WO2022099427A1 - Consorcio bacteriano liofilizado para el control de gaeumannomyces graminis - Google Patents

Consorcio bacteriano liofilizado para el control de gaeumannomyces graminis Download PDF

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WO2022099427A1
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bacterial
strain
consortium
seeds
lyophilized
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PCT/CL2020/050152
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Paola Andrea DURÁN CUEVAS
Cristian Jorge MERIÑO GERGICHEVICH
Patricio Javier BARRA ESPINOZA
Sharon VISCARDI
Isabel Audelia MÉNDEZ PANES
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Universidad De La Frontera
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    • C12R2001/425—Serratia

Definitions

  • the present invention discloses a lyophilized bacterial consortium comprising two endophilic bacterial strains (Ac ⁇ netobacter sp and Serratia sp) and a rhizospheric bacterial strain (Bacillus sp), the method for obtaining said consortium, and the use of said consortium to inhibit the development, prevent and/or treat diseases caused by plant pathogens and to promote plant growth
  • the lyophilized bacterial consortium is applied to plant seeds to inhibit the development of diseases caused by plant pathogens, as well as to promote growth in plants.
  • Foot disease is a disease caused by the fungus Gaeumannomyces graminis var. Tritici (Ggt).
  • Ggt Gaeumannomyces graminis var. Tritici
  • This phytopathogen affects the roots of cereals such as wheat, rye and triticale, causing significant economic losses.
  • production losses caused by this fungus range from 30% to 50%, being one of the most severe diseases that affects crops worldwide. world.
  • the ability of the fungus to form survival structures, such as apothecia allow it to survive in the soil or in tissue remains for a long time, which makes control extremely difficult and is mainly restricted to the use of chemical agents to treat this disease.
  • Suppressive soils are defined as those soils that, despite the presence of the pathogen, are immune or have a low incidence of the disease, mainly due to the presence of beneficial microorganisms that help control the phytopathogen (Duran et al., 2017. Screening and characterization of potentially suppressive soils against Gaeumannomyces graminis under extensive wheat cropping by Chilean indigenous communities).
  • PGPB Plant Growth-Promoting Bacteria
  • Tr ⁇ tici In addition to control through chemical agents such as the aforementioned fungicides, in an attempt to effectively control the fungus Gaeumannomyces graminis var. Tr ⁇ tici (Ggt), various strategies have been developed with a view to developing more natural and/or environmentally friendly alternatives.
  • patent application US 20170245494 discloses a bioactive and biodegradable multilayer film.
  • the multilayer film includes one or more bioactive compounds or microorganisms to promote plant growth and health, which are contained between the layers of the film, each layer comprising about 60% to about 75% (m /m) polyhydroxyalkanoate.
  • Bioactive compounds or microorganisms may include any one of, or a combination of: a metabolite, an antimicrobial compound, an enzyme, a live microorganism, a fertilizer, a plant growth hormone, a preservative, a pesticide, or a herbicide.
  • document US 20170245494 does not disclose a lyophilized bacterial consortium like the one disclosed in the present application. Additionally, the present invention differs from document US 20170245494, in that the microorganisms used by the inventors are bacteria isolated from soils with suppressive characteristics, which are capable of producing phenazine-type antibiotics, and are also capable of promoting the growth of bacteria. plants by producing enzymes that solubilize phosphorus (such as phosphatases and phytases), making it available for plant nutrition.
  • solubilize phosphorus such as phosphatases and phytases
  • the bacteria of the consortium of the present invention also produce siderophores (such as hydroxamates), which are capable of chelating iron and making it available to the plant, which indirectly prevents it from being available. for the nutrition of the phytopathogen. Therefore, the present invention brings together several technical elements that document US 20170245494 does not disclose or suggest and that, therefore, substantially differentiate it from said document.
  • microbial fertilizer compound to prevent and treat plant diseases, particularly wheat, and a method for preparing the microbial fertilizer compound.
  • the microbial fertilizer compound consists of the following strains: Streptomyces catenulae, Streptomyces albolongus, Bacillus flexus, Bacillus aryabhattai and Trichoderma brevicom pactum.
  • the strains in the document induce the wheat plant to generate resistance to diseases by virtue of the production of secondary metabolites and various antibiotics, such as proceomycin, neomycin E, catenulin, diparomomycin and the like, which inhibit the pathogenic microorganisms of the disease. of the wheat.
  • the five strains selected in document CN 106244490 were directly isolated from the soil and have a promoting effect on rhizosphere growth. In addition, they can promote reproduction and growth on crop surfaces or in plants or soil. Additionally, document CN 106244490 discloses that the strains can have an effect on nitrogen fixation and can promote the directional secretion of some secondary metabolites from the rhizosphere of the plant.
  • document CN 103074271 discloses a pulverized microbial inoculum, prepared by dry aerosol preparation of a fermentation solution of the Bacillus subtilis YB-05 strain.
  • the YB-05 strain and its inoculant would have the advantages of having a broad antibacterial spectrum, good antimicrobial effect and strong inhibition effects on wheat disease (mal del foot), Botrytis cinerea on tomato, sheath blight fungi on wheat, Phytophthora melonis and the like.
  • the inoculant would have the advantages of high efficiency, non-toxicity, simple use and no environmental pollution.
  • the lyophilized bacterial consortium of the present invention was isolated from suppressive soils.
  • Serratia sp corresponds to a microorganism isolated from the tissues of plants that were grown in suppressive soils (endophytic strain)
  • Bacillus sp. corresponds to a microorganism isolated from soil in contact with plant roots (rhizospheric strain)
  • Acinetobacter sp. was also isolated from inside wheat roots (endophytic strain).
  • microorganisms isolated from suppressive soils are significantly different from the microorganisms of documents CN 106244490 and CN 10307427.
  • the bacteria used in the present invention also produce siderophores, such as hydroxamates, which are capable of chelating iron and making it available to the plant, which indirectly prevents it from being available for the nutrition of the phytopathogen. Said technical characteristic associated with the production of siderophores was not described or suggested in any of the documents CN 106244490 and CN 10307427. Therefore, the present invention brings together several technical elements that substantially differentiate it from said documents of Chinese origin.
  • document CN 107306999 discloses a bactericidal composition based on phenazine-1-carboxylic acid and a bacterium that contains it, where the active components of the bactericidal composition are phenazine-1-carboxylic acid and Bacillus cereus, which are are in a weight ratio of phenazine-1-carboxylic acid to Bacillus cereus of 1:100-100:1, where the content of Bacillus cereus per gram of bactericidal composition is 10 6 - 10 11 /g, and the bactericide contains 1-90% by weight of the bactericidal composition.
  • the present invention is based on a bacterial consortium and not on an individual strain, where, as highlighted above, the bacterial consortium is made up of bacteria isolated from suppressive soils, with all the advantages that these entail.
  • the bacterial consortium is made up of bacteria isolated from suppressive soils, with all the advantages that these entail.
  • they use a combination of the microorganism Bacillus cereus with a type of phenazine, particularly phenazine-1-carboxylic acid, which according to the application is produced by Pseudomonas fluorescens, so the effect of the microorganism and the metabolites it produces.
  • the Bacillus cereus strain produces enzymes capable of solubilizing phosphorus, nor siderophores.
  • the particular use for inhibiting pathogen growth or controlling wheat "sick foot" disease caused by Ggt is not disclosed.
  • the present invention differs from the cited documents, in that it discloses a lyophilized bacterial consortium not described in the prior art, which in addition to producing the antibiotic phenazine, also provides transcendental factors for plant nutrition and health through, for example, from the solubilization of phosphorus and the production of siderophores.
  • the invention of the present patent application is based in particular on a lyophilized bacterial consortium consisting of two bacteria isolated from suppressive soils, Bacillus sp. (deposited in the Chilean Collection of Microbial Genetic Resources (CChRGM), under access number: RGM 2948, dated January 28, 2020) and Serratia sp.
  • the prior art does not disclose or suggest the lyophilized bacterial consortium of the present application, capable of not only reducing the percentage of infection of the Gaeumannomyces graminis pathogen that causes foot sickness in cereals, but also promoting the health of the plant through the solubilization of phosphorus and production of siderophores.
  • Figure 1 This figure shows the photograph of an agarose gel where a PCR amplification is observed, showing the expected size for the gene that codes for phenazine (790 bp).
  • MP molecular weight marker
  • E6.2 Acinetobacter sp. E6.2 (Accession No.: RGM 3033);
  • 188.3 Serratia sp. 188.3 (Accession No.: RGM 2949);
  • 4B Bacillus sp. 4B (Accession No.: RGM 2948);
  • FIG. 2 This figure shows a graph comparing the percentage of infection in wheat plants, grown from seeds inoculated with the lyophilized bacterial consortium (consortium), or without the lyophilized bacterial consortium (control), planted in soils in the presence of the fungus Gaeumannomyces graminis var. Tritici(Ggt) (+Ggt) or in the absence of Ggt (-Ggt).
