CN104877926A

CN104877926A - 一株拮抗黄栌枯萎病菌的菌株及其应用

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Publication number: CN104877926A
Application number: CN201410440682.8A
Authority: CN
Inventors: 田呈明; 黄华毅; 王永林; 孙妍; 于地美
Original assignee: Beijing Forestry University
Current assignee: Beijing Forestry University; Guangdong Academy of Forestry
Priority date: 2014-09-01
Filing date: 2014-09-01
Publication date: 2015-09-02
Anticipated expiration: 2034-09-01
Also published as: CN104877926B

Abstract

本发明公开了一株拮抗黄栌枯萎病菌的菌株及其应用。本发明拮抗菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2，微生物保藏号为CGMCC NO.9369。本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2是从盐碱地土壤中分离获得，能防治黄栌枯萎病，对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌具有较好的抑菌效果，并且本发明的拮抗菌的无菌滤液也能明显抑制黄栌枯萎病菌微菌核的形成。枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2是一种防效高，防治作用特殊，环境安全性好的生物防治潜力菌株，具有良好的开发应用前景。

Description

一株拮抗黄栌枯萎病菌的菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一株细菌菌株，特别涉及一株拮抗植物病原真菌的细菌菌株及其应用，属于微生物领域，可用于植物保护，防治植物病害。

背景技术

黄栌又称黄道栌、黄栌材，为灌木或小乔木，株高3～5m，是漆树科黄栌属植物。黄栌是优良的秋季红叶树种，也是我国长江流域、华北、华中地区常见的荒山绿化树种，具有生长强健及耐贫瘠等特性。入秋霜后，黄栌树叶红艳，是一种具有很高经济价值和观赏价值的树种。北京市的香山、八达岭、八大处等地均有种植，其中最为著名的是“香山红叶”景观，吸引了众多中外游客前来参观游览，已经成为北京市重要的绿色景观和特殊的人文景观，为北京市的生态环境建设和旅游业发展起到了重要作用。

黄栌枯萎病是黄栌上的一种毁灭性的病害，为害轻者影响红叶景观，重者很快死亡造成毁灭性破坏。黄栌枯萎病的病原是大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)。大丽轮枝菌作为土传的植物病原真菌，在世界范围内分布，其寄主范围十分广泛，能够侵染包括木本植物在内的近200种植物，引起轮枝菌枯萎病，可造成木质部变色、萎蔫、落叶等，最终导致植物枯死。大丽轮枝菌在生活史和侵染后期产生大量微菌核(Microsclerotia)，微菌核在轮枝菌病害发生与流行中发挥着极其重要的作用。另外镰刀菌(Fusarium spp.)的存在能促进大丽轮枝菌对黄栌的侵染，从而扩大了黄栌枯萎病的发生和危害。

黄栌枯萎病自上世纪80年代在北京、山东等地被发现，该病害最初报道是呈零星分布，在片林中发生率约为1～3％，感病严重的植株能够全株死亡，幼苗对该病害更加敏感，发病严重的苗圃中发病率为5～10％，死亡率可达为3～5％。自有报道以来，该病害的发生率不断提高，1990年的调查显示，北京香山公园内黄栌枯萎病的发病株率为46.2％，在1981年到1991年的10年期间，砍伐死亡的黄栌树共计13600余株。到2003年，香山上的黄栌已经由于枯萎病的发生而出现大面积的枯死现象，虽然在2005年进行了大面积的砍伐清理，并补栽3000株黄栌幼苗，但是并不能有效的控制该病害的发生和扩展。黄栌枯萎病已经成为严重影响黄栌林的健康和观赏的重大灾害，严重威胁着北京等地区生态环境建设。因此，预防与控制黄栌枯萎病的爆发成灾已经成为保障北京等地生态安全的重要任务之一。

目前，对黄栌枯萎病菌的防治的方法主要有化学防治、农业措施、物理方法等。由于病菌产生微菌核，在世界范围内至今仍然没有其解决防治技术问题。生物防治具有安全有效、无环境化学药剂污染等优点，已被广泛应用于植物病害的防治中。因此，筛选有效的拮抗菌，采用生物防治方法控制黄栌枯萎病病将具有良好前景和生态意义。我们从盐碱地土壤中分离筛选获得了对黄栌枯萎病菌及尖孢镰刀菌有拮抗效果，且能抑制黄栌枯萎病菌产生微菌核的枯草芽孢杆菌。这是首次报道能抑制黄栌枯萎病菌的生长及微菌核的形成的枯草芽孢杆菌，对于黄栌枯萎病的生物防治具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的是针对植物病害防治中存在的植物病原菌产生抗药性的技术问题提供一株拮抗黄栌枯萎病的细菌菌种及其在防治黄栌枯萎病中的应用，本发明的细菌菌株是从盐碱地土壤中分离筛选获得的对黄栌枯萎病具有高效拮抗作用的生防细菌菌株，能高效抑制黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌的生长，并能明显抑制黄栌枯萎病菌产生微菌核，应用本发明的拮抗菌Bacillus subtilis C-2-3-2的菌株解决了目前黄栌枯萎病化学农药、农业措施、物理方法防治难，黄栌枯萎病的病菌产生微菌核，导致黄栌枯萎病防治困难，而且防治过程中容易造成环境严重污染而生物防治现有技术空白的问题。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一株拮抗黄栌枯萎病的细菌菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis C-2-3-2)，其微生物保藏号为CGMCC NO.9369。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明的拮抗黄栌枯萎病的细菌菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisC-2-3-2，其微生物保藏号是：CGMCC NO.9369；分类命名是：Bacillus subtilis；保藏时间：2014年6月23日；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路，中国科学院微生物研究所；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。

