CN103952328A

CN103952328A - 一种枯草芽孢杆菌菌株a33、菌剂及制备方法和应用

Info

Publication number: CN103952328A
Application number: CN201310573242.5A
Authority: CN
Inventors: 马瑜; 柯杨; 李勃
Original assignee: Microbiology Institute Of Shaanxi
Current assignee: Microbiology Institute Of Shaanxi
Priority date: 2013-11-13
Filing date: 2013-11-13
Publication date: 2014-07-30
Anticipated expiration: 2033-11-13
Also published as: CN103952328B

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌菌株A33（Bacillius subtilisA33），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.7468，还公开了利用A33菌株制备的菌剂及制备方法和应用，本发明A33菌株可用于白粉病、霜霉病、灰霉病及枯萎病等设施作物常见叶面病害的防治，具有高效、抑菌谱广、使用简单、成本低、无环境污染等特点。

Description

一种枯草芽孢杆菌菌株A33、菌剂及制备方法和应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌菌株A33、菌剂及制备方法和应用。

背景技术

设施农业生产属于人为控制下的半封闭式生态系统，除夏、秋季遮阳网覆盖栽培外，相比露地栽培生态系统具有温度高、温差大、弱光、高湿和气流缓慢等特点，有利于植物病害的发生。由此导致的作物损失接近总产量的三分之一左右，造成巨大的经济损失。长期以来，对于植物病害的防治主要依赖于化学农药的使用。然而，化学农药的滥用，也导致了严重后果，如环境污染，土壤生态多样性破坏以及对农作物及人类产生的药害等。因而，各国研究人员一直在探索新的控制作物病害的方法，来降低乃至替代化学农药的使用，来维护食品和环境安全，保护人类健康。

生物防治即利用有益生物或其他生物来抑制或消灭有害生物的一种防治策略，是目前国内外针对植物病害的有效防治措施之一。从自然界中分离、筛选出有益微生物再应用其对病原微生物的拮抗、抑制作用进行有效防控，该方法具有安全、高效、无公害和低成本等特点，且不会引起病原菌产生相应的耐药性。因此，利用拮抗微生物进行生物防治已成为当前植物病害防治的重点发展方向。

芽孢杆菌（Bacillus）是土壤和植物微生态中的优势微生物种群之一，其生长迅速，对营养要求单一，抗逆性强，由于可以产生多肽类抗菌素以及对活菌体具有溶菌作用的酶，因而对多种植物病原微生物具有拮抗作用。而且，芽孢杆菌所产生的芽孢对于紫外线辐射、低温、干燥等环境具有良好的耐受性。作为自然界中广泛存在的非致病菌，枯草芽孢杆菌对人畜无害且不会造成环境污染。是一种较为理想的生防微生物，也是目前国内外选育生防菌的主要来源之一。

近年来的大量研究发现，许多芽孢杆菌在植物微生态环境中能够与植物形成共生关系，在植物组织和叶际的微生态环境中迅速定殖生长。此外，在植物根际生活的部分芽孢杆菌还可以有效分解土壤中的硅酸盐类矿物质，使土壤中难溶性的K、P、Si等元素转变为可溶性物质供植物生长利用，同时其产生的多种活性物质还能够促进植物生长。上述的这些特性都是开发具有广谱抗菌性，以及抗病促生多种功效的生防菌剂的必要条件，具有良好的开发前景，因此芽孢杆菌生防菌剂的开发一直是国内外生物防治领域的重要热点。

发明内容

本发明的目的之一是针对设施农业栽培中白粉病、霜霉病、灰霉病等病害的防治，提供一种可用于生物防治的具有高效、广谱杀菌活性的枯草芽孢杆菌菌株A33。

本发明的目的之二是提供一种利用枯草芽孢杆菌A33生产的微生物菌剂、该微生物菌剂的制备方法以及使用方法和该微生物菌剂在防治设施蔬菜栽培中白粉病、霜霉病、灰霉病等真菌病害的应用。

本发明采用的技术方案是，一种枯草芽孢杆菌菌株A33（Bacillius subtilis A33），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7468。

本发明所采用的另一技术方案是，一种微生物菌剂，活性成分为枯草芽孢杆菌A33菌体、芽孢及其胞外代谢产物。菌剂为液态菌剂。

本发明所采用的第三个技术方案是，一种微生物菌剂的制备方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、菌种活化：

将低温保藏的A33菌株接种LB固体培养基上，并在28-37℃下培养18～24小时，然后挑取单菌落接种于LB斜面培养基上，并在28～37℃下培养18～24小时，再用无菌水洗涤培养基表面，将洗脱液作为接种液；