  • FIG. 3 This figure shows a graph comparing the biomass obtained from wheat plants grown from seeds inoculated with the lyophilized bacterial consortium (consortium), or without the lyophilized bacterial consortium (control), planted in soils in the presence of the fungus Ggt ( +Ggt) or in the absence of Ggt (-Ggt).
  • Figure 4 This figure shows a graph where the percentage of infection in wheat plants is compared, in relation to the necrotic roots of infected wheat plants (+Ggt), grown from non-inoculated seeds with the lyophilized bacterial consortium (Control); grown from seeds inoculated with each of the bacterial strains separately that are part of the consortium, that is, Serratia sp. 188.3 (Serratia); Bacillus sp. 4B (Bacillus); and Acinetobacter sp. E6.2 (Acinetobacter); and grown from seeds inoculated with the lyophilized bacterial consortium (Consortium); The letters indicate statistical differences (the letters were obtained through the Tukey test), where different letters indicate statistical differences at p ⁇ 0.05. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  • the present invention discloses a lyophilized bacterial consortium, comprising two strains of endophytic bacteria (Acinetobacter sp. and Serratia sp.) and a rhizospheric bacterial strain (Bacillus sp), the method for obtaining the lyophilized bacterial consortium, and its use in the inhibition of the development, treatment and/or prevention of diseases caused by plant pathogens, as well as in the promotion of the growth of said plants.
  • a method for inhibiting the development of diseases caused by plant pathogens and promoting their growth is disclosed, which comprises applying the lyophilized bacterial consortium to seeds from which said plants grow.
  • the bacterial strains used in the present invention have been isolated and selected from suppressive soils, based on their characteristics of promoting plant growth (based on a correlation dependent on their ability to solubilize phosphorus and production of siderophores), to the production of phenazine-type antibiotics (through the identification of the gene that codes for phenazine by PCR using specific primers) and mainly to the ability to inhibit the growth of the fungus Gaeumannomyces graminis var. Tritici (Ggt) in vitro.
  • the strains of the bacterial consortium of the present invention were deposited in the Chilean Collection of Microbial Genetic Resources (CChRGM), in its capacity as International Depository Authority (IDA).
  • the strain of Acinetobacter sp. (E6.2) was deposited in the CChRGM under the access number: RGM 3033, dated August 11, 2020.
  • the strain of Serratia sp. (188.3) was deposited in the CChRGM, under access number: RGM 2949, dated January 28, 2020.
  • the strain of Bacillus sp. (4B) was deposited in the CChRGM, under access number: RGM 2948, dated January 28, 2020.
  • the strains of the bacterial consortium of the invention have one or more of the following characteristics: capacity for phosphorus solubilization, production of siderophores, production of phenazines and inhibition of Ggt in vitro.
  • strain Acinetobacter sp. E6.2 (Accession No.: RGM 3033) has the ability to produce phenazines and significantly inhibit the development of Ggt in vitro.
  • the present invention discloses a lyophilized bacterial consortium comprising the Acinetobacter sp. E6.2 (Accession No.: RGM 3033), the strain of Bacillus sp. 4B (Accession No.: RGM 2948) and the strain of Serratia sp. 188.3 (Access No.: RGM 2949).
  • the lyophilized bacterial consortium according to the present invention has 1 x 10 14 to 4 x 10 16 CFU per gram of lyophilized bacterial consortium.
  • the lyophilized bacterial consortium according to the invention can be used to treat and/or prevent infectious diseases caused by plant pathogens and to promote plant growth. Also, the lyophilized bacterial consortium can be applied to seeds, in a method to inhibit the development of diseases caused by plant pathogens and promote their growth.
  • the lyophilized bacterial consortium according to the present invention can be used to treat and/or prevent plant diseases caused by the fungus Gaeumannomyces graminis var. Tritici (Ggt).
  • the lyophilized bacterial consortium according to the present invention can be used to treat diseases, preferably of grasses, more preferably of wheat, rye and triticale.
  • the present invention discloses methods of preparing the lyophilized bacterial consortium.
  • the method of preparing the lyophilized bacterial consortium comprises the following steps: i), inoculating a sterile culture medium with a bacterial strain of Acinetobacter sp., with a bacterial strain of Bacillus sp., and with a bacterial strain of Serratia sp. in the proportions 37%, 27% and 36%, respectively, and incubate for 24 to 36 hours, with agitation between 50-150 rpm, at a temperature of 28°C, to obtain a bacterial broth;
  • step (i) centrifuge the bacterial broth obtained in step (i) at between 4000-6000 rpm, for 10-15 minutes, to obtain a bacterial pellet; iii). washing the bacterial pellet obtained in step (ii) at least 3 times with a washing solution; iv). freeze the bacterial pellet obtained in step (iii) for 12 to 16 hours, at -50 to -80 C , using a medium containing a compound that prevents cell damage; and V). lyophilize the pellet from step (iv) in a lyophilizer to obtain the lyophilized bacterial consortium.
  • the method of preparing the lyophilized bacterial consortium can be carried out by producing and lyophilizing the bacterial strains separately, and subsequently mixing them to obtain the lyophilized bacterial consortium.
  • the method of preparing the lyophilized bacterial consortium comprises the following steps: i), inoculate a first sterile culture medium with a bacterial strain of Acinetobacter sp., a second sterile culture medium with a bacterial strain of Bacillus sp., and a third sterile culture medium with a bacterial strain of Serratia sp., and incubate for 24 to 36 hours, with agitation between 50-150 rpm, at a temperature of 28°C, to obtain a first, a second and a third bacterial broth, respectively;
  • step (i) centrifuge the first, second and third bacterial broth obtained in step (i), respectively, at between 4000-6000 rpm, for 10-15 minutes, to obtain a first, a second and a third bacterial pellet , respectively; iii). washing the first, second and third bacterial pellets obtained in step ( ⁇ i), respectively, at least 3 times with a washing solution; iv). freeze the first, second and third bacterial pellets obtained in step (iii), respectively, for 12 to 16 hours, at -50 to -80 C , using a medium containing a compound that prevents cell damage; v).
  • step (iv) freeze-drying the first, second and third bacterial pellets obtained from step (iv), respectively, in a freeze-dryer to obtain a first, a second and a third bacterial lyophilisate, wherein the first lyophilisate comprises the bacterial strain of Acinetobacter sp. , the second lyophilisate comprises the bacterial strain of Bacillus sp., and the third lyophilisate comprises the bacterial strain of Serratia sp. and vi), mix the first, second and third lyophilisate in the proportions 37%, 27% and
  • the bacterial strain of Acinetobacter sp. is strain E6.2 (Accession No.: RGM 3033), the bacterial strain of Bacillus sp. is strain 4B (Accession No.: RGM 2948) and the bacterial strain of Serratia sp. is strain 188.3 (Accession No.: RGM 2949).
  • stage prior to stage (i) described above is carried out, in which said bacterial strains are reactivated by carrying out a pre-inoculum in a medium that allows adequate recovery of bacterial strains.
  • the bacterial strains can be stored through any conventional technique.
  • the stored bacterial strains are in a solution of 20% glycerol and 80% culture medium.
  • the culture medium is LB culture medium.
  • the pre-inoculation of the bacterial strains is carried out in the medium that allows an adequate recovery of the bacterial strains, diluting the bacterial strains 50 to 100 times in said culture medium.
  • the culture medium that allows an adequate recovery of the bacterial strains is selected from any general medium suitable for bacterial growth.
  • the general medium suitable for bacterial growth is selected from the group comprising: nutrient broth, malt extract, MRS medium, TSA medium and LB medium. More preferably, the culture medium that allows an adequate recovery of the bacterial strains is LB medium.
  • the pre-inoculum is incubated for 24 to 36 hours, with agitation between 50-150 revolutions per minute (rpm) at a temperature of 28°C.
  • the sterile culture medium is a culture medium suitable for the growth of the bacterial strains, which is selected from any general medium suitable for bacterial growth.
  • said general medium suitable for bacterial growth is selected from the group comprising: nutrient broth, malt extract, MRS medium, TSA medium and LB medium.
  • the suitable culture medium for the growth of the bacterial strains, ie the sterile culture medium is LB medium.
  • the centrifugation step (ii) of the methods is preferably carried out at room temperature.
  • the washing solution used in step (iii) of the methods can be distilled water or a saline solution, where the saline solution is prepared with salts selected from the group comprising: NaOH and KOH.
