CN101880633B - 一种层出镰孢菌及其菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业微生物领域，本发明公开了一种层出镰孢菌(Fusariumproliferatum)菌株Br-1，其保藏编号为CGMCC No.3759。本发明还公开了利用Br-1制备的微生物菌剂。本发明层出镰孢菌Br-1及其菌剂对于向日葵列当的抑制效果好，田间防治效果达到61.7～82.0％；其次，本发明微生物菌剂制备方法简单、成本低、易于推广应用；此外，本发明属于生物防治方法，无污染，无公害，低残留，对环境友好。

Description

一种层出镰孢菌及其菌剂和应用

技术领域

本发明属于农业微生物领域，具体涉及一种层出镰孢菌，以及利用该层出镰孢菌生产的微生物菌剂和应用。

背景技术

列当属于列当科(Orobanchaceae)、列当属(Orobanche)，是一年生根寄生杂草，寄生在某些高等植物根上，无叶绿素和根系，以吸盘从寄主植物体内摄取养分和水分。在我国，危害较大的列当主要是向日葵列当、分枝列当和埃及列当。

目前防治列当的方法主要是采用耕作、栽培技术措施或施用化学药剂；但是由于列当种子产生量大，种子存活期长，且在适宜温湿度下，种子终年可以萌发，在作物的整个生育期内都会有列当出土，参差不齐，使得现有技术措施的防治效果非常差。

利用杂草的病原微生物研制专化性强、对目标杂草以外的植物影响小、环境负效应少、安全性高的生物除草剂，有可能成为防除杂草的有效途径。如镰刀菌属(Fusarium spp.)的某些种可以侵染列当，引起发病。王之樾(王之樾等.《新疆农业科技》1981(7)：16-17。王之樾等.《中国生物防治》1985(1)：24-26)从田间自然罹病的列当上分离到一株镰刀菌(Fusariumorobanches)并制成生防剂F798，用割茎涂液法防治哈密瓜列当，但是该方法需要先将列当的茎部割断，再涂抹上生防菌液，操作非常麻烦、推广比较困难，影响防治效果。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)(HEIKO THOMAS等.Anna1sof Botany.1999.83：453-458)能够在向日葵列当的地下生长阶段进行侵染，显著降低列当种子的萌发和寄生率。镰刀菌L2菌株(孔令晓等.植物病理学报.200636(5)：466-469)对列当的防治效果达到92.4％，L2菌株粗毒素能够抑制列当种子萌发，并造成列当种子萌芽管损伤。

经过检索，没有发现利用层出镰孢菌防治列当的报道。

发明内容

针对抗列当品种少，以及化学农药防治所带来的防治效果差和污染环境的问题，本发明目的在于提供一种用于列当生物防治的层出镰孢菌菌株，该菌株可高效、长效抑制在向日葵和烟草上寄生的向日葵列当，并且对环境友好。

本发明另一目的在于提供利用上述层出镰孢菌菌株生产的微生物菌剂及其制备方法。

本发明第三个目的在于提供上述层出镰孢菌菌株及其微生物菌剂在防治向日葵列当上的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)菌株Br-1，已于2010年4月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.3759。

利用上述层出镰孢菌Br-1生产的微生物菌剂，其活性成分为层出镰孢菌Br-1菌体和/或它的胞外代谢产物。

上述微生物菌剂可以为液态制剂。

上述微生物菌剂可以为颗粒剂。

上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化：将低温保存的菌株Br-1在PDA平板培养基上活化扩繁备用；

