CN103074271A - 枯草芽孢杆菌yb-05、其微生物制剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌菌株YB-05及其菌剂制备方法，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.6498。所述微生物菌剂利用枯草芽孢杆菌YB-05菌株发酵液喷雾干制备粉剂。本发明的YB-05菌株及其菌剂抑菌谱广、抑菌效果好，对小麦全蚀病、番茄灰霉病菌、小麦纹枯病菌和黄瓜疫病菌等有较强的抑制作用；该菌剂可用于小麦全蚀病、番茄灰霉病菌、小麦纹枯病菌和黄瓜疫病等的高效无毒、使用简单、不造成环境污染。

Description

枯草芽孢杆菌YB-05、其微生物制剂及其应用

技术领域

本发明涉及一种生防微生物，具体涉及一种枯草芽孢杆菌YB-05、其微生物制剂及其应用。 

背景技术

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），具有生长繁殖快、营养简单，能产生耐热抗逆的芽孢，对人畜无害、环境兼容性好、能够抑制多种植物病害、不易使农作物产生抗药性。而且批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长等优点，因此，是一种理想的生防微生物。目前该菌已经在黄瓜、辣椒、水稻、小麦、玉米等农作物上显出很好的病害防治效果。在植物真菌病害生物防治方面，澳大利亚开发的枯草芽孢杆菌A-13对麦类胡萝卜立枯病以及其他土传性病害具有很好的防治效果并具有增产作用。赵百鸽等用枯草芽孢杆菌B-903有效防治苹果轮纹病，田间喷淋保护和贮前浸果处理还可降低烂果率。何红等分离的辣椒内生枯草芽孢杆菌Bs-2和BS-1，对胶孢炭疽菌引起的辣椒苗和果炭疽病有良好的防治效果，菌株培养液对苗炭疽病的防效为81.5%～93.3%，对果炭疽病的防效为80%～l00%。 

小麦全蚀病(Take-all)是由禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomyces graminis var. tritici)侵染小麦根部引起的一种世界毁灭性病害。该病是一种典型的土传病害，病菌从小麦苗期至成株期均可危害，而且该病一旦发生，蔓延速度很快，危害严重。发病轻者可造成小麦减产10%～20%，严重时可达50%以上，甚至绝收。对于该病的防治，目前仍然以化学防治为主，缺乏有效的抗病品种和高效的生防制剂，利用微生物之间的拮抗作用对小麦全蚀病进行生物防治具有广阔的应用前景。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有拮抗小麦全蚀病作用和广谱的抑菌效果的枯草芽孢杆菌YB-05及其生物制剂，并给出了其生物制剂的方制备方法。 

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是： 

分离出了一种枯草芽孢杆菌YB-05，其保藏编号为CGMCC NO.6498。

制备出一种微生物制剂，所含活性成分为上述枯草芽孢杆菌YB-05或/和其代谢产物。 

所述枯草芽孢杆菌YB-05在防治小麦全蚀病中的应用，种子拌种处理，种子加水比例3:100，将药剂按比例与水充分混合，均匀拌种后，敞开晾干备用。 

在小麦拔节期和抽穗期YB-05制剂防治效果较好，收获期防治效果最好为YB-05，与12.5%全蚀净相当，显著高于市售生防制剂的77.8%，表明YB-05持效期较长，在田间表现很好的防治效果。 

本发明具有积极有益的效果： 

所分离出的枯草芽孢杆菌YB-05 CGMCC NO.6498对小麦全蚀的抑菌带边缘清晰且抑菌效果明显，发现其表现出较为广谱的抑菌效果，其中对番茄灰霉病菌、棉花黄萎病菌、小麦全蚀病菌等的抑菌效果较好。

在小麦全蚀病的生物防治中具有重要的应用价值。田间在小麦拔节期和抽穗期YB-05制剂防治效果较好，收获期防治效果最好为YB-05，与12.5%全蚀净相当，显著高于市售生防制剂的77.8%，表明YB-05持效期较长，在田间表现很好的防治效果。 

本发明所述枯草芽孢杆菌YB-05，已于2012年9月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，该还枯草芽孢杆菌YB-05的保藏编号为CGMCC NO.6498。 