  • the saline solution is 0.5-1% (w/v) NaOH.
  • the compound used in step iv) of the methods, to prevent cell damage is selected from the group comprising skim milk, semi-skim milk, whole milk, bovine whey, casein, polysorbate 20, polysorbate 80 and triton.
  • the compound that prevents cell damage is at a concentration between 10-20% w/v.
  • the lyophilization of step (v) of the methods preferably, but without limitation, is carried out for two days at a temperature between -40 and -50 and a pressure between 0.080 and 0.2 mBar. (8-200 Pa).
  • the lyophilization time will depend on the operational conditions. Preferably, but not limited to, the lyophilization time is 1-3 days.
  • the microbial load is determined by any conventional method. Preferably, the microbial load is determined by counting the colony-forming units (CFU) of the lyophilized material in LB culture medium, considering for this the dilutions and the initial weight of the powder.
  • CFU colony-forming units
  • the present application also refers to the use of the lyophilized bacterial consortium to inhibit the development, prevent and/or treat diseases caused by plant pathogens and to promote their growth.
  • the use of the lyophilized bacterial consortium serves to prevent "sick foot” disease (Ggt). More preferably, the use of the lyophilized bacterial consortium serves to prevent "sick foot” disease (Ggt) in cereal plants. Even more preferably, the use of the lyophilized bacterial consortium serves to inhibit pathogen growth or prevent "sick foot” disease (Ggt) in cereal plants, such as, but not limited to, wheat, rye, triticale.
  • the present application also discloses a method for inhibiting the development of infectious diseases caused by plant pathogens and promoting their growth, which comprises applying the lyophilized bacterial consortium to seeds from which said plants grow, to produce seeds inoculated with the bacterial consortium, where the application of the lyophilized bacterial consortium in the seeds comprises the stages of:
  • step (b) mixing the seeds obtained from step (a) with 10-20% by weight of a magnesium/calcium mixture (such as magnecal®), 15% by weight of water and 0.2% by weight of a mixture of liquid adhesive glue and water (ratio 1:9); (c) adding a loading of 1 x 10 9 to 1 x 10 11 CFU of the lyophilized bacterial consortium, obtained from any of the methods of preparation of the lyophilized bacterial consortium described above, to the mixture of step (b);
  • a magnesium/calcium mixture such as magnecal®
  • step (d) combining and homogenizing the mixture resulting from step (c) at a speed between 50 and 100 rpm, for a period of 5 to 15 minutes at room temperature; Y
  • step (e) dry the seeds obtained in step (d) at a temperature between 15 to 25°C for at least 3 hours, to obtain seeds inoculated with the bacterial consortium.
  • the surface disinfection method of the seeds of step (a) can be any method that does not alter the subsequent germination of the seeds.
  • surface disinfection is performed using a 15%-20% ethanol solution plus 1%-2% sodium hypochlorite, for 2-5 min, which is subsequently rinsed.
  • the step (d) of combination and homogenization of the mixture is carried out at a low speed so that the seeds are impregnated with the mixture and to prevent them from sticking together.
  • the seeds inoculated with the lyophilized bacterial consortium obtained from the method described above can be used to be planted directly in the soil or stored for a prolonged period, at room temperature, avoiding humidity.
  • the seeds can be stored for a period of between 1 to 3 years.
  • Example 1 Characterization of the bacterial strains of the bacterial consortium
  • the strains of the bacterial consortium were characterized according to the present invention, that is, the strain of Acinetobacter sp. E6.2 (Accession No.: RGM 3033), the strain of Bacillus sp. 4B (Accession No.: RGM 2948) and the strain of Serratia sp. 188.3 (Access No.: RGM 2949).
  • the characterization was carried out by specifically analyzing their capacity to inhibit the development of the Ggt fungus in vitro and the traits of these strains that could be associated with characteristics of plant growth promoting bacteria (PGPB).
  • PGPB plant growth promoting bacteria
  • Phosphorus solubilization capacity in agar was verified according to the formation of a halo in NBRIP medium (National Botanical Research Institute' phosphate) supplemented with tricalcium phosphate (Ca3[PO4]2).
  • This medium contains (in g/L): Glucose, 10; (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1 ; KCI, 0.2; MgSO4 x7H2O, 0.25; MgCl 2 x6H2O, 5; Hagar, 14; pH: 7 enriched with tricalcium phosphate, Ca3PO4, at 0.5% as a source of inorganic and insoluble phosphate.
  • PSM medium phytostease screening medium
  • PSM medium which contains sodium phytate (C6H 6 Nai 2 O 2 4P 6 xH2O) as the only source of phosphorus (5 g/L) and is composed of the following components per L, 10 g sucrose, 2 g (NH 4 )2SO 4 , 3 g tryptone, 2 g yeast extract, 0.5 g KCl, 0.5 g MgSO 4 , 0.01 g MnSO 4 -5H 2 O, 0.01 g PeSO 4 , 1 g Triton X- 100 and 15 g agar, pH: 7.0 Siderophore production was evaluated on agar plates with medium supplemented with chrome azurol S (CAS).
  • CAS chrome azurol S
  • Ggt was cultured on PDA agar plates at 25 °C for 1 week.
  • Agar discs (4 mm diameter) containing Ggt were aseptically incised and transferred to the center of agar plates containing LB/PDA medium (1:1).
  • two drops (5 pL) of each bacterial suspension were taken and placed in two diametric positions 2 cm from the agar disk containing the Ggt inoculum.
  • the growth of fungal mycelia was measured after incubation for 2, 5 and 7 days at 25°C in the dark. The percentage of inhibition was calculated based on the growth of the fungus without the presence of bacteria (control).
  • table 1 shows the PGPB-type traits, that is, phosphorus solubilization and siderophore production, as well as the ability to produce phenazines and the ability to inhibit the Ggt pathogen in vitro, by each one of the bacterial strains used in the present invention independently.
  • the strain of Acinetobacter sp. E6.2 not exhibited characteristics typical of PGPB, that is, phosphorus solubilization and siderophore production, but was only positive for the production of phenazine-type antibiotics.
  • the strains of Bacillus sp. 4B and Serratia sp. 188.3 were also capable of producing the antibiotic phenazine, since, as well as the strain of Acinetobacter sp. E6.2, also showed a band that amplified a 790 bp region consistent with the amplification of the gene encoding said antibiotic ( Figure 1).
  • strains of Bacillus sp. 4B and Serratia sp. 188.3 were able to solubilize phosphorus and produce siderophores, characteristics that, as mentioned above, could be correlated with the ability of these strains to promote plant growth.
  • Table 1 shows that the Acinetobacter sp. E6.2 inhibited 100% of the mycelial growth of Ggt in vitro, the Bacillus sp. 4B inhibited the growth of Ggt mycelium in vitro by 40% and the Serratia sp. 188.3 inhibited the growth of Ggt mycelium in vitro by 20%. Based on these results, the inventors considered that the mixture of isolated bacterial strains, previously characterized, showed great potential for the control of Ggt and the promotion of plant growth.
  • a preinoculum was prepared, where 50 pL of each microorganism were taken, and added to a tube with 5 mL of LB medium. This preinoculum was incubated for 24 hours at 100 rpm and 28°C.
  • an inoculum was prepared by adding the strains of Acinetobacter sp., Bacillus sp. and Serratia sp., in a proportion of 37%, 27% and 36%, respectively, to a bottle containing one liter of LB medium, in order to use the same proportion of microorganisms, which was calculated based on the growth optimum previously determined. This culture was incubated for 24 hours at 100 rpm and 28°C.
  • the bacteria were centrifuged at 5000 rpm for 10 minutes at room temperature.
  • the bacterial pellet obtained was washed three times with a NaOH saline solution at 0.85% w/v.
  • the bacterial pellet was frozen at -80°C in a 10% skim milk solution overnight. Subsequently, the lyophilization process was carried out for two days at a temperature of -52°C. Once the lyophilized bacterial consortium was obtained, the lyophilisate was counted, after which the value obtained corresponded to 3.3x10 16 CFU per gram of lyophilisate.
  • Example 3 Preparation of seeds inoculated with the lyophilized bacterial consortium.
  • the lyophilized bacterial consortium obtained above was used to be applied to wheat seeds.
  • 0.05 g of the lyophilized bacterial consortium was added to the seed mixture to obtain a load of 1 x10 10 CFU. Then, the previous mixture was homogenized at a speed of 20 rpm, for a period of 10 minutes, at room temperature, so that the seeds were impregnated with the mixture. Finally, the seeds inoculated with the bacterial consortium were dried at room temperature for at least 3 hours.
