分生孢子梗主枝呈树状，含多级分枝。初级分枝多为三束互生，离主枝顶端越近的初级分枝长度越短。部分主枝顶端有簇生的小梗，各级分枝的顶端形成三个簇生的小梗，小梗近似安瓿状，而各级分枝中部无簇生安瓿状小梗。分生孢子呈球形、椭球形或卵形。本发明所提供的棘孢木霉在马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基中28℃振荡(转速为150rpm)培养4天后，形成大量白色絮状菌丝，培养液变为无色。

一种棘孢木霉的应用，所述棘孢木霉在防治苹果果树重茬病害中的应用。

所述棘孢木霉或其生物制剂在制备防治苹果果树重茬致病菌拮抗制剂中的应用。

所述致病菌为镰刀菌。

所述镰刀菌为尖胞镰刀菌、腐皮镰刀菌。

本发明所具有的优点：

(1)本发明提供的棘孢木霉菌株来源于烟台苹果果园土壤，在其微观形态和培养特性上有一定的特点，生长迅速，能适应当地果园环境。

(2)本发明的棘孢木霉菌株生长迅速，培养条件简单，对尖胞镰刀菌和腐皮镰刀菌有显著的抑制作用。

(3)本发明的棘孢木霉生物制剂能有效防治尖胞镰刀菌和腐皮镰刀菌引起的苹果幼苗重茬病害，而且环保无毒性。

附图说明

图1为本发明实施例提供的棘孢木霉在PDA培养基上的菌落形态图。

图2为本发明实施例提供的棘孢木霉微观形态图。

图3A为本发明实施例提供的棘孢木霉与尖胞镰刀菌的平板对峙结果图。

图3B为本发明实施例提供的棘孢木霉与腐皮镰刀菌的平板对峙结果图。

具体实施方式：

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明菌株是在鉴定烟台苹果果园重茬病害致病菌的基础上，从果园土壤中分离筛选出有效拮抗致病菌的棘孢木霉，并利用该菌株制备生物菌剂，应用于果树重茬病害的防治。

实施例1：

烟台苹果园重茬病害致病菌的分离鉴定

(1)马丁氏培养基的配制：20g葡萄糖、5g蛋白胨、1g磷酸二氢钾、0.5g七水硫酸镁、3.3ml孟加拉红溶液(0.01g/ml)、18g琼脂加入1000ml水，121℃灭菌20分钟，分装入培养皿中冷却后贮存备用。

(2)PDA培养基的配制：称取200g马铃薯，洗净去皮切成小块，加水1000ml煮沸25分钟，纱布过滤，再加20g葡萄糖和18g琼脂，121℃灭菌20分钟，分装入培养皿中冷却后贮存备用。

(3)称取10g新鲜重茬苹果果园土壤样品加入含有90ml无菌水的三角瓶中。置摇床振荡20分钟左右，得到稀释倍数为10^-1的土壤稀释液；取1ml 10^-1土壤稀释液加入到盛有9ml无菌水的试管中，得到稀释倍数为10^-2的土壤稀释液，取300μl该稀释液涂布到步骤(1)制备得到的马丁氏培养基，重复3次，28℃培养3天。待长出真菌菌落后挑边缘菌丝转入步骤(2)制备得到的PDA固体培养基进行纯化，获得纯化菌株。

(4)收集纯化所得菌株的菌丝，CTAB法提取基因组DNA，通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，PCR产物测序，NCBI网站序列比对。结果表明，部分真菌为尖胞镰刀菌和腐皮镰刀菌，数量分别约为0.3×10⁴CFU/g和0.7×10⁴CFU/g。

实施例2：棘孢木霉的分离、纯化、分子鉴定、微生物学特性和保藏

(1)棘孢木霉的分离与纯化等同于实施例1的方法

(2)棘孢木霉的分子鉴定方法等同于实施例1。纯化的一株菌株与GenBank中Trichoderma asperellum isolate TA002(登陆号：KX092001.1)的同源性达100％，证明该菌株是棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，命名为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)4A-5。序列如下：

AACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGT

(3)棘孢木霉培养特性与微观形态(参见图1)：所述棘孢木霉菌落生长迅速，28℃黑暗下培养3天可铺满整个直径为90mm的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板。菌落初期为白色，中心浅绿色，气生菌丝纤细、羊毛状，由中心向四周散布，菌落背面无色。菌落中期逐渐转变为浅绿色，中心呈深绿色，气生菌丝转变为棉絮状。菌落后期整体呈深绿色，棉絮状菌丝减少，菌落背面无色。本发明所提供的棘孢木霉在马铃薯葡萄糖(PD)液体培养基中28℃振荡(转速为150rpm)培养4天后，形成大量白色絮状菌丝，培养液变为无色。如图2，分生孢子梗主枝呈树状，含多级分枝。初级分枝多为三束互生，离主枝顶端越近的初级分枝长度越短。部分主枝顶端有簇生的小梗，各级分枝的顶端形成三个簇生的小梗，小梗近似安瓿状，而各级分枝中部无簇生安瓿状小梗。分生孢子呈球形、椭球形或卵形。

(4)棘孢木霉的保藏：该菌株于2016年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13187。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

实施例3：对峙培养法确定棘孢木霉对镰刀菌的拮抗作用

(1)PDA培养基的制备同实施例1。

(2)棘孢木霉菌饼的制备：将棘孢木霉接种于PDA培养基平板活化培养3天后，用直径5mm的打孔器打孔制成菌饼。

(3)尖胞镰刀菌、腐皮镰刀菌菌饼的制备：将尖胞镰刀菌和腐皮镰刀菌分别接种于PDA培养基平板活化培养3天后，用直径5mm的打孔器打孔分别制成相应的菌饼。

(4)棘孢木霉拮抗活性测定：将步骤(2)制得的棘孢木霉菌饼分别和步骤(3)制得的镰刀菌菌饼同时接种到PDA培养基平板(培养皿直径9cm)，两者相距3cm，3次重复。以仅在平板中央接种镰刀菌菌饼为对照，3个重复，28℃恒温培养。当对照平板内菌丝铺满整个平板时，观察棘孢木霉拮抗效果。

(5)结果分析：如图3A，培养7天后尖胞镰刀菌对照平板的菌丝铺满整个平板，棘孢木霉对尖胞镰刀菌具有明显的拮抗作用，显著抑制病原菌生长,抑制率达81.9％。如图3B，培养7天后腐皮镰刀菌对照平板的菌丝铺满整个平板，棘孢木霉对尖胞镰刀菌具有明显的拮抗作用，显著抑制病原菌生长,抑制率达83.7％。

实施例4：棘孢木霉对苹果幼苗重茬病害的防治效果

(1)PDA培养基的制备同实施例1。

(2)PD培养液的制备：称取200g马铃薯切成小块，加水煮沸25分钟，至马铃薯小块能被玻璃棒戳破，纱布过滤，滤液加入葡萄糖20g，搅拌均匀，再补足水分至1000ml，分装于三角瓶(每瓶100ml培养液)，加塞、包扎，121℃灭菌20分钟，冷却后贮存备用。

(3)棘孢木霉生物制剂的制备：取1个5mm的棘孢木霉菌饼，接入含有PD培养液(100ml)的三角瓶中，置于28℃恒温摇床振荡培养，摇床转速为150rpm。4天后大量菌丝生成，破碎匀浆，获得浓度为0.14g/ml的菌体悬液，即作为棘孢木霉菌株4A-5的生物制剂。

(4)镰刀菌侵染液的制备：取5mm的尖胞镰刀菌或5mm的腐皮镰刀菌菌饼分别接入含有PD培养液(100ml)的三角瓶中，置于28℃恒温摇床振荡，摇床转速为150rpm，培养4天，即获得菌体侵染液。菌体浓度分别为0.24g/ml和0.21g/ml。

(5)苹果种子4℃低温沙藏，保持沙粒湿润，约30天后种子萌发出芽，移栽入灭菌土中定苗，放置于人工气候箱内培养。光照周期为光照12h/黑暗12h，光强为200μmol·m^-2·s^-1，光照和黑暗期间温度分别为25℃和18℃，空气湿度设定为70％。30天后，苹果幼苗用于后续试验。