本发明的拮抗菌菌株Bacillus subtilis C-2-3-2能高效防治黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌的生长，而且还能抑制黄栌枯萎病菌产生微菌核。

本发明所述拮抗黄栌枯萎病的细菌菌株的形态特征：

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2为革兰氏阳性杆菌，菌体大小约0.4-0.8μm×1.4-2.3μm，有芽孢，周生鞭毛，能运动。

菌体在LB培养基平板上呈灰白色，不透明，菌落光滑，圆形，中央隆起，边缘完整。

本发明拮抗黄栌枯萎病的细菌菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2的分离筛选方法：

1、取盐碱地土壤5g，置于灭菌三角瓶中，加入45mL无菌水，置于摇床上，在28℃、200rpm条件下振荡30min，静置，得到菌悬液；

2、取1mL菌悬液采用10倍梯度稀释法依次稀释得到10^-6、10^-7、10^-8浓度梯度的稀释液，从各个浓度梯度稀释液中分别取0.1mL，用无菌涂布棒涂于LB培养基平板上，以无菌水为对照，涂抹均匀后放到恒温箱中28℃恒温倒置培养；

3、连续观察8天后，挑取菌落形态不同的菌株，在LB培养基平板上进行划线纯化培养，获得多株盐碱地土壤细菌菌株，于4℃下保存备用。

4、将黄栌枯萎病菌(购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CFCC82516)、尖孢镰刀菌(购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CFCC82468)分别接种于不同的马铃薯琼脂培养基PDA平板上，在28℃条件下，恒温培养7d后用6mm打孔器打取菌饼，获得直径6mm的新鲜的黄栌枯萎病菌菌饼、尖孢镰刀菌菌饼；

5、将新鲜的、直径为6mm的菌饼分别接种于不同的马铃薯琼脂培养基PDA平板中央，接着用接种环分别挑取步骤3)中分离纯化后的土壤细菌，分别在距离黄栌枯萎病菌菌饼和尖孢镰刀菌菌饼2.5cm处四点对称点种(接种)，放置于培养箱中，28℃恒温倒置对峙培养进行初筛；

6、在黄栌枯萎病菌菌饼的PDA培养皿中接种土壤细菌15d后，观察并记录抑菌圈的有无，选出多株对黄栌枯萎病菌具有抑制效果的盐碱地土壤细菌菌株；

在尖孢镰刀菌菌饼的PDA培养皿中接种土壤细菌7d后，观察并记录抑菌圈的有无，选出多株对尖孢镰刀菌具有抑制效果的盐碱地土壤细菌菌株；

筛选出对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌同时具有抑制效果的盐碱地土壤细菌菌株；

7、将对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌均具有拮抗作用的土壤细菌菌株分别接种于不同的三角瓶中，每个三角瓶中装有100mL LB液体培养基，接着将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养1d得到多个土壤细菌菌液；然后将各个土壤细菌菌液按1％(V/V)的接种量分别接种到不同的三角瓶中，每个三角瓶装有100mL液体发酵培养基，然后将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养4d，将培养后的菌液在4℃，10000rpm的条件下离心20min，收集上清液，上清液通过0.22μm细菌滤膜过滤除菌，得到对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌均具有拮抗作用的拮抗菌无菌滤液(即发酵培养液的无菌过滤液)；然后分别将各个拮抗菌的无菌滤液以1:10(V/V)的比例与加热熔融后冷却至40～50℃的PDA培养基混合，倒平板(导入培养皿，冷却后制得固体平板培养基)，再于不同的培养基平板中央分别接入直径6mm的新鲜黄栌枯萎病菌、尖孢镰刀菌菌饼，在不同的PDA培养基平板(不添加拮抗菌无菌滤液)的中央分别接入直径6mm的新鲜黄栌枯萎病菌菌饼、尖孢镰刀菌菌饼作为对照，28℃倒置培养。

8、待对照组的菌落直径达到培养皿直径的3/4以上时，测量土壤细菌拮抗菌落直径，选取平板上黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌菌落直径最小，即对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌同时具有最强抑制效果的拮抗菌无菌滤液，此无菌滤液对应的拮抗菌菌株即为对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌同时具有最强抑制效果的盐碱地土壤细菌菌株。

本发明菌株Bacillus subtilis C-2-3-2的筛选及防治黄栌枯萎病特性测定采用的培养基如下：

LB培养基成分：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉15g，水1000mL，pH 7.0-7.2。

LB液体培养基成分：蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，水1000mL，pH 7.0-7.2。

NB液体培养基成分：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，水1000mL，pH 7.0-7.2。

马铃薯琼脂(PDA)平板培养基成分：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉17g，水1000mL，pH 7.0-7.2。

液体发酵培养基成分：葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，大豆粉5.0g，KH₂PO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O0.5g，NH₄Cl3.0g，Na₂HPO₄1.0g，酵母浸粉0.5g，水1000mL，pH7.0-7.2。