(2)种子液的制备：按常规方法制作PDB液体培养基，高压湿热灭菌后，接入步骤(1)活化的菌株Br-1，在24～28℃下振荡培养48～72h，得种子液；

(3)发酵培养：将葡萄糖豆饼粉培养基加入到发酵罐中，用HC1调节葡萄糖豆饼粉培养基的pH值至5，灭菌，然后待温度降到26℃，采用负压方法接入步骤(2)的种子液，在温度为25～26℃、通气量为1∶0.3～1.0、搅拌速度为140～180rpm条件下发酵培养44～60h；所述的葡萄糖豆饼粉培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖1～2％，豆饼粉0.2～0.4％，NH₄NO₃0.1～0.2％，KH₂PO₄0.2～0.4％和MgSO₄·7H₂O 0.1～0.2％，其余为水；

(4)检测发酵液中分生孢子数量，待发酵液中分生孢子数量达到10⁸个/ml，停止发酵培养；所得即为Br-1菌株的液体制剂。

Br-1菌株颗粒剂的制备

将上述Br-1菌株的液体制剂经钠膜过滤浓缩10倍，然后按照浓缩液与草炭之间1∶7的比例向浓缩液中加入草炭，混合挤压成型，得Br-1菌株的颗粒剂，活菌含量达到10⁸个/克。

上述制备方法步骤(2)中所述的温度优选为25～26℃。

上述制备方法步骤(3)中所述的通气量优选为0～12h 1∶0.3；12～30h 1∶0.6；30～48h 1∶1。

上述制备方法步骤(3)中所述的搅拌速度优选为160rpm。

上述制备方法步骤(3)中所述的培养时间优选为48～50h。

所述的葡萄糖豆饼培养基的制备方法，按照比例称取葡萄糖、豆饼粉、NH₄NO₃、KH₂PO₄和MgSO₄·7H₂O，混合搅拌均匀；121℃灭菌30min。

上述制备方法中所述的通气量为每分钟通入发酵罐的空气体积与发酵罐中发酵液的体积比。

上述微生物菌剂，其层出镰孢菌菌株Br-1的活菌数大于1×10⁸个/g。

所述的层出镰孢菌菌株Br-1在防治向日葵列当上的应用。

上述微生物菌剂在防治向日葵列当上的应用。

本发明菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂的颗粒剂于烟草移栽期或向日葵播种期根施，或将上述所得微生物菌剂的液体制剂稀释成孢子悬浮液于列当发生期进行植株喷雾，即可达到防控列当的目的。

菌株Br-1的分离获得过程：

菌株Br-1是河北省农林科学院植物保护研究所从寄生于烟草的感病列当上分离得到的。2002年从烟草列当发生地河北省张家口地区采集发病列当植株，表面消毒后切取感病植株茎部组织摆放于PDA平板培养基上，培养得到真菌微生物菌株，对这些菌株进行纯化，将菌株分别接种到烟草和向日葵列当上进行致病性筛选，从中得到一株对寄生于烟草和向日葵上的向日葵列当具有明显的防治效果的菌株，定名为Br-1。

Br-1菌株的分类鉴定：

(1)Br-1菌株形态特征

菌株Br-1在PDA培养基上25℃培养，产生白色丛卷毛状菌丝，随着培养时间增长菌丝颜色变成灰紫色，培养基背面产生灰紫色-深紫色色素。菌株在培养基上很少形成大型分生孢子，大型分生孢子细长，薄壁，镰刀形且较直，通常3～5个分隔。小型分生孢子成短串或以假头状产生于多瓶梗或单瓶梗上，并且经常从多瓶梗上成对产生，形成“V”形。小型分生孢子呈棍棒形，通常1～2个细胞，具有稍扁平的基部，孢子大小在2.7～5.1um×0.9～1.6um。不产生厚垣孢子。将以上菌株Br-1的形态特征与镰刀菌鉴定手册相比较，根据镰刀菌鉴定手册《The Fusarium Laboratory Manual》(John F等.Summerell，BlackwellPublishing，2006)和《Laboratory Manual for Fusarium Research 3^rd Edition》(Lester W Burgess等.University of Sydney，1994)，Br-1的形态特征和层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)的形态特征相符合，说明菌株Br-1属于镰刀菌属层出镰孢菌。