(6)试验处理组1：将棘孢木霉菌悬液与不同镰刀菌侵染液各20ml分别注入苹果幼苗根围土壤。试验处理组2：将不同镰刀菌侵染液与PD培养液各20ml分别注入苹果幼苗根围土壤。对照组：PD培养液(40ml)注入苹果幼苗根围土壤。利用注射器注入，每个试验组有17棵苹果幼苗重复。

并且由本领域可知镰刀菌可分泌果胶酶、纤维素酶以及β-葡萄糖苷酶等降解植物细胞壁，阻塞宿主植物的导管，阻碍水分吸收，造成植物枯萎死亡。上述试验25天后，对照组苹果幼苗长势旺盛，叶片挺立呈深绿色。

根围土壤注入尖胞镰刀菌和腐皮镰刀菌的处理组2中的大部分苹果幼苗出现病害症状，植株叶片表现出萎蔫和失绿的现象。根围土壤中同时注入病原菌和棘孢木霉处理组1中的大部分苹果幼苗长势与对照组苹果幼苗一致，叶片没有出现萎蔫和失绿的现象。统计各试验组发病率、植株生物量和叶片含水率，结果见表1。

(7)结果表明，致病菌降低苹果幼苗叶片相对含水量，抑制植株生物量积累。棘孢木霉生物制剂有效降低苹果幼苗的发病率，缓解了病原菌对苹果幼苗叶片含水量和植株生物量的影响(表1)。

表1棘孢木霉生物制剂对镰刀菌引发的苹果幼苗病害的防治效果。

由上述可见，通过平板对峙试验证实，本发明的棘孢木霉菌株对尖胞镰刀菌和腐皮镰刀菌有显著的拮抗作用，抑制率达81.9％和83.7％。将棘孢木霉接种到PD液体培养基(pH，6.8)，28℃摇床震荡培养4天，震荡速率为150rpm，破碎匀浆，获得浓度为0.14g/ml的菌体悬液，作为生防制剂。将该菌剂注入根层土壤，能够有效防治镰刀菌引起的苹果幼苗病害。可见所述棘孢木霉能够拮抗尖胞镰刀菌和腐皮镰刀菌，其生物制剂有效防治苹果幼苗的重茬病害。

同时，将上述菌株棘孢木霉还可以根据实际需求，获得不同的生物制剂，例如，可以利用玉米粉、麦麸、稻壳等作为培养基质，添加磷酸二氢钾、硫酸镁和硫酸铵等无机盐，接种棘孢木霉菌株4A-5，液体发酵制备液体生物制剂，也可以进行固体发酵，并混合硅藻土、壳聚糖等制备固态生物制剂。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院烟台海岸带研究所

<120> 一种棘孢木霉及其应用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 497

<212> DNA

<213> 棘孢木霉

<220>

<221> gene

<222> (1)..(497)

<223>

<400> 1

aacccaatgt gaacgttacc aaactgttgc ctcggcgggg tcacgccccg ggtgcgtcgc 60

agccccggaa ccaggcgccc gccggaggaa ccaaccaaac tctttctgta gtcccctcgc 120

ggacgtattt cttacagctc tgagcaaaaa ttcaaaatga atcaaaactt tcaacaacgg 180

atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc 240

agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg cccgccagta ttctggcggg 300

catgcctgtc cgagcgtcat ttcaaccctc gaacccctcc gggggatcgg cgttggggat 360

cgggacccct cacacgggtg ccggccccga aatacagtgg cggtctcgcc gcagcctctc 420

ctgcgcagta gtttgcacaa ctcgcaccgg gagcgcggcg cgtccacgtc cgtaaaacac 480

ccaactttct gaaatgt 497

Claims

1.一种棘孢木霉，其特征在于：棘孢木霉为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)4A-5，其以于2016年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13187。

2.一种权利要求1所述的棘孢木霉的应用，其特征在于：所述棘孢木霉在防治苹果果树重茬病害中的应用。

3.按权利要求2所述的棘孢木霉的应用，其特征在于：所述棘孢木霉或其生物制剂在制备防治苹果果树重茬致病菌拮抗制剂中的应用。

4.按权利要求2或3所述的棘孢木霉的应用，其特征在于：所述致病菌为镰刀菌。

5.按权利要求4所述的棘孢木霉的应用，其特征在于：所述镰刀菌为尖胞镰刀菌、腐皮镰刀菌。