CN1528885A - 防治棉花黄萎病的菌株及其菌剂的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种防治棉花黄萎病的菌株及其菌剂的制备方法，该菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NCD－2菌株CGMCC1019。该菌株的菌剂的制备方法为采用三级发酵工艺，其接种的菌株为枯草芽孢杆菌NCD－2；液体发酵的温度控制在28－37℃，初始pH值控制在7.0－8.0。在菌体液体发酵的基础上，复合多种添加剂制成液体制剂，或者将发酵液经浓缩获得芽孢，再与固体填充物按1∶1000的比例混合，然后经烘干和粉碎制成固体制剂。本发明的有益效果是将本发明的菌剂用于防治棉花黄萎病，防治效果显著，防治效果达56.3％－92.6％，并且无污染、无公害、低成本、便于大面积推广应用。

Description

防治棉花黄萎病的菌株及其菌剂的制备方法

                      技术领域

本发明涉及一种防治棉花黄萎病的菌株及其菌剂的制备方法，属于利用微生物防治土传植物病害的技术领域。

                      背景技术

棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的棉花上最为重要的世界性难治病害，目前仍没有有效的防治措施。统计表明，我国每年棉花黄萎病发病面积约占播种面积的50％，年损失近200万担，折合人民币10亿元，严重影响了棉花生产和纺织业的发展。因此，控制棉花黄萎病的危害已成为生产上急需解决的问题。

棉花黄萎菌是典型的土壤习居菌，其防治极其困难。该菌之所以如此猖獗为害且难以防治，其主要原因是它能够在作物病残体上，甚至直接在土壤中长期存活达十几年之久，且菌量可以常年积累，目前的防治方法，包括应用抗病品种、化学药剂和农业措施，都不能达到理想的防病效果。因为缺乏抗原育种材料，棉花抗黄萎病品种选育受到限制；化学药剂防治一则防效欠佳，二则污染环境，破坏农田生态平衡；农业措施中较为有效的是多年轮作，但在中国特定的农业环境下，人多地少且作物种类单一，难以推广应用。

利用微生物防治植物病害特别是土传植物病害是最有效的防治措施之一，目前，经检索，尚未发现利用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)防治棉花黄萎病的报道。

                      发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种防治棉花黄萎病的菌株及其菌剂的制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案：

一、防治棉花黄萎病的菌株：

NCD-2菌株经API系统鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

保藏日期：2003年10月15日，保藏单位名称及简称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：1019。

二、防治棉花黄萎病的菌剂的制备方法：

该方法包括从原种开始，经三角瓶、种子罐、发酵罐的三级发酵工艺，其特征在于：

(1)用于接种的菌株为枯草芽孢杆菌NCD-2；

(2)发酵温度、PH值及放罐条件：

A.液体发酵的温度控制在28-37℃，优选30-32℃；初始PH值控制在7.0-8.0，优选7.2-7.6；

B.放罐条件：镜检观察到发酵液中芽孢产生率90％以上，菌体浓度达到1010以上；

发酵时间一般与培养基的组成、发酵温度、发酵罐的体积、通气条件等有关。通常摇瓶和种子罐的培养时间为1.5-2天，发酵罐的发酵时间为2-4天，总发酵时间约为一周。

(3)将上述发酵液制成液体制剂或者固体制剂：

A.液体制剂的制备：

将发酵液与下列添加剂按配比要求复合制成液体制剂：

几丁质       0.3％-0.5％  Kg/L(发酵液体积)

胶原蛋白     0.2％-0.5％  Kg/L(发酵液体积)

甲基纤维素   0.5％-1％    Kg/L(发酵液体积)