步骤2、种子液的制备：

在LB液体培养基中接入步骤1制备的接种液，所用培养基和接种液的体积比为1：0.05%～0.5%，在28～37℃下震荡培养12～18小时，得到种子液；

步骤3、发酵培养：

将步骤2所得种子液接入发酵培养基中，所用发酵培养基发酵培养基和种子液的体积比为1：1%～1：10%，在28～37℃、摇床转速为150～23Orpm的条件下培养32-44小时，得到菌株A33的液体制剂；发酵培养基的组分为：蔗糖2%～4%，玉米淀粉2%～4%，豆饼粉0.5%～1.5%，NaCl0.3%～0.5%，CaCO₃0.01%～0.03%，MgSO₄·7H₂O0.02～0.04%，余量为水，以上各组分的质量百分比之和为100%，pH7.0-7.5。

步骤4、液体菌剂制备：

将步骤3得到的发酵液与表面活性剂混匀后制成微生物菌剂。

本发明所采用的第四个技术方案是，微生物菌剂的使用方法，将微生物菌剂按1:30～1:200的体积比例用水稀释，将稀释后的液体菌剂于植物发病高峰前进行叶面、花蕾和果实表面喷施或全株喷施，或同时喷洒于植物栽培的土壤。

本发明所采用的第五个技术方案是，微生物菌剂在防治设施蔬菜栽培中植物真菌病害的应用。

本发明的有益结果是：

本发明枯草芽孢杆菌菌株A33和其菌剂能用于有效防止由多种病原真菌引起的植物病害的发生，尤其适用于设施蔬菜栽培过程中植物叶面病害及果实病害的防治。其有益结果在于：1.田间防治效果显著，对黄瓜白粉病、黄瓜灰霉病、黄瓜霜霉病的田间防效均达到80%以上；2.抑菌谱广，对于多种植物（包括单子叶植物和双子叶植物）的常见真菌病害都有较好的抑制作用；3.抗病促生作用明显，对于植物种子萌发、植株发育以及增强自体免疫力具有显著的促进作用；4.无污染，无毒害，无残留，对环境友好，有利于减少设施蔬菜栽培过程中化学农药的使用及提高产品质量；5.本发明制备方法简单、成本低廉、易于推广应用。

附图说明

图1为根据A33菌株16S rDNA序，列用Clustal X1.83及MEGA4.0软件分析获得的枯草芽孢杆菌A33系统发育树；

图2为利用A33防治黄瓜白粉病的防治效果图；

图3为枯草芽孢杆菌A33对黄瓜霜霉病温室防治效果图；

图4为本发明枯草芽孢杆菌A33及其代谢产物对灰霉病分生孢子的抑制作用；

图5为A33对棉花枯萎病的防治效果图；

图6为采用对峙培养法检测枯草芽孢杆菌A33菌株对病原菌的抑制作用效果图。

具体实施方式

一种枯草芽孢杆菌菌株A33（Bacillius subtilis A33），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7468。

利用上述枯草芽孢杆菌A33生产的微生物菌剂，其活性成分为枯草芽孢杆菌A33菌体、芽孢和它的胞外代谢产物。

上述微生物菌剂可以为液态菌剂。

上述微生物菌剂的制备方法，具体步骤如下：

（1）菌种活化：将低温保藏的A33菌株接种LB平板培养基（肉汤培养基）上，并在28-37℃下培养18～24小时，然后挑取单菌落接种于LB斜面培养基上，并在28～37℃下培养18～24小时，再用无菌水洗涤培养基表面，将洗脱液作为接种液；

（2）种子液的制备：按照0.05～0.5%比例（体积百分比）向LB液体培养基中接入步骤（1）制备的接种液，在28～37℃下震荡培养12～18小时，作为种子液；

（3）发酵培养：将步骤（2）所得种子液按照1～10%比例（体积百分比）接入发酵培养基中，再在28～37℃、摇床转速为150～23Orpm的条件下培养32-44小时，即得菌株A33的液体制剂；

其中的发酵培养基的组成成分及其重量百分比为：蔗糖2%～4%，玉米淀粉2～4%，豆饼粉0.5%～1.5%，NaCl0.3%～0.5%，CaCO₃0.01%～0.03%，MgSO₄·7H₂O0.02～0.04%，余量为水，pH7.0-7.5。