BM培养基成分：葡萄糖10.0g，NaNO₃0.2g，KCl0.52g，KH₂PO₄1.52g，MgSO₄·7H₂O0.52g，生物素0.1μM，维生素B13μM，琼脂15g，水1000mL，pH 7.0-7.2。

本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2的培养特性：

本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2能在温度范围为15～50℃的NB培养基中生长，最适生长温度为28℃；生长pH范围为5～9，最适生长pH为6；能在0.2％～11％的NaCl浓度的NB培养基中生长。能氧化果糖、葡萄糖、L-阿拉伯糖、甘露醇、D-木糖，产酸；接触酶、氧化酶、V-P实验呈阳性，具有水解淀粉、酪蛋白、卵黄的能力，不能水解酪氨酸、苯丙氨酸，能利用丙二酸盐和柠檬酸盐，具有硝酸盐还原能力，能产硫化氢，能液化明胶，石蕊牛奶实验变红。

根据《常见细菌鉴定手册》，对照菌株C-2-3-2的形态特征、生理生化特性以及系统发育树分析鉴定菌株C-2-3-2为Bacillus属菌株，并确认本发明菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2。

本发明的拮抗菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2的菌株拮抗黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌，拮抗作用强并且能够抑制黄栌枯萎病菌产生微菌核。

本发明的拮抗菌株还包括以上述菌株的能高效防治黄栌枯萎病的菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2，微生物保藏号为CGMCC NO.9369的菌液、菌株培养物、发酵培养液、发酵培养液的无菌过滤液。

其中，所述黄栌枯萎病是由黄栌枯萎病菌引起。

特别是，由黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌共同致病导致黄栌枯萎病。

以上述枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2，微生物保藏号为CGMCCN_O.9369为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围。在需要的时候，该菌剂中还可包含菌剂制备中常用的载体和辅料。

以本发明的细菌菌株为活性成分的生物菌剂拮抗黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌，抑制黄栌枯萎病菌微菌核的产生。

本发明细菌菌株通过上述培养基培养得到的菌液、菌株培养物、发酵培养液、发酵培养液的无菌过滤液用于拮抗黄栌枯萎病病菌和尖孢镰刀菌的处理，所述液体培养基为LB培养基。

固体培养基按1.5％添加琼脂。高压灭菌后备用。

液体培养时将本发明的菌株按1％(v/v)的接种量接入装有100mL发酵培养基的250mL三角瓶中，在往复式摇床(200rpm)上28℃下，进行恒温发酵培养，培养4天后的发酵培养液和发酵培养液的无菌过滤液即可用于拮抗黄栌枯萎病。

其中，所述黄栌枯萎病是由黄栌枯萎病菌引起。

本发明细菌菌株通过上述培养基培养得到的菌液、菌株培养物、发酵培养液、发酵培养液的无菌过滤液拮抗黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌，抑制黄栌枯萎病菌微菌核的产生。

本发明还包括以上述菌株的能高效防治黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2，微生物保藏号为CGMCC NO.9369的各种代谢产物。

本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2在拮抗黄栌枯萎病中的应用。

其中，所述黄栌枯萎病是由黄栌枯萎病菌引起。

所述拮抗黄栌枯萎病病原菌为本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2拮抗黄栌枯萎病菌、尖孢镰刀菌，即本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2抑制黄栌枯萎病菌、尖孢镰刀菌的生长。

其中，所述拮抗黄栌枯萎病是指抑制黄栌枯萎病菌、尖孢镰刀菌菌丝生长。

特别是，还包括抑制黄栌枯萎病菌微菌核形成。

本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2的菌液、菌株培养物、发酵培养液、发酵培养液的无菌过滤液在拮抗黄栌枯萎病中的应用。

其中，所述黄栌枯萎病是由黄栌枯萎病菌引起。

其中，所述拮抗黄栌枯萎病是指抑制黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌菌丝生长。

特别是，还包括抑制黄栌枯萎病菌微菌核形成。

本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2的菌液、无菌滤液对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌的平板抑制作用明显。其中C-2-3-2的菌液对黄栌枯萎病菌在PDA培养基平板上的抑制率达到100％，对尖孢镰刀菌的平板抑制率达到81.15％；枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2的无菌滤液对黄栌枯萎病菌的抑制率达到30.57％，对尖孢镰刀菌的平板抑制率达到52.32％。

本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2的无菌滤液对黄栌枯萎病菌微菌核形成的抑制效果明显。在平板培养前14d，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisC-2-3-2无菌滤液完全抑制了黄栌枯萎病菌微菌核形成，抑制率达到100％，而未添加枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2的无菌滤液的对照组在培养第4d开始就有有大量微菌核产生。在培养16d时，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2培养组仅有少量微菌核形成，对黄栌枯萎病菌微菌核的抑制率高，达到97.89％。

本发明的拮抗细菌枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2在防治黄栌枯萎病方面的作用极为显著，对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌有很强的抑菌效果，能明显抑制黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌菌丝的生长，并且枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisC-2-3-2分泌的无菌滤液能很好的抑制黄栌枯萎病菌微菌核的形成。枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2作为生物防治菌株，具有很好的防治黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌引起的植物病害的潜力，为防治由黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌引起的植物病害提供了一条环保、简单、有效的途径，利于环境保护。