B.固体制剂的制备：

将发酵液浓缩获得芽孢，再与固体填充物按照重量份数比1∶1000的比例混合，然后经烘干和粉碎制成固体制剂。

所述的固体填充物由膨润土和葡萄糖按下述重量百分比混合而成：膨润土99.7％、葡萄糖0.3％。

种子罐培养基各组分的重量百分比为：

玉米粉                           2.0％

豆饼粉                           2.0％

麦麸                             2.0％

Na₂HPO₄                       0.2％

NaH₂PO₄                       0.02％

MgSO₄                           0.03％

ZnSO₄                           0.05％

α-淀粉酶                        3-5u/kg配料

泡敌                             0.02％

发酵罐培养基各组份的重量百分比为：

玉米粉                      2.0％

豆饼粉                      2.0％

麦麸                        2.0％

Na₂HPO₄                  0.2％

NaH₂PO₄                  0.02％

MgSO₄                      0.03％

ZnSO₄                      0.05％

CaCO3                       0.3％

α-淀粉酶                   3-5u/kg配料

泡敌                        0.02％

枯草芽杆菌NCD-2菌种的筛选分离方法与过程：

在棉花黄萎病缺乏防治措施的背景下，本发明人在国际上首先提出“微菌核际”概念，并开展微菌核际微生物分离及拮抗微生物筛选和应用。本发明人于1997年应用一般土壤细菌分离方式，对河北省农林科学院植物保护研究所的连作20年棉田土壤中细菌进行了分离，分离到2000余个细菌菌株，应用对峙培养方法初步测定其对大丽轮枝菌(V.dahliae)菌丝生长的作用后发现，NCD-2菌株及其他18个细菌菌株对大丽轮枝菌的微菌核和菌丝生长具有较强的抑制作用。随后应用对峙培养方法对NCD-2菌株的抑菌作用进行了详细研究，证明NCD-2菌株抑菌率为57.4％，同时产生明显的抑菌带达7.0毫米。室内通过盆栽实验证明，用NCD-2菌株悬浮液(10⁸菌体/ml)对棉花种子浸种处理能够极显著地降低棉花黄萎病的病情指数，防病效果达到77.0％。说明NCD-2菌株是一个非常有开发潜力的菌株，1999年设置田间小区试验，试验方法如下：将NCD-2菌株悬浮液(cfu为10¹⁰细菌/ml)，按照2∶1比例(菌液：包衣剂体积)与包衣剂A充分混合制成包衣剂。以种子量10％(体积/重量)的包衣剂对棉花种子进行包衣。将包衣的棉花种子播入营养钵中，每钵播3粒种子，盖土并轻轻压实。播种期比当地棉花正常播种期提前10天，播种后的营养钵放在塑料拱棚中，出苗一周后，每钵中留一棵壮苗。在棉苗有2片真叶时，移栽到大田，移栽时，每穴中灌入20ml拮抗细菌悬浮液(拮抗细菌活体浓度10⁷细菌/ml)。以清水包衣种子，穴中灌入清水为对照。每小区15m²，重复3次，随机排列。小区试验结果表明NCD-2菌株处理能够防治棉花黄萎病，防病效果达78.1％，从而确立了NCD-2菌株作为专门防治棉花黄萎病的生防菌株。随后，2000-2002年，分别在河北省、山东省和新疆进行了多点小区试验，主要应用NCD-2菌株固体制剂，使用方法为按种子量的10％进行均匀拌种后进行正常播种，防病效果达到56.3％-92.6％。