（4）液体菌剂制备：将步骤（3）得到的发酵液与表明活性剂（可以作为分散剂使用）混匀后制成微生物菌剂。

上述制备方法中步骤（1）所述的低温是指通常保藏菌种所用温度，本领域技术人员根据常识可知。

上述制备方法中步骤（1）或（2）所述的LB平板培养基、LB斜面培养基或LB液体培养基的组成成分及其制备方法都是本领域技术人员熟知的，可按照通常的方法制备。

上述制备方法中所述的发酵培养基的制备方法，按照重量百分比称取蔗糖、玉米淀粉、豆饼粉、NaCl、CaCO₃、MgSO₄·7H₂O，将其混合后，再加水至所需体积即可。

上述微生物菌剂，其枯草芽孢杆菌A33的活菌数大于1×10¹⁰/g。

上述制备微生物菌剂所需的表面活性剂，只要是能够在通常的农业园艺制剂中使用的表明活性剂就没有特别限定，本领域技术人员根据常识可知。

上述枯草芽孢杆菌菌株A33在防治黄瓜白粉病、黄瓜霜霉病、黄瓜灰霉病、棉花枯萎病等植物病害上的应用。其对8种病原真菌的抑菌率在83.49～94.18%之间，表现了较广的抑菌谱。

本发明菌剂的使用方法：将上述所得的微生物菌剂按1：30～1：200的体积比例用水稀释，将稀释后的液体菌剂于植物发病高峰前进行叶面、花蕾和果实表面喷施或全株喷施，也可同时喷洒于植物栽培的土壤，即可达到控制病害发生的目的。

A33菌株的分离过程：

枯草芽孢杆菌菌株A33由陕西省微生物研究所从陕西蒲城县罕井镇某苹果园土壤中分离得到。2008年陕西省微生物研究所从陕西蒲城县罕井镇某苹果园中进行五点采样，将果树根际表层5cm左右的浮土除去，取5cm-25cm处的土样。称取10g土壤，溶解于100mL无菌水振荡制成悬液，将土壤悬液按梯度稀释（10^-3，10^-4，10^-5），各浓度取200μL悬液于PDA培养基上30℃培养2-3天，挑取单菌落，纯化培养，每个浓度3次重复。将纯化后的菌种以拓展青霉（Penicillium expansum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）以及番茄早疫病（Alternaria solani）为靶标菌进行拮抗菌的筛选，结果从中筛选出一株对各供试病原菌均具有明显抑菌效果的菌株，定名为枯草芽孢杆菌菌株A33。

本发明枯草芽孢杆菌菌株A33的特征：

（1）形态特征

在营养琼脂培养基上培养菌体为杆状，具鞭毛，大小约0.8×2.5μm；芽孢为柱状，中生或近中生，孢子囊无明显膨胀。培养初期菌落为淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起成馒头状，表面湿润，直径1mm～2mm；培养后期菌落呈淡黄色，边缘不规则，表面干燥有褶皱；在液体培养基中静置培养，表面形成白色菌膜。

（2）16S rRNA序列测定

用于扩增细菌16S rRNA的引物为：

Primer A：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；

Primer H：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′；

16S rDNA的扩增：100uL反应体系中含：10×缓冲液.（含MgCl₂）10uL，2.5mmol/L dNTP8uL，Primer A（1pmol/uL）和Primer H’（1pmol/uL）各10uL，H₂O51uL，DNA模版10uL，Taq DNA聚合酶（2.5U/uL）1uL。反应条件为：95℃2min；95℃1min，50℃2min，72℃2.5min，共35次循环；72℃延伸5min。PCR扩增产物以1.5%的琼脂糖凝胶电泳检查，并以QIAEX II Gel Extraction System（Qiagen）回收。将PCR产物回收纯化后，交北京华大基因科技有限公司进行序列测定。

采用DDBJ（DNA Date Bank of Japan）中FASTA程序对所测DNA序列与Bacillus subtilis的16S rRNA进行同源性比较，并利用ClustalX1.83及MEGA4.0软件进行系统发育分析（如图1所示）。结果表明，枯草芽孢杆菌菌株A33与Bacillus subtilis的16S rDNA核苷酸序列的同源性均在99.5%以上。

（3）生理生化特征

参考《伯杰氏细菌鉴定手册（第八版中文）》（R.E.布坎南等科学出版社，1984年）所述方法对枯草芽孢杆菌菌株A33进行生理生化检测。结果如表1所示，枯草芽孢杆菌菌株A33的生理生化特征与文献所述枯草芽孢杆菌生理生化特征基本一致。同时，如图1所示，16S rDNA序列同源比对及所构建的系统发育树进一步确认生理生化鉴定结果，鉴定该菌株为属于一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