(2)翻译延长因子基因序列测定

根据用于镰刀菌属中种的鉴定的保守基因序列，采用翻译延长因子-1α(EF-1α)基因部分序列设计的引物，以CTAB法提取的Br-1菌株基因组DNA为模板，进行PCR扩增。所述的引物为：

引物1：5′-ATG GGT AAG GA(AG)GAC AAG AC-3′

引物2：5′-GGA(GA)GT ACC AGT(GC)AT CAT GTT-3′。

扩增所得大小约700bp的DNA片段，送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，所得DNA序列见SEQID No：1。将Br-1菌株的EF-1α基因序列(SEQID No：1)与FUSARIUM-ID数据库中镰刀菌的FF-1α序列进行比对，结果发现Br-1菌株的EF-1α序列与层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)FD_01168的EF-1α序列(见图1)相似度为99.04％，Br-1菌株的同源性的系统发育树图见图2。说明菌株Br-1属于镰刀菌属层出镰孢菌，并且是一个新的菌株。

本发明所具有的优点和有益效果：(1)本发明为防治寄生于烟草和向日葵上的向日葵列当提供了一种有效方法；(2)本发明对列当的抑制效果好，在温室对烟草上列当100天防效达到100％，田间防治效果达到61.7％；田间对向日葵上的向日葵列当防效达到82.0％；(3)本发明微生物菌剂制备方法简单、成本低、易于推广应用；(4)本发明无污染，无公害，低残留，对环境友好。

附图说明

图1Br-1与层出镰孢菌FD_01168的EF-1α序列对比图。

图2层出镰孢菌Br-1同源性的系统发育树示意图。

具体实施方式

下面以具体实施例来进一步清楚地解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。

实施例1：Br-1微生物菌剂的液体制剂的制备

(1)菌种活化：将低温保存的菌株Br-1(已于2010年4月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3759)在PDA平板培养基上进行活化(25℃)，并扩繁备用；

(2)种子液的制备：按常规方法制作PDB液体培养基，在500mL三角瓶中装入150mL PDB培养液(PDB培养基：马铃薯200g，葡萄糖20.0g，蒸馏水1000ml)，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入步骤(1)活化好的Br-1菌株，直径为0.5cm的菌片5片，在25～26℃、转速170rpm的摇床上进行振荡培养72h，得种子液；

(3)葡萄糖豆饼培养基的制备：在1000L发酵罐中，加入葡萄糖5kg，豆饼粉1.5kg，NH₄NO₃0.5kg，KH₂PO₄1.5kg和MgSO₄·7H₂O 0.5kg，然后加水至500L，搅拌混合得葡萄糖豆饼培养基；在121℃对葡萄糖豆饼培养基进行灭菌30分钟，降温至26℃备用；

(4)发酵培养：向步骤(3)的葡萄糖豆饼培养基中接种步骤(2)所得种子液1.5L；初始pH值用HCL调为5，在25～26℃、搅拌速度为160rpm、0～12h通气比1∶0.3；12-30h通气比1∶0.6；30-48h通气比1∶1的条件下发酵培养48h；

(5)8h以后，每隔8h从步骤(4)的发酵罐中取样进行镜检，分生孢子数达到10⁸个/ml，停止发酵培养；得层出镰孢菌Br-1液体制剂。

实施例2Br-1微生物菌剂的颗粒剂的制备

步骤(1)～(5)和实施例1相同，然后将所得到的Br-1菌株的液体制剂经钠膜过滤浓缩约10倍，再按照液体制剂与草炭之间1∶7的比例向浓缩液中加入草炭，混合挤压成型，即得Br-1菌株的颗粒剂，Br-1活菌含量达到10⁸个/克。