附图说明

图1为本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisC-2-3-2在LB平板培养基上的菌落形态图。

图2为本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2的菌体形态图(10×500)。

图3为本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2基于16S rDNA序列的系统发育树，其中图中拉丁名后为相应菌株在Genbank的编号。

图4为本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2菌液对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌的平板抑制效果图，其中A为尖孢镰刀菌的空白对照组平板培养图；B为C-2-3-2菌液对尖孢镰刀菌的抑制效果图；C为黄栌枯萎病菌无菌的空白对照组平板培养图；D为C-2-3-2菌液对黄栌枯萎病菌的平板抑制效果图。

图5为本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2无菌滤液对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌的平板抑制效果图，其中A为尖孢镰刀菌的空白对照组平板培养图；B为C-2-3-2无菌滤液对尖孢镰刀菌的抑制效果图；C为黄栌枯萎病菌无菌的空白对照组平板培养图；D为C-2-3-2无菌滤液对黄栌枯萎病菌的平板抑制效果图。

图6为本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2无菌滤液对黄栌枯萎病菌微菌核形成的滤膜观察结果，其中A为空白对照组黄栌枯萎病菌微菌核形成的动态效果图，A1、A2、A3、A4分别为培养4d、8d、12d、16d的空白对照组黄栌枯萎病菌微菌核形成图；B为C-2-3-2无菌滤液抑制黄栌枯萎病菌微菌核形成的动态效果图，B1、B2、B3、B4分别为培养4d、8d、12d、16d的菌株C-2-3-2无菌滤液抑制黄栌枯萎病菌微菌核形成图。

图7为本发明枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2无菌滤液对黄栌枯萎病菌微菌核形成的平板抑制效果图，其中A、C分别为培养14d空白对照组黄栌枯萎病菌形成的培养图的正面、背面；B、D为培养14菌株C-2-3-2无菌滤液抑制黄栌枯萎病菌微菌核形成的平板抑制效果图的正面和背面。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下述实施例中的方法，无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，无特殊说明，均为质量百分含量。

实施例1 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2的分离、筛选及其鉴定

1、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2的分离与筛选

本发明的菌株分离自天津滨海大港中国林科院研究中心盐碱地治理实验区土壤中。

1A)取盐碱地土壤5g，装入装有45mL无菌水的灭菌三角瓶中，置于摇床上，在28℃、200rpm条件下振荡30min，静置，得到菌悬液(即为10^-1的土壤稀释液，也就是稀释10倍的土壤溶液)；然后采用10倍梯度稀释法依次稀释得到10^-6、10^-7、10^-8浓度梯度的稀释液，从各个浓度梯度悬浮液中分别取0.1mL，用无菌涂布棒涂于LB培养基平板上，以无菌水为对照，涂抹均匀后放到恒温箱中28℃恒温倒置培养；每个处理设置水平重复3组，其中LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉15g，水1000mL，pH 7.0-7.2。

1B)连续观察8天后，挑取菌落形态不同的菌株，再次在LB培养基平板上进行划线纯化培养，经过多次划线纯化培养获得多株盐碱地土壤细菌菌株，多株细菌菌种于4℃下保存，备用。

1C)将黄栌枯萎病菌(购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CFCC82516)、尖孢镰刀菌(购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号：CFCC82468)分别接种于不同的马铃薯琼脂培养基PDA平板上，在28℃条件下，恒温培养7d后用6mm打孔器打取菌饼，获得直径6mm新鲜的黄栌枯萎病菌菌饼、尖孢镰刀菌菌饼；

将黄栌枯萎病菌菌饼、尖孢镰刀菌菌饼分别接种于不同的马铃薯琼脂培养基PDA平板中央，接着用接种环分别挑取少许步骤1B)分离纯化后的土壤细菌，并分别在距离黄栌枯萎病菌菌饼、尖孢镰刀菌菌饼2.5cm处四点对称点种，放置于培养箱中，28℃恒温倒置对峙培养，每个对峙实验平行重复3次，其中，PDA平板培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂17g，水1000mL，pH 7.0-7.2。

1D)在黄栌枯萎病菌菌饼的PDA培养皿中接种土壤细菌15d后，观察并记录抑菌圈的有无，选出15株具有不同培养形态的对黄栌枯萎病菌具有抑制效果的盐碱地土壤细菌菌株；

在尖孢镰刀菌菌饼的PDA培养皿中接种土壤细菌7d后，观察并记录抑菌圈的有无，选出19株具有不同培养形态的对尖孢镰刀菌具有抑制效果的盐碱地土壤细菌菌株；

筛选出12株对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌同时具有抑制效果的盐碱地土壤细菌菌株。

1E)将12株对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌均具有抑制作用的土壤细菌菌株分别接种于不同的三角瓶(250mL)中，每个三角瓶中装有100mL LB液体培养基，然后将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养1d得到12株土壤拮抗细菌菌液，其中LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，水1000mL，pH 7.0-7.2；