表1枯草芽孢杆菌A33的生理生化特征

注：＋：阳性反应；－：阴性反应

本发明枯草芽孢杆菌菌株A33在2013年4月12日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.7468，生物学命名Bacillius subtilis，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

下面以具体实施例来进一步解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。

实施例1

A33微生物菌剂的制备，按照如下步骤进行：

（1）菌种活化：将保藏于-80℃的A33菌株接种LB平板培养基上，并在33℃下培养18小时，然后挑取单菌落接种于LB斜面培养基上，并在33℃下培养18小时，再用无菌水洗涤培养基表面，将洗脱液作为接种液；

（2）种子液的制备：按照常规方法制作LB液体培养基，在250mL三角瓶中装入LB培养液100mL，高压湿热灭菌后，每瓶中接入步骤（1）一接种环上述活化的A33菌株，在恒温摇床上进行震荡培养，转速210rpm，33℃下培养24小时，所得为种子液；

（3）制备发酵培养基：按照3%蔗糖，4%玉米淀粉，1%豆饼粉，0.1%NaCl，0.02%CaCO₃，0.02%MgSO₄·7H₂O，余量为水，配制6L发酵培养基。充分搅拌混合后，加入10L全自动发酵罐中，高压灭菌后降温至33℃备用；

（4）发酵培养：将步骤（2）所得种子液按照3%比例（体积百分比）接入10L全自动发酵罐中，在33℃、初始pH值为7.5条件下进行搅拌状态下的液体发酵，搅拌转速为180rpm，罐压0.05～0.06Mpa，通气条件为：21m³/h进行培养。24h以后，每隔1h从发酵罐中取样镜检，对视野内的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢产生率；直至发酵液中芽孢产生率不低于90%且菌体浓度不低于10¹⁰CFU/ml。发酵时间为36-48h。

（5）液体菌剂制备：将POE脂肪酸二酯（C_12-18）（化学纯）以5%的比例（体积百分比）加入到步骤（4）得到的发酵液中，充分混匀后即得枯草芽孢杆菌A33液体制剂。

实施例2

本实验在河北省农林科学院植物保护研究所的温室内进行，选用黄瓜白粉病（由河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室提供）。采用子叶喷雾法，用喉头喷雾器将生防菌株发酵液均匀的喷洒在黄瓜叶面上，24h后接种浓度为5×10⁵孢子/mL黄瓜白粉菌孢子悬浮液，设无菌水对照。实验在相对湿度30﹪-70﹪，温度22℃的温室中进行。待空白对照充分发病后调查病级，并计算病情指数和防效。黄瓜白粉病级划分标准和防效计算方法参照《GB/T17980.30-2000》农药田间药效试验准则（一）：杀菌剂防治黄瓜白粉病》。实验结果（见表2）表明，枯草芽孢杆菌A33对于黄瓜白粉病具有极好的防治效果（如图2所示），防效可达94.18%。

表2枯草芽孢杆菌A33对黄瓜白粉病的防治效果

实施例3

本实验在陕西大荔县农民马向坡的黄瓜大棚内进行，每小区两行，三次重复，随机区组排列。实验时整个棚内霜霉病重度发生，施药前摘除病叶。采用背负式手动喷雾器接种实施例1所制备的枯草芽孢杆菌A33菌剂（100倍水稀释，含菌体10⁸CFU/mL）；另设对照药剂（75％百菌清可湿性粉剂，上海泰禾集团生产，600倍水稀释液喷雾处理）和空白对照（清水喷雾）。待空白对照充分发病后调查各个处理组的发病率和防效。实验结果（见表3）表明，枯草芽孢杆菌A33对于黄瓜霜霉病具有很好的防治效果（如图3所示），防效可达83.49%。

表3在大棚内枯草芽孢杆菌A33对黄瓜霜霉病的防治效果

实施例4

本实验在陕西大荔县农民马向坡的黄瓜大棚内进行，每小区两行，三次重复，随机区组排列。实验时整个棚内果上灰霉病轻度发生，施药前摘除病果。采用背负式手动喷雾器接种实施例1所制备的枯草芽孢杆菌A33菌剂（100倍水稀释，含菌体10⁸CFU/mL）；另设对照药剂（速克灵（50%腐霉利）可湿性粉剂，上海农安生物科技发展有限公司，1500倍水稀释液喷雾处理）和空白对照（清水喷雾）。待空白对照充分发病后调查各个处理组的发病率和防效。实验表明，枯草芽孢杆菌A33及其代谢产物能够有效抑制附着在黄瓜叶面上的灰霉分生孢子的生长发育（见图4），从而使得田间防效可达86.2%（见表4）。