实施例3：层出镰孢菌Br-1温室防效试验

本试验在河北省农林科学院植物保护研究所温室内进行，首先培育烟草幼苗，待烟苗长出2-3片叶片时移栽到直径为16cm的花盆，每盆1株烟苗。烟草移栽前分别向每盆土壤中加入0.24g列当种子，混匀。根据所施用的实施例1制备的Br-1液体制剂的稀释浓度的不同，分为3个浓度处理：

处理1：约1.47×10⁸个分生孢子/ml；

处理2：1.47×10⁷个分生孢子/ml；

处理3：1.47×10⁶个分生孢子/ml；

CK：不加入Br-1液体制剂为对照；

每盆中分别加入以上3个浓度的Br-1液体制剂1ml，每处理四次重复。移栽后常规管理，列当出土时开始调查每盆中寄生的列当数量，结果(见表1)100天时3个处理的防效均达到100％，105天收获期调查地上已经出土和地下部还没有出土的列当的总的寄生数量，平均防效为61.7％，而且施用高浓度生防菌10⁸个/ml较低浓度生防菌10⁶个/ml防效高。表明移栽时土壤浇灌Br-1液体制剂能够推迟列当的出土时间，对列当有较高的防效，

表1层出镰孢菌Br-1菌剂对烟草上列当的温室防治试验结果

实施例4：层出镰孢菌Br-1烟草地田间防效试验

本试验在河北省张家口地区列当严重发生地块进行，面积约0.4公顷。将实施例2中制备的菌株Br-1的颗粒剂于烟草移栽期根际土壤施112.5千克/公顷，对照(CK)为不施用Br-1颗粒剂的烟草田，烟草收获期在处理田和对照田分别采用Z字型7点取样调查，每点调查60株烟草上寄生的列当总数和每一株烟草上寄生的列当数，计算列当的寄生率和寄生度，结果(见表2)以寄生率计算Br-1的防效为59.5％，以寄生度计算Br-1的防效为67％。说明施用Br-1菌剂能够显著抑制列当的寄生。

表2Br-1菌剂对烟草上列当的田间防治试验结果

处理	寄生率	防效％	寄生度	防效％
					处理	15.53a	59.5	23.3a	67.2
对照	38.3b		71.1b

寄生率和寄生度的计算公式为：

实施例5：层出镰孢菌Br-1向日葵地田间防效试验

本试验在河北省农林科学院植物保护研究所试验地内进行，将实施例2中制备的菌株Br-1的颗粒剂于向日葵播种期进行土壤根施，试验设2个浓度处理，分别为处理1：20克/小区和处理2：60克/小区，每小区面积约3M²，三次重复，向日葵收获前调查每小区内的列当出土数和每株向日葵上寄生的列当数，计算寄生度。结果(见表3)各处理的平均防效分别为78.8％、82.0％。说明菌株Br-1对向日葵列当具有很好的防治效果。

表3Br-1菌剂对向日葵上列当的田间防治试验结果

	列当总数	寄生度	寄生度防效％
				处理1	15.4	1.3	78.8
处理2	13.2	1.1	82.0
				CK	73.0	6.1

实施例6：Br-1孢外代谢物抑制列当种子萌发实验

本试验在河北省农林科学院植物保护研究所实验室进行，将实施例1中制备的菌株Br-1液体制剂在10000rpm下离心10mim，去掉菌体，取上清液于121℃灭菌30分钟，得到Br-1胞外代谢产物。分别在6cm培养皿内平铺灭菌滤纸，在滤纸上摆100粒向日葵列当种子，分别加入上述孢外代谢物的原液、稀释2倍和稀释10倍液各1ml，25℃保湿培养7天后将列当种子分别移入另一铺有灭菌滤纸的培养皿内，分别加入1ml灭菌水，再保湿培养7-10天后调查列当种子的萌发率，三次重复。结果(见表4)Br-1孢外代谢物原液和2倍稀释液能够显著抑制列当种子的萌发，抑制率分别为97.58％和65.84％，稀释10倍的孢外代谢物处理的列当种子萌发率与清水对照没有显著差异。说明Br-1菌株产生的胞外代谢产物或能够抑制列当种子萌发。