将12株土壤拮抗菌的菌液按1％(V/V)的接种量分别接种到500mL的三角瓶中，每个三角瓶中装有100mL液体发酵培养基，接着将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养4d，将培养后的菌液在4℃，10000rpm的条件下离心20min，收集上清液，上清液通过0.22μm细菌滤膜过滤除菌，得到12种拮抗菌的无菌滤液，其中液体发酵培养基：葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，大豆粉5.0g，KH₂PO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O0.5g，NH₄Cl3.0g，Na₂HPO₄1.0g，酵母浸粉0.5g，水1000mL，pH 7.0-7.2；然后分别将拮抗菌的无菌滤液与加热后冷却至40～50℃的PDA培养基混合，混合均匀后倒入培养皿中，制得平板培养基，其拮抗菌的无菌滤液与加热后冷却至40～50℃的PDA培养基的体积之比为1:10(V/V)，每株拮抗菌的无菌滤液平行做2组；在不同平板中央分别接入直径6mm的新鲜黄栌枯萎病菌菌饼、尖孢镰刀菌菌饼，在不同的并且不加拮抗菌无菌滤液的PDA培养基平板的中央分别接入直径6mm的新鲜黄栌枯萎病菌菌饼、尖孢镰刀菌菌饼作为对照，每个处理设置3个水平重复，置于培养箱中，28℃倒置培养。

1F)待对照组菌落直径达到培养皿直径的3/4以上时，采用十字交叉法测量菌落直径(mm)，计算抑制率，选取对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌同时具有最强抑制效果的拮抗菌无菌滤液，此无菌滤液对应的拮抗菌菌株即为对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌同时具有最强抑制效果的盐碱地土壤细菌菌株。其中抑制率计算公式如下：

抑制率＝(对照组菌落净生长直径—处理组菌落净生长直径)/对照组菌落净生长直径×100％。

其中，菌落净生长直径是病原真菌在培养基上生长的菌丝直径，其计算方法为：菌落净生长直径＝菌落直径—菌饼直径。

结果表明C-2-3-2菌株的无菌滤液的抑菌效果最好，无菌滤液对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌的抑制率分别达到30.57％和52.32％，并且C-2-3-2的无菌滤液还能抑制黄栌枯萎病菌微菌核的形成，培养14d后的抑制率达到100％。

2、菌株C-2-3-2的鉴定

参照东秀珠等人编著的《常见细菌系统鉴定手册》(北京:科学出版社，2001:349-398)以及蔡妙英等人编著的《芽孢杆菌属》(北京:农业出版社，1983:19-108)中介绍的方法以及16S rDNA对C-2-3-2菌株进行鉴定，鉴定出该菌株属于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

2A)枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2在LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂粉15g，水1000mL，pH 7.0-7.2)平板上呈灰白色，不透明，菌落光滑，圆形，中央隆起，边缘完整，如图1所示。

2B)通过显微镜观察表明Bacillus subtilis C-2-3-2菌体大小约0.4-0.8μm×1.4-2.3μm之间，有芽孢，周生鞭毛，革兰氏染色呈阳性，如图2所示。

2C)生化实验结果表明，Bacillus subtilis C-2-3-2，兼性好氧，接触酶、氧化酶、V-P实验呈阳性，具有水解淀粉、酪蛋白、卵黄的能力，不能水解酪氨酸、苯丙氨酸，能利用丙二酸盐和柠檬酸盐，具有硝酸盐还原能力，能产硫化氢，能液化明胶，石蕊牛奶实验变红。

依据《常见细菌鉴定手册》，进一步对Bacillus subtilis C-2-3-2菌株的形状、大小、其它生理生化反应进行检测，明确形态和基本生理生化特性。本发明的Bacillus subtilis C-2-3-2菌株的形态和基本生理生化特征如表1所示。

表1 Bacillus subtilis C-2-3-2菌株的形态和基本生理生化特性

项目	结果	项目	结果
				菌体大小	0.4-0.8μm×1.4-2.3μm	淀粉水解	+
菌落颜色	灰白色，不透明	硫化氢生成	+
				菌落形状	光滑，中央隆起，边缘完整	苯丙氨酸脱氨酶测定	－
菌体形态	杆状	石蕊-牛奶	变红
				鞭毛	周生	形成吲哚	－
芽孢	+	在pH＝5.7营养肉汤中生长	+
				革兰氏染色	+	硝酸盐还原	+

运动性	+	酪氨酸水解	－
				接触酶反应	+	酪蛋白水解	+
氧化酶反应	+	卵黄水解	+
				厌氧生长	+	利用果糖产酸	+
甲基红反应	－	利用葡萄糖产酸	+
				V-P反应	+	利用D-木糖产酸	+
10％NaCl生长	+	利用L-阿拉伯糖产酸	+
				柠檬酸盐利用	+	利用甘露醇产酸	+
明胶液化	+	利用蔗糖产酸	+
				丙二酸盐利用	+

注：“+”表示阳性，“－”表示阴性。

2D)挑取少量单菌落，放入盛有200ul无菌水的EP管中，100℃煮沸10min，然后离心处理(10000r/min、2min)，取上清，4℃保存，即为菌株C-2-3-2的基因组DNA。以菌株C-2-3-2的基因组DNA为模板，采用如下引物：

63f：5’-CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3’

1387r：5’-GGGCGGWGTGTACAAGGC-3’