  • Example 4 Effect of the lyophilized bacterial consortium on the growth of wheat and on the inhibition of the development of Ggt in wheat.
  • the fungus Gaeumannomyces graminis var. Tritici (Ggt) was grown for 7 days in potato dextrose agar (PDA) medium at 25 ° C for 5 to 7 days. Subsequently, the fungus was inoculated into sterile oatmeal as a substrate, which had been sterilized in an autoclave at 121 ° C for three consecutive days. After 20 days, the oats with the pathogen were collected, ground and used as soil infection inoculum. For this, the soil was inoculated at 1% (1 gram of infection inoculum per 100 grams of soil), where this concentration is equal to or greater than that found naturally in infected soils.
  • PDA potato dextrose agar
  • the inventors found that the consortium not only inhibits the development of Ggt, but also observed that the lyophilized bacterial consortium is capable of increasing the biomass by more than 37% in the case of plants infected with the pathogen from seeds inoculated with the consortium (Consortium+Ggt) in relation to plants infected with the pathogen from non-inoculated seeds (Control+Ggt).
  • the lyophilized bacterial consortium increased biomass by more than 27% in the case of plants grown without the presence of the pathogen from seeds inoculated with the consortium (Consortium-Ggt) in relation to control plants from non-inoculated seeds ( Control-Ggt), thus demonstrating that the lyophilized bacterial consortium according to the present invention would exhibit plant growth promoting properties (Figure 3).
  • the proposed lyophilized bacterial consortium makes it possible to reduce the incidence of the Ggt pathogen and increase the productivity, in terms of the biomass produced, of cereal plants, as in the example, of seeds treated with wheat.
  • the skilled person will note that the choice of wheat plants was made by way of example only, since the method could be applicable to other cereal plants.
  • five additional experimental conditions were analyzed. In the first one, uninoculated wheat seeds were sown in pots using the infected soil described above (Control+Ggt).
  • wheat seeds inoculated with the bacterial strain of Serratia sp 188.3 obtained in example 3 were planted in pots using the infected soil described above (Serratia+Ggt).
  • wheat seeds inoculated with the bacterial strain of Bacillus sp 4B obtained in example 3, were sown in pots using the infected soil described above (Bacillus+Ggt).
  • wheat seeds inoculated with the bacterial strain of Acinetobacter sp E6.2 (Accession No.: RGM 3033), obtained in example 3, were sown in pots using the infected soil described above (Acinetobacter+Ggt).
  • wheat seeds inoculated with the lyophilized bacterial consortium obtained in example 3 were planted in pots using the infected soil described above (Consortium+Ggt). The results are shown in Figure 4 and in Table 4, which is shown below:
  • Table 4 Effect of the lyophilized bacterial consortium and each of the bacterial strains that comprise it on the percentage of Ggt infection in wheat plants.
  • the lyophilized bacterial consortium according to the invention has a greater inhibitory effect on the development of the Ggt fungus, that is, it has a significantly lower infection percentage, at least 50% lower, than each of the strains by themselves, evidencing a cooperative effect between the bacterial strains. Consequently, it is possible to note that the consortium, due to its composition of the three specific bacterial strains used, gives the invention a technical advantage in terms of a high capacity to inhibit the development of the Ggt pathogen in field crops.

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Abstract

Consorcio bacteriano liofilizado, que comprende una cepa de Acinetobacter sp., una cepa de Serratia sp., y una cepa de Bacillus sp. Método de preparación del mismo, uso y método que lo aplica para inhibir el desarrollo de enfermedades causadas por patógenos de plantas y promover el crecimiento de las mismas.

Description

CONSORCIO BACTERIANO LIOFILIZADO PARA EL CONTROL DE
GAEUMANNOMYCES GRAMINIS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención divulga un consorcio bacteriano liofilizado que comprende dos cepas bacterianas endof (ticas (Acínetobacter sp y Serratia sp) y una cepa bacteriana rizosférica (Bacillus sp), el método de obtención de dicho consorcio, y el uso de dicho consorcio para inhibir el desarrollo, prevenir y/o tratar enfermedades causadas por patógenos de plantas y para promover el crecimiento de las mismas. El consorcio bacteriano liofilizado es aplicado en semillas de plantas para inhibir el desarrollo el desarrollo de enfermedades causadas por patógenos de plantas, así como también para promover el crecimiento en las plantas.
PROBLEMA DE LA TÉCNICA
La enfermedad del “mal del pie” es una enfermedad causada por el hongo Gaeumannomyces graminis var. Trítici (Ggt). Este fitopatógeno afecta a las raíces de cereales como es el caso de trigo, centeno y triticale causando importantes pérdidas económicas. En el caso del trigo, que es el cereal de mayor importancia económica y cultural, las pérdidas en la producción causadas por este hongo van desde un 30% a un 50%, siendo esta una de las enfermedades más severas que afecta los cultivos a nivel mundial. Sumado a esto la capacidad del hongo de formar estructuras de sobrevivencia, como apotecios, le permiten sobrevivir en el suelo o en restos de tejidos de manera prolongada, lo que hace que el control sea extremadamente difícil y se restrinja principalmente al uso de agentes químicos para tratar esta enfermedad. Al respecto se destaca la desinfección de suelo o semilla mediante el uso de fungicidas tales como azoxistrobina, silthiofam y triticonazole. Sin embargo, el uso de los agentes químicos genera un gasto económico extra, el cual es acompañado por la correspondiente contaminación ambiental y el daño ecológico causado al ecosistema que genera su utilización.
Por otra parte, y con la finalidad de limitar la contaminación debida a agentes químicos, se han utilizados otras prácticas agrícolas o sistemas de siembra alternativos, en donde destacan las rotaciones de cultivo, las cuales apuntan a no sembrar la misma familia de plantas por períodos consecutivos. Bajo esta estrategia, mientras más años transcurran entre una siembra de determinado cultivo y la siguiente, mayor será el control que se podrá tener ante la enfermedad. Sin embargo, como este fitopatógeno afecta a otros cereales, los agricultores se ven obligados a realizar las rotaciones de cultivo descartando otras especies de gramíneas para evitar o disminuir el riesgo de infecciones subsecuentes, con lo cual sus opciones de cultivo se ven severamente restringidas.
Adicionalmente y dada la complejidad de realizar rotaciones adecuadas para el control de la enfermedad causada por Ggt, y en búsqueda de nuevas alternativas que permitan combatir este patógeno, se han desarrollado investigaciones que han evidenciado que sembrar cereales de manera consecutiva en el mismo lugar, proceso denominado monocultivo, ha llevado al desarrollo de suelos supresivos a la enfermedad. Los suelos supresivos se definen como aquellos suelos que, a pesar de la presencia del patógeno, son inmunes o presentan baja incidencia a la enfermedad debido principalmente a la presencia de microorganismos benéficos que ayudan a controlar el fitopatógeno (Duran et al., 2017. Screening and characterization of potentially suppressive soils against Gaeumannomyces graminis under extensive wheat cropping by Chilean indigenous communities). Entre dichos microorganismos, es posible destacar las bacterias promotoras de crecimiento vegetal o PGPB (Plant Growth-Promoting Bacteria) que son capaces de ayudar a las plantas a sobrevivir a factores ambientales (abióticos) o a enfermedades causadas por fitopatógenos (factores bióticos) mediante la producción de enzimas, hormonas o antibióticos.
Dentro de la producción de antibióticos está la producción de fenazina, que es exclusivamente producido por bacterias. Sin embargo, y a pesar de los numerosos estudios en relación al uso de PGPB para aplicaciones agronómicas, su uso a nivel de campo ha sido muy limitado. Esto se debe, entre otras razones, principalmente a que los microorganismos foráneos tienen a menudo una baja persistencia y permanencia en el suelo donde son introducidos debido a la ardua competencia con los microorganismos nativos. Adicionalmente, las formulaciones que se han probado en campo suelen ser muy inestables y no aseguran la actividad de los microorganismos, por lo que la formulación que contiene los microorganismos, y consecuentemente el método mediante el cual se produce, es crucial para asegurar la estabilidad, sobrevida y la actividad de las PGPB. Una posible solución a este problema es el uso de consorcios microbianos formulados con bacterias endófitas, las cuales son bacterias PGPB capaces de sobrevivir al interior de los tejidos de la planta, sin causar daño a esta, lo que trae consigo múltiples ventajas evolutivas. De ese modo, las bacterias colonizan un ambiente más benevolente al interior de la planta, lo que favorece su sobrevida y consecuentemente sus efectos positivos. Sin embargo, no existen evidencias prácticas del uso de PGPB para el control de la enfermedad del mal del pie causada por Ggt.