本发明的菌株液体制剂使用方法如下：按种子量(脱绒种子)的20％进行拌种、育苗，在移栽时应用该制剂的130倍水液蘸根。

本发明的菌株固体制剂使用方法如下：按种子量的10％进行均匀拌种后再进行正常播种。

本发明提供的枯草芽孢杆菌NCD-2菌株经生物测定不仅对黄萎菌及其微菌核具有强烈的抑制作用，而且对棉刺盘孢菌(棉花炭疽病菌)、尖孢镰刀菌萎蔫专化型(棉花枯萎病菌)、玉米大斑凸脐蠕孢菌(玉米大斑病菌)、玉蜀黍平脐蠕孢菌(玉米小斑病菌)、新月弯孢霉(玉米弯孢霉叶斑病菌)、串珠镰刀菌(玉米茎基腐菌)、禾谷丝核菌(小麦纹枯病菌)、禾谷镰刀菌(小麦赤霉病菌)、禾生炭疽菌(高梁炭疽病菌)、轮纹大茎点菌(苹果轮纹病菌)、链格孢苹果专化型(苹果斑点落叶病菌)、白腐盾壳霉(葡萄白腐病菌)、茄链格孢(番茄早疫病菌)和葱链格孢(葱紫斑病菌)等14种主要农作物病原菌具有抑菌作用，说明拮抗细菌NCD-2具有广谱性抑菌谱。生物安全性测定结果表明NCD-2对目前国内主要种植作物(小麦、玉米、棉花、马铃薯、黄瓜、茄子和大豆)是非致病的。另外，如果将本发明的枯草芽孢杆菌NCD-2采用液体发酵的三级发酵工艺，并加入添加剂生产该菌株的制剂，则更方便于大面积推广应用。

本发明的有益效果将本发明的菌剂用于防治棉花黄萎病，防治效果显著，防治效果达56.3％-92.6％，并且无污染、无公害、低成本、便于大面积推广应用。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NCD-2菌株：

保藏日期：2003年10月15日

保藏单位名称及简称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)

保藏号：1019

保藏单位地址：中国北京市海淀区中关村北一条街13号中国科学院微生物研究所

                     具体实施方式

实施例：枯草芽孢杆菌NCD-2菌株制剂的制备方法：

严格按照上述发明内容部分中关于防治棉花黄萎病菌剂制备方法中的工艺步骤操作，即可制取该菌株的液体或固体制剂。

Claims (5)

1、一种防治棉花黄萎病的菌株，其特征在于该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NCD-2菌株CGMCC1019。

2、一种防治棉花黄萎病的菌剂的制备方法，它包括有从原种开始，经三角瓶、种子罐、发酵罐的三级发酵工艺，其特征在于：

(1)用于接种的菌株为枯草芽孢杆菌NCD-2；

(2)发酵温度、PH值及放罐条件：

A.液体发酵的温度控制在28-37℃，初始PH值控制在7.0-8.0；

B.放罐条件：镜检观察到发酵液中芽孢产生率90％以上，菌体浓度达到10¹⁰以上；

(3)将上述发酵液制成液体制剂或者固体制剂：

A.液体制剂的制备：

将发酵液与下列添加剂按配比要求复合制成液体制剂：

几丁质      0.3％-0.5％  Kg/L(发酵液体积)

胶原蛋白    0.2％-0.5％  Kg/L(发酵液体积)

甲基纤维素  0.5％-1％    Kg/L(发酵液体积)

B.固体制剂的制备：

将发酵液浓缩获得芽孢，再与固体填充物按照重量份数比1∶1000的比例混合，然后经烘干和粉碎制成固体制剂。

3、根据权利要求2所述的防治棉花黄萎病的菌剂的制备方法，其特征在于所述的固体填充物由膨润土和葡萄糖按下述重量百分比混合而成：膨润土99.7％、葡萄糖0.3％。

4、根据权利要求3所述的防治棉花黄萎病的菌剂的制备方法，其特征在于种子罐培养基各组分的重量百分比为：

玉米粉                             2.0％

豆饼粉                             2.0％

麦麸                               2.0％

Na₂HPO₄                         0.2％

NaH₂PO₄                         0.02％

MgSO₄                            0.03％

ZnSO₄                            0.05％

α-淀粉酶                         3-5u/kg配料

泡敌                              0.02％。

5、根据权利要求4所述的防治棉花黄萎病的菌剂的制备方法，其特征在于发酵罐培养基各组份的重量百分比为：

玉米粉                             2.0％

豆饼粉                             2.0％

麦麸                               2.0％

Na₂HPO₄                         0.2％

NaH₂PO₄                         0.02％

MgSO₄                            0.03％

ZnSO₄                            0.05％H

CaCO₃                       0.3％

α-淀粉酶                    3-5u/kg配料

泡敌                         0.02％。