附图说明

图1：菌株YB-05对小麦全蚀病的抑菌效果图； 

图2：菌株YB-05的菌落特征图；

图3：菌株YB-05 的分子进化树图。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。 

实施例1  枯草芽孢杆菌YB-05的分离、筛选 

土样采集：在商水县谭庄镇小麦田小麦根际, 采用五点采样，采样时铲去表层5 cm土层, 取新鲜土样500 g, 用保鲜袋带回。将5 份土样混匀后取500 g 作为土壤样品（采集时间：2010年4月20日；具体采集地点：河南省周口市商水县谭庄镇；采集人：杨丽荣）。

枯草芽孢杆菌的分离与纯化：称取5g 土壤样品, 置于盛有45mL 无菌蒸馏水的三角瓶中, 小火加热至悬浮液沸腾，维持15min ,然后静止5min，吸取上清液依次稀释至10^-2和10^-3，将不同稀释度的上层清液涂布于LB平板培养基上。并将培养基倒置于37℃恒温培养过夜, 最后挑取形态、色泽、大小与枯草芽孢杆菌类似的单菌落转接到LB平板培养基上，于37℃培养2d后，记录其编号，再挑选单菌落接种到LB斜面培养基上保存。 

经过土壤样品微生物分离，共分离出98株类似枯草芽孢杆菌菌株，然后通过平板对峙法进行初筛得到对小麦全蚀病菌有拮抗作用的菌株36株，通过杯蝶法进行复筛得到拮抗作用较强的菌株6株（表1），其中以YB-05菌株拮抗效果最好（见图1）。 

表1  六株拮抗菌对小麦全蚀病菌的抑制效果 

菌株编号	抑菌带（mm）	菌株编号	抑菌带（mm）
				YB-05	13	z-1-21	8
2-1-6	8	w-1-25	7
				w-1-22	5	w-1-21	4

实施例2 枯草芽孢杆菌YB-05的鉴定

菌株YB-05形态特征：将复筛效果较好YB-05的菌株在LB培养平板中于28℃下培养1d，观察其菌落形态和颜色。YB-05在LB培养基上生长良好，菌落呈乳白色，未见有色素产生，菌落形态不规则、表面有隆起，且形成不规则的褶皱，（见图2）。培养24d后产生轻微腥臭气味，挑起时菌落成一团且有黏液。革兰氏染色呈阳性（G⁺）。

菌株YB-05的生理生化鉴定：参照《伯杰细菌鉴定手册(第八版》和《常见细菌鉴定手册》的方法，测定和观察其部分生理生化指标。 

由表2可见，菌株YB-05能使明胶液化，淀粉水解，硝酸盐还原；能使牛奶胨化，可产生过氧化氢酶。不能使纤维素水解，葡萄糖产气。可利用葡萄糖，果糖，半乳糖，木糖，麦芽糖，棉籽糖和甘露醇。菌株YB-05耐受NaCl浓度为7%，当pH<5或pH>9时菌株不能生长。根据《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)和《常见细菌鉴定手册》，YB-05的形态特征和生理生化特征均符合枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的分类标准。 

菌株YB-05 的分子鉴定结果：将YB-05序列与GenBank 数据库中相关序列进行BLAST分析, 结果显示有128个与该序列匹配的同源序列，选取同源性较高且具有代表性菌株的16S rRNA 序列构建系统发育树, 如图 3 所示, 菌株YB-05与Bacillus subtilis（SCUT09）处于进化树中的同一分支，同源性为99.4%。 综合上述形态学、生理生化特征以及YB-05和相关菌株16S~23S rＲNA ISR 序列同源性分析结果，将YB-05 菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 

表2 菌株YB-05的生理生化特征 

注：“+”：阳性结果 Positive results；“–”：阴性结果 Negative results

实施例3  YB-05微生物菌剂制备方法

（1）菌株培养与制备  将枯草芽孢杆菌YB-5接种到TSA试管斜面培养基上，28～35℃下培养24～36小时获得菌体；

（2）种子液制备  将步骤（1）制备的试管菌种接入TSB培养液内，在28～32℃下震荡培养12～16小时制成种子液；

（3）发酵培养基制备  分别取葡萄糖、玉米粉、黄豆饼粉、磷酸氢二钾加水配制成含葡萄糖1.2%、玉米粉1.8%、黄豆饼粉3%、磷酸氢二钾0.2%的培养液；

（4）液体发酵生产  对发酵设备及培养基灭菌后，将种子液按5%的接种量接种于步骤（3）配好的培养液，在27～34℃，转速180rpm，PH8.0条件下发酵培养至少36～48小时后，收集发酵液，即得液体菌剂。