En consecuencia, considerando el problema técnico asociado a la enfermedad del mal del pie provocada por Ggt, sumado a que no existe una estrategia eficaz, amigable con el medio ambiente y que además permita el cultivo de especies de gramíneas de forma continua sin el riesgo de que los cultivos contraigan y propaguen a las generaciones futuras este hongo fitopatógeno, es de crucial importancia buscar nuevas estrategias y alternativas para solucionar dicho problema técnico. ESTADO DEL ARTE
Adicionalmente al control a través de agentes químicos como los fungicidas anteriormente mencionados, en un intento de controlar de manera eficaz el hongo Gaeumannomyces graminis var. Trítici (Ggt), se han desarrollado diversas estrategias con miras a desarrollar alternativas más naturales y/o amigables con el medio ambiente.
De este modo, en la actualidad existen tratamientos donde se demuestra el uso de recubrimientos de semillas para promover la salud y crecimiento de una planta. Así, por ejemplo, la solicitud de patente US 20170245494, divulga una película multicapa bioactiva y biodegradable. La película multicapa incluye uno o más compuestos bioactivos o microorganismos para promover el crecimiento y la salud de una planta, los cuales están contenidos entre las capas de la película, en donde cada una de las capas comprende aproximadamente 60% a aproximadamente 75% (m/m) de polihidroxialcanoato. Los compuestos bioactivos o microorganismos pueden incluir cualquiera de, o una combinación de: un metabolite, un compuesto antimicrobiano, una enzima, un microorganismo vivo, un fertilizante, una hormona de crecimiento vegetal, un conservante, un pesticida o un herbicida. La liberación de uno o más compuestos bioactivos se puede lograr de una manera controlada y programada. Cabe destacar que el documento US 20170245494 no divulga un consorcio bacteriano liofilizado como el divulgado en la presente solicitud. Adicionalmente, la presente invención se diferencia del documento US 20170245494, en que los microorganismos utilizados por los inventores son bacterias aisladas desde suelos con características supresivas, las cuales son capaces de producir antibióticos del tipo fenazinas, y además son capaces de promover el crecimiento de las plantas al producir enzimas que solubilizan fósforo (como por ejemplo fosfatasas y f itasas) , que lo dejan disponible para la nutrición de la planta. Junto con lo anterior, las bacterias del consorcio de la presente invención además producen sideróforos (como por ejemplo hidroxamatos), los cuales son capaces de quelar el hierro y dejarlo disponible para la planta, lo que de manera indirecta evita que se encuentre disponible para la nutrición del fitopatógeno. Por lo tanto, la presente invención reúne varios elementos técnicos que el documento US 20170245494 no divulga ni sugiere y que, por tanto, la diferencian sustancialmente con dicho documento.
Por otro lado, se han utilizado consorcios microbianos aislados con la capacidad de generar moléculas capaces de promover el crecimiento de las plantas, así como la resistencia a enfermedades. En este ámbito el documento CN 106244490 divulga un compuesto fertilizante microbiano para prevenir y tratar enfermedades de plantas, particularmente de trigo, y un método de preparación del compuesto fertilizante microbiano. El compuesto fertilizante microbiano consiste en las siguientes cepas: Streptomyces catenulae, Streptomyces albolongus, Bacillus flexus, Bacillus aryabhattai y Tríchoderma brevicom pactum. Las cepas en el documento inducen a la planta de trigo a generar resistencia a enfermedades en virtud de la producción de metabolites secundarios y de diversos antibióticos, tales como proceomicina, neomicina E, catenulina, diparomomicina y similares, que inhiben los microorganismos patógenos de la enfermedad del trigo. Las cinco cepas seleccionadas en el documento CN 106244490 fueron directamente aisladas del suelo y tienen un efecto promotor del crecimiento de la rizosfera. Además, pueden promover la reproducción y el crecimiento en las superficies de cultivo o en las plantas o el suelo. Adicionalmente el documento CN 106244490 divulga que las cepas pueden tener un efecto sobre la fijación de nitrógeno y pueden promover la secreción direccional de algunos metabolites secundarios de la rizosfera de la planta.
Asimismo, también se ha reportado el uso de cepas bacterianas individuales para tratar el mal del pie de trigo. Así, por ejemplo, el documento CN 103074271 , divulga un inoculo microbiano pulverizado, elaborado mediante la preparación en aerosol seco de una solución de fermentación de la cepa de Bacillus subtilis YB-05. De acuerdo al documento, la cepa YB- 05 y su inoculante tendrían las ventajas de contar con un amplio espectro antibacteriano, buen efecto antimicrobiano y fuertes efectos de inhibición sobre la enfermedad del trigo (mal del pie), de la Botrytis cinérea en el tomate, los hongos del tizón de la vaina del trigo, Phytophthora melonis y similares. Además, el inoculante tendría las ventajas de alta eficiencia, no toxicidad, uso simple y sin contaminación ambiental.
Es importante destacar que los documentos CN 106244490 y CN 103074271 antes citados, no divulgan un consorcio bacteriano liofilizado como el divulgado en la presente solicitud. Además, a diferencia de los microorganismos divulgados en dichos documentos, el consorcio bacteriano liofilizado de la presente invención fue aislado de suelos supresivos. De este modo, por ejemplo, Serratia sp corresponde a un microorganismo aislado de los tejidos de plantas que fueron crecidas en suelos supresivos (cepa endofítica), Bacillus sp. corresponde a un microorganismo aislado desde suelo en contacto con las raíces de las plantas (cepa rizosférica), y por último Acinetobacter sp. fue también aislada desde el interior de las raíces de trigo (cepa endofítica). En este contexto, cabe señalar que se ha demostrado que la utilización de microorganismos endofíticos proporciona una ventaja comparativa debido principalmente a que los microorganismos crecidos en estos ambientes son microorganismos que han evolucionado para generar una asociación entre los microorganismos y la planta. Esta ventaja evolutiva ayuda a promover un efecto benéfico, reflejado en una protección frente a factores abióticos (sequía, salinidad, pH, nutrientes, etc.) y bióticos (como competencia con otros microorganismos). Por tanto, microorganismos aislados de suelos supresivos, como los de la presente invención, son significativamente distintos a los microorganismos de los documentos CN 106244490 y CN 10307427. Junto con las diferencias antes mencionadas, si bien ambos documentos describen que las cepas producirían antibióticos, no se describe que esas cepas produzcan fenazinas, antibióticos sí producidos por el consorcio de la presente invención. Adicionalmente, las bacterias utilizadas en la presente invención producen también sideróforos, como por ejemplo hidroxamatos, los cuales son capaces de quelar el hierro y dejarlo disponible para la planta, lo que de manera indirecta evita que se encuentre disponible para la nutrición del fitopatógeno. Dicha característica técnica asociada a la producción de sideróforos no fue descrita ni sugerida en ninguno de los documentos CN 106244490 y CN 10307427. Por lo tanto, la presente invención reúne vahos elementos técnicos que la diferencian sustancialmente con dichos documentos de origen chino.
Por otro lado, en el estado del arte se encuentra divulgada la utilización de microorganismos, como cepas individuales, en conjunto con antibióticos tipo fenazinas para tratar enfermedades de plantas. En este contexto por ejemplo el documento CN 107306999, divulga una composición bactericida basada en ácido fenazina-1 -carboxílico y una bacteria que la contiene, donde los componentes activos de la composición bactericida son ácido fenazina-1 -carboxílico y Bacillus cereus, que se encuentran en una relación en peso de ácido fenazina-1 -carboxílico al Bacillus cereus de 1 :100-100:1 , en donde el contenido de Bacillus cereus por gramo de composición bactericida es de 106 - 1011/g, y el bactericida contiene 1 - 90% en peso de la composición bactericida. En contraste con este documento, la presente invención se basa en un consorcio bacteriano y no en una cepa individual, en donde tal como se destacó anteriormente, el consorcio bacteriano está constituido por bacterias aisladas desde suelos supresivos, con todas las ventajas que estas conllevan. Asimismo, en el documento de origen chino, utilizan una combinación del microorganismo Bacillus cereus con un tipo de fenazina, particularmente ácido fenazina-1 -carboxílico, el cual según la solicitud es producido por Pseudomonas fluorescens, por lo que no se ensaya el efecto del microorganismo y de los metabolites que el mismo produce. Del mismo modo, no se describe ni sugiere que la cepa de Bacillus cereus produzca enzimas capaces de solubilizar fósforo, ni sideróforos. Adicionalmente, no se describe el uso particular para inhibir el desarrollo del patógeno o controlar la enfermedad del “mal del pie” de trigo causada por Ggt.