表4在大棚内枯草芽孢杆菌A33对黄瓜灰霉病的防治效果

实施例5

本实验在陕西师范大学生命科学学院的温室内进行，选用棉花枯萎病（由河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室提供）。将棉花种子在按照实施例1所制备A33菌剂（100倍水稀释，含菌体10⁸CFU/mL）中浸泡24小时后，将棉花枯萎病菌孢子接种并于温室内盆栽，按常规方法管理，在出苗后第三天以A33菌剂（100倍水稀释，含菌体10⁸CFU/mL）灌根处理一次，以无菌水处理为对照。实验在相对湿度30﹪-70﹪，温度22℃的温室中进行，待无菌水对照充分发病后调查病级，并计算病情指数和防效。棉花枯萎病级划分标准和防效计算方法参照《GB/T17980.92-2004农药田间药效试验准则（二）第92部分：杀菌剂防治棉花黄、枯萎病》。实验结果（见表5）表明，枯草芽孢杆菌A33对于棉花枯萎病具有极好的防治效果（见图5），防效可达88.82%。

表5枯草芽孢杆菌A33对棉花枯萎病的防治效果

实施例6

采用对峙培养法检测枯草芽孢杆菌A33菌株对8种植物病原真菌的抑制作用，包括小麦纹枯病（Rhizoctonia cerealis）、棉花枯萎病（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、番茄早疫病（Alternaria solani）、黄瓜枯萎病（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum）、小麦赤霉病（Gibberella saubinetti）、苹果轮纹病（Macrophoma kuwatsukai）、柑橘炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）、苹果落叶病（Alternaria alternate）的抑菌谱。这10种病原真菌和枯草芽孢杆菌A33菌株均由陕西省微生物研究所代谢产物研究中心保存。具体方法如下：

将枯草芽孢杆菌A33斜面于33℃下活化48小时，待测。取上述保存的8种病原真菌，在PDA培养基上活化7天后，在菌落边缘处用直径5mm的打孔器打取菌龄一致的菌丝块，接种于另一PDA平板中间，在菌块周围距离2cm处呈“品”字形接种A33菌株，以不接A33为对照（见图6所示），每处理3次重复，放于28℃培养7天后，测量菌落半径和细菌接种点至病原菌菌落边缘的间距（抑菌带），并计算抑菌率。

枯草芽孢杆菌A33对供试病原真菌的抑制作用结果（见表6）：枯草芽孢杆菌A33对8种供试病原真菌的抑菌率在64.5～86.4%，抑制效果显著，说明本发明枯草芽孢杆菌菌株A33具有较广的抑菌谱。

表6枯草芽孢杆菌A33对供试病原真菌的抑制作用

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌菌株A33（Bacillius subtilis A33），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7468。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，活性成分为权利要求1所述的枯草芽孢杆菌A33菌体、芽孢及其胞外代谢产物。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述的菌剂为液态菌剂。

4.一种权利要求2或3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1、菌种活化：

步骤2、种子液的制备：

步骤3、发酵培养：

将步骤2所得种子液接入发酵培养基中，所用发酵培养基发酵培养基和种子液的体积比为1：1%～1：10%，在28～37℃、摇床转速为150～23Orpm的条件下培养32-44小时，得到菌株A33的液体制剂；

步骤4、液体菌剂制备：

将步骤3得到的发酵液与表面活性剂混匀后制成微生物菌剂。

5.根据权利要求4所述的微生物菌剂制备方法，其特征在于，所述的步骤3中发酵培养基的组分为：蔗糖2%～4%，玉米淀粉2%～4%，豆饼粉0.5%～1.5%，NaCl0.3%～0.5%，CaCO₃0.01%～0.03%，MgSO₄·7H₂O0.02～0.04%，余量为水，以上各组分的质量百分比之和为100%，pH7.0-7.5。

6.权利要求2所述的微生物菌剂的使用方法，其特征在于，将微生物菌剂按1:30～1:200的体积比例用水稀释，将稀释后的液体菌剂于植物发病高峰前进行叶面、花蕾和果实表面喷施或全株喷施，或同时喷洒于植物栽培的土壤。

7.权利要求2所述的微生物菌剂在防治设施蔬菜栽培中植物真菌病害的应用。