(参见Marchesi JR等，Design and evaluation of useful bacterium-specific PCRprimers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA，Applied andenvironmental micro-biology,1998,64(2):795-799)进行PCR扩增，扩增体系为20μL，含有10×TaqE缓冲液2μL、dNTP1.6μL、正反向引物各1μL、DNA Taq聚合酶0.1μL、DNA模板1μL，最后用去离子灭菌超纯水调整反应总体积为20μL。扩增条件：94℃4min；94℃1min，55℃1min，72℃1.5min，35个循环；72℃10min，最后系统温度降至4℃，反应结束。

PCR扩增产物由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序，PCR扩增出约为1.3kb左右的产物片段，测序结果表明序列含有1300个碱基，具有序列表中序列1的核苷酸序列。将该序列经Chromas序列拼接软件校正，在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)基因库进行同源性比对分析，采用MEGA5.0软件用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，进行系统发育分析，各支上的数字是1000次Bootstrap重抽样分析的支持百分比。

通过在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)基因库进行同源性比对分析，发现菌株C-2-3-2与Bacillus subtilis(KJ870195)的同源性达到99％。基于系统发育分析(见图3)，发现菌株C-2-3-2与菌株Bacillus subtilis(EF870195)亲缘性最近，并聚在同一分支中，而与其他菌株的亲缘性较远。结果表明该菌株为枯草芽孢杆菌。

结合菌株的形态特征及生理生化特性以及16S rDNA，鉴定菌株C-2-3-2为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

本发明的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2菌株已于2014年6月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，北京市朝阳区北辰西路)，中国科学院微生物研究所；保藏号为CGMCC NO.9369。

实施例2 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2生物学特性的探究

1A)挑取一菌环活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2菌株，接种于装有40mL NB液体培养基(每1000mL含有牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000ml pH 7.0-7.2)的100mL的三角瓶中，然后置于摇床上，于28℃、200rpm振荡培养1d，制得Bacillus subtilis C-2-3-2菌株种子液，其中，Bacillus subtilisC-2-3-2菌株种子液稀释10倍后的OD₆₀₀值约为0.27；

1B)按照1％(V/V)的接种量将Bacillus subtilis C-2-3-2菌株种子液接入到不同的三角瓶(100mL)中，不同的三角瓶中装有40mL的不同盐(NaCl)浓度、pH值的NB液体培养基，然后置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养2d，然后将各个培养液稀释10倍后测定OD₆₀₀值；

1C)按照1％(V/V)的接种量将Bacillus subtilis C-2-3-2菌株种子液接入到不同的三角瓶(100mL)中，不同的三角瓶中装有40mLNB液体培养基，即向每个三角瓶中接种0.4mL的Bacillus subtilis C-2-3-2菌株种子液，然后置于摇床上，分别于不同温度，200rpm条件下振荡培养2d，然后将各个培养液稀释10倍后测定OD₆₀₀值。

测定结果表明：Bacillus subtilis C-2-3-2菌株能在pH范围为5～9的条件下能够生长，在偏酸的条件下均生长良好，最适生长pH为6；菌株C-2-3-2在15～45℃的条件下能够生长，其中最适生长温度温度为28℃；在NaCl浓度为0.2％～11％的NB培养基中菌株C-2-3-2能够生长，最适生长NaCl浓度为0.2％。菌株的生物学特性如表2所示。

表2 Bacillus subtilis C-2-3-2菌株的生物学特性

注：“++++”表示生长最好，“+++”表示生长良好，“++”表示生长好，“+”表示生长有生长，“-”不能生长。

实施例3 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2菌液对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌的拮抗作用

1A)挑取一菌环活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2菌株，接种于三角瓶(250mL)中，三角瓶中装有100mL LB液体培养基(每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，水1000mL，pH 7.0-7.2)，然后将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得Bacillus subtilisC-2-3-2菌株种子液(即C-2-3-2菌液)，其中，Bacillus subtilis C-2-3-2菌液稀释10倍后的OD₆₀₀值约为0.37，该菌液即为拮抗作用测定所用的菌液，备用；

1B)吸取步骤1A)制备的C-2-3-2菌液并加到经过灭菌处理后冷却至45℃左右的PDA平板固体培养基中，其中菌液与PDA培养基的体积比为1：10，混匀倒平板即倒入培养皿中，接着在不同的平板中央分别接入直径为6mm的新鲜的黄栌枯萎病菌菌饼、尖孢镰刀菌菌饼，作为处理组；对照组为在PDA培养基中倒入与菌液同等体积的无菌水，混匀倒平板，接着在不同的平板中央分别接入直径为6mm的新鲜的黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌菌饼；各处理3个重复，于28℃培养箱中培养，待对照组菌落直径达到培养皿直径的3/4以上时，采用十字交叉法测量菌落直径(mm)，计算抑制率。其中菌落直径法测抑制率计算公式如下：

测定结果表明：拮抗菌Bacillus subtilis C-2-3-2菌液对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌都有很好的拮抗活性(如表3，图4所示)；其中C-2-3-2菌液对黄栌枯萎病菌的平板抑制率达到为100％(图4D)；图4C为黄栌枯萎病菌无菌的空白对照组平板培养图；对尖孢镰刀菌的平板抑制也达到81.15％(图4B)；图4A为尖孢镰刀菌的空白对照组平板培养图。

表3 Bacillus subtilis C-2-3-2菌液对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌的平板拮抗活性

实施例4 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2无菌滤液对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌的拮抗作用