Por tanto, la presente invención se diferencia de los documentos citados, en que divulga un consorcio bacteriano liofilizado no descrito en el arte previo, que además de producir el antibiótico fenazina, también aporta factores trascendentales para la nutrición y la salud vegetal a través, por ejemplo, de la solubilización de fósforo y la producción de sideróforos. En este contexto, la invención de la presente solicitud de patente se basa particularmente en un consorcio bacteriano liofilizado que consiste en dos bacterias aisladas de suelos supresivos, Bacillus sp. (depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM), bajo el número de acceso: RGM 2948, con fecha 28 de enero de 2020) y Serratia sp. (depositada en la CChRGM , bajo el número de acceso: RGM 2949, con fecha 28 de enero de 2020) y una bacteria denominada Acinetobacter sp. aislada de estudios preliminares (Duran et al., 2014, Endophytic bacteria from selenium-supplemented wheat plants could be useful for plant-growth promotion, biofortification and Gaeumannomyces graminis biocontrol in wheat production; depositada en la CChRGM, bajo el número de acceso: RGM 3033, con fecha 11 de agosto de 2020). La utilización de estas bacterias evolucionadas en suelos supresivos aseguran un control sobre patógenos de plantas, así como también ayudan a promover el crecimiento y salud de las mismas.
En consecuencia, a partir de los documentos del estado de la técnica es posible concluir que a la fecha no existe un consorcio bacteriano liofilizado como el divulgado en la presente invención que solucione el problema de la técnica, correspondiente a tratar enfermedades causadas por patógenos de plantas (como por ejemplo trigo, centeno, triticale, hortalizas y cultivos), más particularmente la enfermedad del “mal del pie” causada por el hongo fitopatógeno Gaeumannomyces graminis (Ggt), sin afectar, o incluso también promoviendo, el crecimiento en las plantas. Por lo tanto, específicamente, el arte previo no divulga ni sugiere el consorcio bacteriano liofilizado de la presente solicitud, capaz de no solo disminuir el porcentaje de infección del patógeno Gaeumannomyces graminis causante del mal del pie en cereales, sino además promover la salud de la planta a través de la solubilización de fósforo y producción de sideróforos. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Esta figura muestra la fotografía de un gel de agarosa donde se observa una amplificación de PCR donde se advierte el tamaño esperado para el gen que codifica para fenazina (790 pb). Nomenclatura del gel de agarosa al 1%, MP: marcador de peso molecular; E6.2: Acinetobacter sp. E6.2 (N° de acceso: RGM 3033); 188.3: Serratia sp. 188.3 (N° de acceso: RGM 2949); 4B: Bacillus sp. 4B (N° de acceso: RGM 2948); C(-): control negativo.
Figura 2: Esta figura muestra un gráfico donde se compara el porcentaje de infección en plantas de trigo, crecidas desde semillas inoculadas con el consorcio bacteriano liof ilizado (consorcio), o sin el consorcio bacteriano liofilizado (control), sembradas en suelos en presencia del hongo Gaeumannomyces graminis var. Tritici(Ggt) (+Ggt) o en ausencia de Ggt (-Ggt).
Figura 3: Esta figura muestra un gráfico donde se compara la biomasa obtenida de plantas de trigo crecidas desde semillas inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado (consorcio), o sin el consorcio bacteriano liofilizado (control), sembradas en suelos en presencia del hongo Ggt (+Ggt) o en ausencia de Ggt (-Ggt).
Figura 4: Esta figura muestra un gráfico donde se compara el porcentaje de infección en plantas de trigo, en relación a las raíces necróticas de plantas de trigo infectadas (+Ggt), crecidas desde semillas no inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado (Control); crecidas desde semillas inoculadas con cada una de las cepas bacterianas por separado que forman parte del consorcio, es decir, Serratia sp. 188.3 (Serratia); Bacillus sp. 4B (Bacillus); y Acinetobacter sp. E6.2 (Acinetobacter); y crecidas desde semillas inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado (Consorcio);. Las letras indican diferencias estadísticas (las letras fueron obtenidas a través del test de Tukey)., en donde diferentes letras indican diferencias estadísticas a p<0,05. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención divulga un consorcio bacteriano liofilizado, que comprende dos cepas de bacterias endofíticas (Acinetobacter sp. y Serratia sp.) y una cepa bacteriana rizosférica (Bacillus sp), el método de obtención del consorcio bacteriano liofilizado, y su uso en la inhibición del desarrollo, el tratamiento y/o prevención de enfermedades causadas por patógenos de plantas, así como también, en la promoción del crecimiento de dichas plantas. Asimismo, se divulga un método para inhibir el desarrollo de enfermedades causadas por patógenos de plantas y promover el crecimiento de las mismas, que comprende aplicar el consorcio bacteriano liofilizado a semillas desde las que crecen dichas plantas.
Las cepas bacterianas utilizadas en la presente invención han sido aisladas y seleccionadas desde suelos supresivos, a partir de sus características de promoción del crecimiento vegetal (en base a una correlación dependiente de su capacidad de solubilización de fósforo y producción de sideróforos), a la producción de antibióticos del tipo fenazinas (mediante la identificación del gen que codifica para fenazina por PCR usando partidores específicos) y principalmente a la capacidad de inhibir el crecimiento del hongo Gaeumannomyces graminis var. Tritici (Ggt) in vitro.
Las cepas del consorcio bacteriano de la presente invención fueron depositadas en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM), en su calidad de Autoridad Internacional de Depósito (IDA). La cepa de Acinetobacter sp. (E6.2) fue depositada en la CChRGM bajo el número de acceso: RGM 3033, con fecha 1 1 de agosto de 2020. La cepa de Serratia sp. (188.3) fue depositada en la CChRGM, bajo el número de acceso: RGM 2949, con fecha 28 de enero de 2020. La cepa de Bacillus sp. (4B) fue depositada en la CChRGM, bajo el número de acceso: RGM 2948, con fecha 28 de enero de 2020. Las cepas del consorcio bacteriano de la invención presentan una o más de las siguientes características: capacidad para solubilización de fósforo, producción de sideróforos, producción de fenazinas e inhibición de Ggt in vitro.
En términos generales, la cepa Acinetobacter sp. E6.2 (N° de acceso: RGM 3033) tiene la capacidad de producir fenazinas y de inhibir significativamente el desarrollo de Ggt in vitro. Por otra parte, las cepas de Bacillus sp. 4B (N° de acceso: RGM 2948) y Serratia sp. 188.3 (N° de acceso: RGM 2949) tienen la capacidad de solubilizar fósforo, producir sideróforos e inhibir parcialmente el desarrollo de Ggt in vitro.
La presente invención divulga un consorcio bacteriano liofilizado que comprende la cepa de Acinetobacter sp. E6.2 (N° de acceso: RGM 3033), la cepa de Bacillus sp. 4B (N° de acceso: RGM 2948) y la cepa de Serratia sp. 188.3 (N° de acceso: RGM 2949).
El consorcio bacteriano liofilizado de acuerdo con la presente invención tiene 1 x1014 a 4x1016 UFC por gramo de consorcio bacteriano liofilizado.
El consorcio bacteriano liofilizado de acuerdo con la invención puede ser utilizado para tratar y/o prevenir enfermedades infecciosas causadas por patógenos de plantas y para promover el crecimiento de las mismas. Asimismo, el consorcio bacteriano liofilizado se puede aplicar a semillas, en un método para inhibir el desarrollo de enfermedades causadas por patógenos de plantas y promover el crecimiento de las mismas.
Preferentemente, pero sin estar limitado a, el consorcio bacteriano liofilizado de acuerdo con la presente invención puede ser utilizado para tratar y/o prevenir enfermedades de plantas causadas por el hongo Gaeumannomyces graminis var. Tritici (Ggt).
Preferentemente, pero sin estar limitado a, el consorcio bacteriano liofilizado de acuerdo con la presente invención puede ser utilizado para tratar enfermedades, preferentemente de gramíneas, más preferentemente de trigo, centeno y triticale. Asimismo, la presente invención divulga métodos de preparación del consorcio bacteriano liofilizado.
En una realización, el método de preparación del consorcio bacteriano liofilizado comprende las siguientes etapas: i), inocular un medio de cultivo estéril con una cepa bacteriana de Acinetobacter sp., con una cepa bacteriana de Bacillus sp., y con una cepa bacteriana de Serratia sp. en las proporciones 37%, 27% y 36%, respectivamente, e incubar por 24 a 36 horas, con agitación entre 50-150 rpm, a una temperatura de 28°C, para obtener un caldo bacteriano;
¡i), centrifugar el caldo bacteriano obtenido en la etapa (i) a entre 4000-6000 rpm, por 10- 15 minutos, para obtener un pellet bacteriano; iii). lavar el pellet bacteriano obtenido en la etapa (¡i) al menos 3 veces con una solución de lavado; iv). congelar el pellet bacteriano obtenido en la etapa (iii) por 12 a 16 horas, a -50 a -80eC, utilizando un medio que contenga un compuesto que evite el daño celular; y v). liofilizar el pellet de la etapa (iv) en un liofilizador para obtener el consorcio bacteriano liofilizado.