（5）将上述（4）中液体菌剂与填料按一定比例混合制成母液，经喷雾干燥机干燥制成母粉。在母粉中添加一定比例的膨润土、羟甲基纤维素粉（CMC）等制得制剂。制剂成分质量配比为发酵液70%，填料10%，助剂10%，稳定剂2.0%，保护剂0.10%，以膨润土补足100%。 

实施例4: YB-05菌株的抑菌谱 

以10种病原菌为靶标菌，采用平板对峙的方法测定YB-05菌株对这10种病原菌的拮抗作用，制抑菌谱。

测定出YB-05对10种病原菌的抑菌带，结果如表3所示，发现其表现出较为广谱的抑菌效果，其中对番茄灰霉病菌、棉花黄萎病菌、小麦全蚀病菌等的抑菌效果较好。 

表3 YB-05菌株抑菌谱

病原菌	抑菌效果	病原菌	抑菌效果
				茄灰霉病菌	＋＋＋	棉花红腐病菌	＋＋
黄瓜疫病菌	＋＋＋	小麦赤霉病菌	＋＋
				苹果褐斑病菌	＋＋	玉米青枯病	＋＋
小麦全蚀病菌	＋＋＋	苹果腐烂病菌	＋＋
				小麦纹枯病菌	＋＋＋	棉花黄萎病菌	＋＋＋
大肠杆菌	＋	番茄青枯病菌	＋＋

注：“＋＋＋”：抑菌带10mm以上；“＋＋”：抑菌带5～10mm；

“＋”：抑菌带＜5mm；“—”：抑菌带＜3mm

实施例5：YB-05菌剂对全蚀病菌的温室盆栽防病作用

本实验在河南省农业科学院的温室内进行，室内盆栽实验所用基质材料为草炭土，蛭石混合而成。供试小麦品种为郑麦366；处理的方法如下：

（1）菌饼接种：以小麦全蚀病菌（为河南省农业科学院植物保护研究所分子生物学实验室保存）为供试病原菌，将其转接到PDA平板上，用打孔器打成直径 1 cm的菌柄待用，在营养钵中装入基质材料，表面压平，将菌柄置于基质上面，带菌面向上，将不同处理的种子播种,每个菌柄上放置一粒种子，播层上用基质覆盖。

（2）YB-05发酵液拌种处理：小麦种子经1%的次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗3次，催芽，露白后用YB-05菌体浓度为10⁸ cfu/mL发酵液浸种1h，种子表面晾干，播种待用。 

（3）YB-05发酵液灌根：小麦种子经1%的次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗3次，催芽，露白然后播种。待小麦露芽每株小麦根部浇灌1ml YB-05菌液，到播种第10天再次浇灌。 

（4）药剂对照：用全蚀净（美国孟山都公司出品）对小麦进行拌种和浸种处理。 

（5）对照：小麦种子经1%的次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗3次，催芽，露白然后播种。 

每个处理重复5次，每钵15粒，在25 ℃下培养28 d后洗根调查。待对照完全发病后调查结果计算。 

小麦全蚀病苗期分级标准： 

0级 无病 

1级 变黑根面积占根总面积的1%～5% 

3级 变黑根面积占根总面积的6%～20% 

5级 变黑根面积占根总面积的21%～40%

7级 变黑根面积占根总面积的41%～60%

9级 变黑根面积占根总面积的61%以上。

通过盆栽防治实验结果（表4）表明YB-05稀释菌剂防治效果略高于全蚀净，达到75％以上，灌根效果低于拌种效果。 

表4 YB-05 菌剂对小麦全蚀病盆栽防治作用

处 理	病情指数	防治效果(%)
			清水对照	87.3	0
灌根	26.8	69.3a A
			拌种	18.9	78.54b B
全蚀净	20.6	76.4b C

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

实施例6: YB-5菌剂防治小麦全蚀病田间实验 

实验地点：河南省商丘市宁陵县张弓镇

小麦品种：周麦22，播量15公斤/亩，按常规施底肥及追肥。

播前处理：正常整地，浅耕 

实验时间：2011年10月-2012年5月 

实验处理：如表5所示：

表5 实验处理

编号	药剂	用药量（拌15kg种子）
			1	3％苯醚甲环唑	50g
2	12.5％全蚀净	20g
			3	YB-05	200g
4	市售生防制剂（枯草芽孢杆菌）	200g
			5	对照，不拌种