1A)挑取一菌环活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2菌株，接种于三角瓶(250mL)中，三角瓶中装有100mL LB液体培养基(每1000mL含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，水1000mL，pH 7.0-7.2)，然后将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得Bacillus subtilisC-2-3-2菌株种子液(即C-2-3-2菌液)，其中，Bacillus subtilis C-2-3-2菌株种子液稀释10倍后的OD600值约为0.37，备用；

1B)按照1％(V/V)的接种量，将C-2-3-2菌株种子液接种到三角瓶(500mL)中，三角瓶中装有100mL液体发酵培养基(每1000mL含有葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，大豆粉5.0g，KH₂PO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O0.5g，NH₄Cl3.0g，Na₂HPO₄1.0g，酵母浸粉0.5g，水1000mL，pH 7.0-7.2)，然后将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养4d，将培养后的滤液在4℃，10000rpm的条件下离心20min，收集上清液，上清液通过0.22μm细菌滤膜过滤除菌，得到本发明枯草芽孢杆菌C-2-3-2无菌滤液(即发酵培养液的无菌过滤液)，备用；

1C)吸取步骤1B)制备的C-2-3-2无菌滤液混入到经过灭菌处理并冷却至45℃左右的PDA平板固体培养基中，其中枯草芽孢杆菌C-2-3-2无菌滤液与PDA培养基的体积比为1：10，混匀倒平板即倒入培养皿中，接着在不同的平板中央分别接入直径为6mm的新鲜的黄栌枯萎病菌、尖孢镰刀菌菌饼，作为处理组；对照组为在PDA培养基中倒入与菌液同等体积的无菌水，混匀倒平板，接着在不同的平板中央分别接入直径为6mm的新鲜的黄栌枯萎病菌、尖孢镰刀菌菌饼；各处理3个重复，于28℃培养箱中培养，待对照组菌落直径达到培养皿直径的3/4以上时，采用十字交叉法测量菌落直径(mm)，计算抑制率。其中菌落直径法测抑制率计算公式如下：

测定结果表明：拮抗菌Bacillus subtilis C-2-3-2无菌滤液对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌都有很好的拮抗活性(如表3，图5所示)；其中C-2-3-2无菌滤液对黄栌枯萎病菌的平板抑制率达到为30.57％(图5D)；图5C为黄栌枯萎病菌无菌的空白对照组平板培养图；对尖孢镰刀菌的平板抑制也达到52.32％(图5B)；图5A为尖孢镰刀菌的空白对照组平板培养图。

表4 Bacillus subtilis C-2-3-2无菌滤液对黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌的平板拮抗活性

实施例5 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2无菌滤液对黄栌枯萎病菌微菌核形成的滤膜动态观察试验

1A)挑取一菌环活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2菌株，接种于三角瓶(250mL)中，三角瓶中装有100mL LB液体培养基，然后将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得Bacillus subtilis C-2-3-2菌株种子液(即C-2-3-2菌液)，备用，其中，Bacillus subtilis C-2-3-2菌株种子液稀释10倍后的OD₆₀₀值约为0.37；

1B)按照1％(V/V)的接种量，将C-2-3-2菌液接种到三角瓶(500mL)中，三角瓶中装有100mL液体发酵培养基(每1000mL含有葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，大豆粉5.0g，KH₂PO₄1.0g，MgSO₄·7H₂O0.5g，NH₄Cl3.0g，Na₂HPO₄1.0g，酵母浸粉0.5g，水1000mL，pH 7.0-7.2)，然后将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养4d，将培养后的滤液在4℃，12000rpm的条件下离心20min，收集上清液，上清液通过0.22μm细菌滤膜过滤除菌，得到本发明枯草芽孢杆菌C-2-3-2无菌滤液(即发酵培养液的无菌过滤液)，备用；

1C)吸取步骤1B)制备的C-2-3-2无菌滤液混入到经过灭菌处理并冷却至45℃左右的BM平板固体培养基(每1000mL含有葡萄糖10.0g，NaNO₃0.2g，KCl0.52g，KH₂PO₄1.52g，MgSO₄·7H₂O0.52g，生物素0.1μM，维生素B13μM，琼脂15g，水1000mL，pH 7.0-7.2)中，其中无菌滤液与BM培养基的体积比为1：10，混匀倒平板即倒入培养皿中，接着在混合培养基上铺上经过灭菌处理的孔径为0.22μm的滤膜。对照组为在BM培养基中倒入与无菌滤液同等体积的无菌水，混匀倒平板，接着在培养基上铺上经过灭菌处理的孔径为0.22μm的滤膜；然后分别吸取200μL的黄栌枯萎病菌孢子悬浮液(孢子浓度为3.5×10⁵个/mL)到培养皿的滤膜中央，涂布均匀，各处理3个重复，将培养皿置于28℃培养箱中培养。从第4d起，每隔48h观察处理组和对照组黄栌枯萎病菌微菌核的形成情况。其中，微菌核形成的情况是通过观察滤膜变黑的程度决定，滤膜黑色程度越深，说明产生的黑色微菌核越多；滤膜不变黑，说明黑色微菌核并未产生。