En otra realización, el método de preparación del consorcio bacteriano liofilizado puede realizarse mediante la producción y liofilización de las cepas bacterianas por separado, y posterior mezcla de las mismas para obtener el consorcio bacteriano liofilizado. En dicha realización, el método de preparación del consorcio bacteriano liofilizado comprende las siguientes etapas: i), inocular un primer medio de cultivo estéril con una cepa bacteriana de Acinetobacter sp., un segundo medio de cultivo estéril con una cepa bacteriana de Bacillus sp., y un tercer medio de cultivo estéril con una cepa bacteriana de Serratia sp., e incubar por 24 a 36 horas, con agitación entre 50-150 rpm, a una temperatura de 28°C, para obtener un primer, un segundo y un tercer caldo bacteriano, respectivamente;
¡i), centrifugar el primer, el segundo y el tercer caldo bacteriano obtenidos en la etapa (i), respectivamente, a entre 4000-6000 rpm, por 10-15 minutos, para obtener un primer, un segundo y un tercer pellet bacteriano, respectivamente; iii). lavar el primer, el segundo y el tercer pellet bacteriano obtenidos en la etapa (¡i), respectivamente, al menos 3 veces con una solución de lavado; iv). congelar el primer, el segundo y el tercer pellet bacteriano obtenidos en la etapa (iii), respectivamente, por 12 a 16 horas, a -50 a -80eC, utilizando un medio que contenga un compuesto que evite el daño celular; v). liofilizar el primer, el segundo y el tercer pellet bacteriano obtenidos de la etapa (iv), respectivamente, en un liofilizador para obtener un primer, un segundo y un tercer liofilizado bacteriano, en donde el primer liofilizado comprende la cepa bacteriana de Acinetobacter sp., el segundo liofilizado comprende la cepa bacteriana de Bacillus sp., y el tercer liofilizado comprende la cepa bacteriana de Serratia sp. y vi), mezclar el primer, el segundo y el tercer liofilizado en las proporciones 37%, 27% y
36%, respectivamente, para obtener el consorcio bacteriano liofilizado.
En esta segunda realización, la única diferencia se encuentra en el momento en el cual se combinan las cepas bacterianas para formar el consorcio bacteriano, siendo en la etapa (i) del método de la primera realización antes descrita, y en la etapa vi) en el método de la segunda realización antes descrita. Sin embargo, el entendido en la materia comprenderá que cualquiera sea el método que se utilice, el resultado en relación con el consorcio bacteriano liofilizado será el mismo.
En relación con las realizaciones antes descritas, preferentemente la cepa bacteriana de Acinetobacter sp. es la cepa E6.2 (N° de acceso: RGM 3033), la cepa bacteriana de Bacillus sp. es la cepa 4B (N° de acceso: RGM 2948) y la cepa bacteriana de Serratia sp. es la cepa 188.3 (N° de acceso: RGM 2949).
Si las cepas bacterianas están almacenadas y no disponibles en cultivo fresco previo a la realización del método, se realiza una etapa previa a la etapa (i) antes descrita, en la cual se reactivan dichas cepas bacterianas a través de la realización de un preinóculo en un medio que permite una adecuada recuperación de las cepas bacterianas.
Las cepas bacterianas pueden estar almacenadas a través de cualquier técnica convencional. Preferentemente, pero sin limitación, las cepas bacterianas almacenadas se encuentran en una solución de 20% glicerol y 80% medio de cultivo. Preferentemente, pero sin limitación, el medio de cultivo es medio de cultivo LB.
Preferentemente, pero sin limitación, el preinóculo de las cepas bacterias se realiza en el medio que permite una adecuada recuperación de las cepas bacterianas, diluyendo las cepas bacterianas de 50 a 100 veces en dicho medio de cultivo. El medio de cultivo que permite una adecuada recuperación de las cepas bacterianas se selecciona de cualquier medio general apto para el crecimiento bacteriano. Preferentemente, pero sin limitación, el medio general apto para el crecimiento bacteriano se selecciona del grupo que comprende: caldo nutritivo, extracto de malta, medio MRS, medio TSA y medio LB. Más preferentemente, el medio de cultivo que permite una adecuada recuperación de las cepas bacterianas es medio LB. Para la reactivación, preferentemente, el preinóculo se incuba por 24 a 36 horas, con agitación entre 50-150 revoluciones por minuto (rpm) a una temperatura de 28°C.
En la etapa (i) de los métodos, el medio de cultivo estéril es un medio de cultivo adecuado para el crecimiento de las cepas bacterianas, que se selecciona de cualquier medio general apto para el crecimiento bacteriano. Preferentemente, pero sin limitación, dicho medio general apto para el crecimiento bacteriano se selecciona del grupo que comprende: caldo nutritivo, extracto de malta, medio MRS, medio TSA y medio LB. Más preferentemente, el medio de cultivo adecuado para el crecimiento de las cepas bacterianas, es decir el medio de cultivo estéril, es medio LB.
La etapa (¡i) de centrifugación de los métodos, preferentemente, se realiza a temperatura ambiente.
La solución de lavado que se utiliza en la etapa (iii) de los métodos, puede ser agua destilada o una solución salina, en donde la solución salina es preparada con sales seleccionadas del grupo que comprende: NaOH y KOH. Preferentemente, la solución salina es NaOH al 0,5-1 % (p/v).
El compuesto utilizado en la etapa iv) de los métodos, para evitar el daño celular, se selecciona desde el grupo que comprende leche descremada, leche semidescremada, leche entera, suero bovino, caseína, polisorbato 20, polisorbato 80 y tritón. Preferentemente, el compuesto que evita el daño celular se encuentra a una concentración entre 10-20 % p/v.
La liofilización de la etapa (v) de los métodos, preferentemente, pero sin limitación, se lleva a cabo por dos días a una temperatura de entre -40eC y -50eC y a una presión de entre 0,080 a 0,2 mBar (8-200 Pa). El tiempo de liofilización dependerá de las condiciones operacionales. Preferentemente, pero sin limitación, el tiempo de liofilización es de 1 -3 días. Una vez obtenido el consorcio bacteriano liofilizado, la carga microbiana se determina mediante cualquier método convencional. Preferentemente, la carga microbiana se determina mediante el conteo de las unidades formadoras de colonias (UFC) del material liofilizado en medio de cultivo LB, considerando para ello las diluciones y el peso inicial del polvo.
La presente solicitud también se refiere al uso del consorcio bacteriano liofilizado para inhibir el desarrollo, prevenir y/o tratar enfermedades causadas por patógenos de plantas y para promover el crecimiento de las mismas. Preferentemente, el uso del consorcio bacteriano liofilizado sirve para prevenir la enfermedad del “mal del pie” (Ggt). Más preferentemente, el uso del consorcio bacteriano liofilizado sirve para prevenir la enfermedad del “mal del pie” (Ggt) en plantas cereales. Aún más preferentemente, el uso del consorcio bacteriano liofilizado sirve para inhibir el desarrollo del patógeno o prevenir la enfermedad del “mal del pie” (Ggt) en plantas de cereales, tales como, pero sin estar limitados a, trigo, centeno, triticale.
La presente solicitud, además divulga un método para inhibir el desarrollo de enfermedades infecciosas causadas por patógenos de plantas y promover el crecimiento de las mismas, que comprende aplicar el consorcio bacteriano liofilizado a semillas desde las que crecen dichas plantas, para producir semillas inoculadas con el consorcio bacteriano, en donde la aplicación del consorcio bacteriano liofilizado en las semillas comprende las etapas de:
(a) desinfectar las semillas con un método de desinfección superficial;
(b) mezclar las semillas obtenidas de la etapa (a) con 10 - 20 % en peso de una mezcla de magnesio/calcio (tal como magnecal®), 15 % en peso de agua y 0,2 % en peso de una mezcla de pegamento adhesivo líquido y agua (proporción 1 :9); (c) agregar una carga de 1 x109 a 1x1011 UFC del consorcio bacteriano liofilizado, obtenido a partir de cualquiera de los métodos de preparación del consorcio bacteriano liofilizado antes descritos, a la mezcla de la etapa (b);
(d) combinar y homogenizar la mezcla resultante de la etapa (c) a una velocidad de entre 50 y 100 rpm, por un período de 5 a 15 minutos a temperatura ambiente; y
(e) secar las semillas obtenidas en la etapa (d) a una temperatura entre 15 a 25°C por al menos 3 horas, para obtener semillas inoculadas con el consorcio bacteriano.