拌种方法：种子加水比例3:100，将药剂按比例与水充分混合，均匀拌种后，敞开晾干备用。

调查方法、时间和次数：播种后10天调查小麦出苗率，于拔节期和抽穗期各进行一次根系调查，收获前7天～10天调查白穗率。 

根系调查每处理随机五点取样，每点至少取20株根样，用铁锨将整株小心挖出来，使根系尽量保持完整，在水中清洗干净，在白色背景下调查根系发病情况，以每个植株根部受侵染的百分率分级。 

调查白穗对每个处理采取五点取样，每点取1m双行，调查总株数和白穗株数，计算白穗率，与对照相比计算防效。 

小麦全蚀病分级标准参照农药田间药效实验准则(二)第109部分：杀菌剂防治小麦全蚀病。具体分级标准如下： 

0级：无病；

1级：根系发病面积占1%～5%；

3级：根系发病面积占6%～20%；

5级：根系发病面积占21%～40%；

7级：根系发病面积占41%～60%；

9级：根系发病面积占61%以上。

药效计算方法： 

白穗率（%）=

×100

病情指数（%）=×100

防治效果（%）=

×100

试验田基本情况：宁陵药剂试验田南北长124米，宽44米，总面积5456平

方米，折8.18亩。淤土地，上茬玉米，旋耕、未打畦田，未搞土壤处理。从东向西依次为处理1-8。处理1-7用滚筒式拌种机拌种，2011年10月14日傍晚拌种后凉在地下，处理8为未拌种处理。10月15日14:40-17:00机播，每处理1亩（宽5.38米）。处理1-6为23行，处理7、8为24行。

2012年11月17日调查基本苗，拔节期2012年4月14日进行第一次根系调查，抽穗期2012年5月7日进行第二次根系调查，收获前5月20日再进行枯白穗调查。结果如表6、表7所示。 

由表6的基本苗调查结果表明：3％苯醚甲环唑, 12.5％全蚀净, YB-05, 市售生防制剂等4个处理出苗情况与对照相当，无显著差异； 

表6 小麦全蚀病药效实验基本苗调查结果

表7 小麦全蚀病药效实验结果

       两次根系调查及枯白穗调查结果（表6、7）表明4个药剂处理均有一定防效，防治效果拔节期和抽穗期YB-05制剂防治效果较好，收获期防治效果最好为YB-05，与12.5%全蚀净相当，显著高于市售生防制剂的77.8%，表明YB-05持效期较长，在田间表现很好的防治效果。

Claims (7)

1.一种枯草芽孢杆菌YB-05，其保藏编号为CGMCC NO.6498。

2.一种微生物制剂，其特征在于，所含活性成分为权利要求1所述枯草芽孢杆菌YB-05或/和其代谢产物。

3.权利要求2所述微生物制剂制备方法，包括如下步骤：

（1）菌株培养与制备：将枯草芽孢杆菌YB-05接种到TSA试管斜面培养基上，28～35℃下培养24～36小时获得菌体；

（2）种子液制备：将步骤（1）制备的试管菌种接入TSB培养液内，在28～32℃下震荡培养12～16小时制成种子液；

（3）发酵培养基制备：分别取葡萄糖、玉米粉、黄豆饼粉、磷酸氢二钾加水配制成含葡萄糖1.2%、玉米粉1.8%、黄豆饼粉3%、磷酸氢二钾0.2%的培养液；

（4）液体发酵生产：对发酵设备及培养基灭菌后，将种子液按5%的接种量接种于步骤配好的培养液，在27～34℃下发酵培养至少36～48小时后，收集发酵液即得菌剂；

（5）将所述步骤（4）中液体菌剂与填料按一定比例混合制成母液，经喷雾干燥机干燥制成母粉；在母粉中添加填料、助剂、稳定剂、保护剂制成含有如下成分的生物制剂：发酵液70%、填料10%、助剂10%、稳定剂2.0%、保护剂0.10%，余量为膨润土。

4.权利要求1所述枯草芽孢杆菌菌株YB-05或权利要求2所述微生物制剂在抑制番茄灰霉病菌、黄瓜灰霉病菌、小麦纹枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦赤霉病菌、苹果褐斑病菌、山药炭疽病菌、西瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、芝麻枯萎病菌、黄瓜疫病菌、棉花红腐病菌中的应用。

5.权利要求1所述枯草芽孢杆菌YB-05或权利要求2所述微生物制剂在防治小麦全蚀病中的应用。

6.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在小麦拔节期或/和抽穗期施用权利要求2所述的微生物制剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，在小麦收获期施用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌YB-05。

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