动态观察结果表明：拮抗菌Bacillus subtilis C-2-3-2无菌滤液对黄栌枯萎病菌微菌核的形成有明显的抑制作用(如图6所示)；到第16d后，C-2-3-2无菌滤液依然对黄栌枯萎病菌微菌核的形成有强烈的抑制作用，在微孔滤膜上观察不到明显的微菌核的形成(图6B)；而对照组微孔滤膜上从第4d开始，微菌核的数量逐渐增加，到16d后微孔滤膜上基本铺满了微菌核(图6A)。

实施例6 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2无菌滤液对黄栌枯萎病菌微菌核形成的抑制作用

1A)挑取一菌环活化后的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C-2-3-2菌株，接种于三角瓶(250mL)中，三角瓶中装有100mL LB液体培养基，然后将三角瓶置于摇床上，于28℃，200rpm的条件下振荡培养1d，制得Bacillus subtilis C-2-3-2菌株种子液(即C-2-3-2菌液)，其中，Bacillus subtilis C-2-3-2菌株种子液稀释10倍后的OD₆₀₀值约为0.37，备用；

1C)吸取步骤1B)制备的C-2-3-2无菌滤液加入到经过灭菌处理并冷却至45℃左右的PDA平板固体培养基中，其中无菌滤液与PDA培养基的体积比为1：10，混匀倒平板即倒入培养皿中，接着在平板中央接入直径为6mm的新鲜的黄栌枯萎病菌菌饼，作为处理组；对照组为在PDA培养基中倒入与菌液同等体积的无菌水，混匀倒平板，接着在不同的平板中央接入直径为6mm的新鲜的黄栌枯萎病菌菌饼；各处理3个重复，于28℃培养箱中培养。从第6d开始，每隔48h测量菌落直径(mm)和微菌核区直径(mm)，其中菌落直径和微菌核区直径采用十字交叉法测定，计算菌落面积(Colony area，CA)、微菌核区面积(Mtcroselerotia area，MSA)、微菌核区面积占菌落面积比例(Microselerotiaproportion，MSP)、C-2-3-2无菌滤液对微菌核区面积的抑制率_MSA和对微菌核区面积占菌落面积比例的抑制率_MSP。其计算公式分别为：

菌落面积(CA)＝π×(菌落直径/2)²；

微菌核区面积(CA)＝π×(微菌核区直径/2)²；

微菌核区占菌落面积比例(MSP)(％)＝(微菌核区面积/菌落区面积)×100；

抑制率_MSA(％)＝[(对照组微菌核区面积－处理组处理组微菌核区面积)/对照组微菌核区面积]×100；

抑制率_MSP(％)＝[(对照组微菌核区占菌落面积比例－处理组微菌核区占菌落面积比例)/对照组微菌核区占菌落面积比例]×100。

测定结果表明：拮抗菌Bacillus subtilis C-2-3-2无菌滤液对黄栌枯萎病菌微菌核有很好的抑制作用(如表5，图7所示)；其中在14d前C-2-3-2无菌滤液完全抑制了黄栌枯萎病菌微菌核形成(图7B、7D)，其中，图7B是培养14d时C-2-3-2无菌滤液完全抑制了黄栌枯萎病菌微菌核形成的培养皿正面图；图7D是培养14d时C-2-3-2无菌滤液完全抑制了黄栌枯萎病菌微菌核形成的培养皿背面图；而对照组有大量微菌核产生(图7A、7C)，其中，图7A是培养14d时对照组黄栌枯萎病菌微菌核形成的培养皿正面图；图7C是培养14d时对照组黄栌枯萎病菌微菌核形成的培养皿背面图。在第16d时，处理组仅有少量微菌核形成，处理组微菌核区面积仅为43.32mm²，而对照组达到2048.96mm²，C-2-3-2无菌滤液对微菌核区面积的抑制率_MSA达到97.89％，处理组微菌核区面积只占到菌落区面积的2.28％，而对照组达到70.86％，C-2-3-2无菌滤液对微菌核区面积占菌落面积比例的抑制率MSP达到96.78％。

表5 Bacillus subtilis C-2-3-2无菌滤液对黄栌枯萎病菌微菌核形成的抑制活性

Claims

1.一株拮抗黄栌枯萎病的细菌菌株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis C-2-3-2)，其微生物保藏号为CGMCC NO.9369。

2.如权利要求1所述的细菌菌株，其特征是所述枯草芽孢杆菌拮抗黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌。

3.如权利要求1所述的细菌菌株的菌液、菌株培养物、发酵培养液。

4.如权利要求3所述的细菌菌株的菌液、菌株培养物、发酵培养液，其特征是所述菌液、菌株培养物、发酵培养液拮抗黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌。

5.如权利要求1所述的细菌菌株的发酵培养液的无菌过滤液。

6.如权利要求5所述的发酵培养液的无菌过滤液拮抗黄栌枯萎病菌和尖孢镰刀菌。

7.如权利要求1所述的细菌菌株为活性成分的生物菌剂。

8.如权利要求1所述的拮抗黄栌枯萎病的细菌菌株在拮抗黄栌枯萎病中的应用。

9.如权利要求1所述的拮抗黄栌枯萎病的细菌菌株在抑制黄栌枯萎病菌微菌核形成中的应用。

10.如权利要求1所述细菌菌株的菌液、菌株培养物、发酵培养液、发酵培养液的无菌过滤液在拮抗黄栌枯萎病中的应用。