种子萌发率％＝萌发的列当种子/供试列当种子总数×100

抑制率％＝(清水对照处理中列当种子萌发数-毒素处理列当种子萌发数)/

          清水对照处理中列当种子萌发数×100

表4Br-1胞外代谢产物或对列当种子萌发的抑制试验结果

注：小写字母表示在0.05水平上的差异显著性

序列表

<110>河北省农林科学院植物保护研究所

<120>一种层出镰孢菌及其菌剂和应用

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>679

<212>DNA

<213>Fusarium proliferatum

<400>1

cgtcgtcgtc atcggccacg tcgactctgg caagtcgacc actgtgagta ctaccctgga    60

cgttgagctt atctgccatc gtgatcctga ccaagatctg gcggggtaca tcttggaaga    120

caacatgctg acatcgcttc acagaccggt cacttgatct accagtgcgg tggtatcgac    180

aagcgaacca tcgagaagtt cgagaaggtt agtcactttc ccttcgatcg cgcgtcctct    240

gcccaccgat ttcacttgcg attcgaaacg tgcctgctac cccgctcgag accaaaaatt    300

ttgcgatatg accgtaattt ttttggtggg gcatttaccc cgccactcga gcgatgggcg    360

tgtttttgcc ctttcctgtc cacaacctca atgagcgcat tgtcacgtgt caagcagcga    420

ctaaccattc gacaatagga agccgctgag ctcggtaagg gttccttcaa gtacgcctgg    480

gttcttgaca agctcaaggc cgagcgtgag cgtggtatca ccatcgatat tgctctctgg    540

aagttcgaga ctcctcgcta ctatgtcacc gtcattggta tgttgtcgct catacctcat    600

cctacttcct catactaaca catcattcag acgctcccgg tcaccgtgat ttcatcaaga    660

acatgatcac tggtacctc                                                 679

Claims (9)

1.一种层出镰孢菌(Fusarium proliferatum)菌株Br-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3759。

2.利用权利要求1所述的层出镰孢菌Br-1生产的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为层出镰孢菌Br-1菌体和/或它的胞外代谢产物。

3.按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于为液态制剂。

4.按照权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于为颗粒剂。

5.权利要求2～4任一所述的微生物菌剂，其特征在于其层出镰孢菌菌株Br-1的活菌数大于1×10⁸cfu/g。

6.权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)菌种活化：将低温保存的菌株Br-1在PDA平板培养基上活化扩繁备用；

(2)种子液的制备：按常规方法制作PDB液体培养基，高压湿热灭菌后，接入步骤(1)活化的菌株B4-1，在24～28℃下振荡培养48～72h，得种子液；

(3)发酵培养：将葡萄糖豆饼粉培养基加入到发酵罐中，用HCl调节葡萄糖豆饼粉培养基的pH值至5，灭菌，然后待温度降到26℃，采用负压方法接入步骤(2)的种子液，在温度为25～26℃、通气量为1∶0.3～1.0、搅拌速度为140～180rpm条件下发酵培养44～60h；所述的葡萄糖豆饼粉培养基的组成成分及其重量百分比为：葡萄糖1～2％，豆饼粉0.2～0.4％，NH₄NO₃ 0.1～0.2％，KH₂PO₄0.2～0.4％和MgSO₄·7H₂O 0.1～0.2％，其余为水；

(4)检测发酵液中分生孢子数量，待发酵液中分生孢子数量达到10⁸个/ml，停止发酵培养；得Br-1菌株的液体制剂。

7.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于其步骤(2)中所述的温度为25～26℃。

8.权利要求1所述的层出镰孢菌菌株Br-1在防治向日葵列当上的应用。

9.权利要求2、3或4所述的微生物菌剂在防治向日葵列当上的应用。

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