El método de desinfección superficial de las semillas de la etapa (a), puede ser cualquier método que no altere la posterior germinación de las semillas. Preferentemente, la desinfección superficial se realiza utilizando una solución al 15%-20% de etanol más 1%-2% de hipoclorito de sodio, por 2-5 min, la cual es posteriormente enjuagada.
La etapa (d) de combinación y homogenización de la mezcla se realiza a una baja velocidad para que las semillas se impregnen con la mezcla y para evitar que se peguen.
Las semillas inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado obtenidas a partir del método antes descrito pueden ser utilizadas para ser plantadas directamente en el suelo o almacenadas por un período prologado, a temperatura ambiente, evitando humedad. Preferentemente, las semillas se pueden almacenar por un período de entre 1 a 3 años.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no representan de modo alguno una limitación de la presente invención. Ejemplo 1 : Caracterización de las cepas bacterianas del consorcio bacteriano
Inicialmente se caracterizaron las cepas del consorcio bacteriano de acuerdo con la presente invención, es decir, la cepa de Acinetobacter sp. E6.2 (N° de acceso: RGM 3033), la cepa de Bacillus sp. 4B (N° de acceso: RGM 2948) y la cepa de Serratia sp. 188.3 (N° de acceso: RGM 2949).
La caracterización se realizó analizando específicamente su capacidad de inhibición del desarrollo del hongo Ggt in vitro y los rasgos de estas cepas que se podrían asociar a características propias de bacterias promotoras de crecimiento vegetal (PGPB).
Para evaluar los rasgos tipo PGPB, se analizó la capacidad de solubilización de fósforo y la capacidad de producción de sideróforos de las distintas cepas.
La capacidad de solubilización de fósforo en agar fue verificada de acuerdo a la formación de un halo en medio NBRIP (National Botanical Research Institute’ phosphate) suplementado con fosfato tricálcico (Ca3[PO4]2). Este medio contiene (en g/L): Glucosa, 10; (NH4)2SO4, 0.1 ; KCI, 0.2; MgSO4x7H2O, 0.25; MgCI2x6H2O, 5; Agar, 14; pH: 7 enriquecido con fosfato tricálcico, Ca3PO4, al 0.5% como fuente de fosfato inorgánico e insoluble. Además se probaron con medio PSM (phytase screening medium) el cual contiene fitato de sodio (C6H6Nai2O24P6xH2O) como única fuente de fósforo (5 g/L) y se compone de los siguientes componentes por L, 10 g sucrosa, 2 g (NH4)2SO4, 3 g triptona, 2 g extracto de levadura, 0.5 g KCI, 0.5 g MgSO4, 0.01 g MnSO4-5H2O, 0.01 g PeSO4, 1 g Triton X-100 y 15 g agar, pH: 7.0 La producción de sideróforos fue evaluada en placas de agar con medio suplementado con chrome azurol S (CAS).
Por otra parte, para evaluar la capacidad de producción de antibióticos, se analizó la expresión del gen que codifica fenazinas, realizando un ensayo de PCR mediante el uso de partidores específicos para el gen que codifica el antibiótico fenazina (PHZ1 ,5'- GGCGACATGGTCAACGG-3' y PHZ2, 5'-CGGCTGGCGGCGTATTC-3'), en donde dicho antibiótico fue identificado en la banda que amplifica una región de 790 pares de bases (bp). (Figura 1 ).
Finalmente se analizó el porcentaje de inhibición del desarrollo de Ggt que tenía cada una de las cepas in vitro. Para lo anterior, se cultivó Ggt en placas de agar PDA a 25 °C durante 1 semana. Discos de agar (4 mm de diámetro) que contenían Ggt se incisaron asépticamente y se transfirieron al centro de placas de agar que contenían medio LB/PDA (1 :1). Luego, se tomaron dos gotas (5 pL) de cada suspensión de bacterias y se colocaron en dos posiciones diamétricas a 2 cm del disco de agar que contenía el inoculo de Ggt. Se midió el crecimiento de micelios fúngicos después de la incubación durante 2, 5 y 7 días a 25°C en oscuridad. El porcentaje de inhibición se calculó en base al crecimiento del hongo sin presencia bacteriana (control).
A modo de resumen, la tabla 1 , muestra los rasgos tipo PGPB, es decir, solubilización de fósforo y producción de sideróforos, así como también, la capacidad de producir fenazinas y la capacidad de inhibición del patógeno Ggt in vitro, por parte de cada una de las cepas bacterianas utilizadas en la presente invención de manera independiente.
Tabla 1. Caracterización individual de las cepas que conforman el consorcio bacteriano
Cepa Solubilización Producción de Producción % inhibición de de fósforo sideróforos de fenazinas Ggt in vitro
Bacillus sp. 4B +++ Positivo positivo 40
Serratia sp. 188.3 + Positivo positivo 20
Acinetobacter sp. E6.2 negativo Negativo positivo 100
Tal como se muestra en la Tabla 1 , en relación con los rasgos PGPB, que podrían estar asociados a la promoción del crecimiento vegetal, la cepa de Acinetobacter sp. E6.2 no exhibió características propias de las PGPB, es decir, solubilización de fósforo y producción de sideróforos, sino que sólo fue positiva para la producción de antibióticos del tipo fenazinas. A través del ensayo de PCR se determinó además que las cepas de Bacillus sp. 4B y Serratia sp. 188.3 también eran capaces de producir el antibiótico fenazina, ya que, así como la cepa de Acinetobacter sp. E6.2, también mostraron una banda que amplificaba una región de 790 bp consistente con la amplificación del gen que codifica dicho antibiótico (Figura 1 ).
Adicionalmente, las cepas de Bacillus sp. 4B y Serratia sp. 188.3 fueron capaces de solubilizar fósforo y producir sideróforos, características que tal como se mencionó anteriormente, se podrían correlacionar con la capacidad de esas cepas de promover el crecimiento vegetal.
Por otra parte, con respecto a la capacidad de inhibir el crecimiento de Ggt in vitro, en la tabla 1 se observa que la cepa de Acinetobacter sp. E6.2 inhibió el 100% del crecimiento del micelio de Ggt in vitro, la cepa de Bacillus sp. 4B inhibió el crecimiento del micelio de Ggt in vitro en un 40% y la cepa de Serratia sp. 188.3 inhibió el crecimiento del micelio de Ggt in vitro en un 20%. En base a dichos resultados, los inventores consideraron que la mezcla de las cepas bacterianas aisladas, antes caracterizadas, mostraba una gran potencialidad para el control de Ggt y la promoción del crecimiento de plantas.
Ejemplo 2: Preparación del consorcio bacteriano
En primer lugar, se realizaron pruebas de compatibilidad entre las cepas, para verificar que se podía generar un consorcio en donde las tres cepas bacterianas de la invención estuvieran activas. Para ello, se realizó un crecimiento confrontacional, midiendo por densidad óptica (a 600nm) la misma cantidad bacteriana de los tres aislados que conforman el consorcio y sembrando de manera estriada en placa de Petri con medio LB sólido estas tres cepas de la invención, es decir, Acinetobacter sp. E6.2, Bacillus sp. 4B, y Serratia sp. 188.3. en distintas combinaciones. Particularmente, se utilizaron las siguientes combinaciones: Acinetobacter sp.x Bacillus sp., Acinetobacter sp. Serratia sp. Bacillus sp. X Serratia sp. y Acinetobacter sp.x Bacillus sp. x Serratia sp., para evidenciar crecimiento óptimo de las tres cepas. A partir de este ensayo, se determinó el crecimiento óptimo y se encontró que las cepas de la invención efectivamente pueden crecer en consorcio sin inhibir el crecimiento entre sí.
Con ese antecedente, para la preparación del consorcio se utilizaron muestras de cada una de las cepas bacterianas previamente almacenadas en un stock de glicerol (20% g licerol + 80% medio de cultivo LB).
Para reactivar las cepas bacterianas de la invención, es decir bacterias de la cepa de Acinetobacter sp E6.2 (N° de acceso: RGM 3033), de Serratia sp 188.3 (N° de acceso: RGM 2949) y de Bacillus sp 4B (N° de acceso: RGM 2948), se realizó la preparación de un preinóculo, en donde se tomaron 50 pL de cada microorganismo, y se agregaron en un tubo con 5 mL de medio LB. Este preinóculo se incubó por 24 horas a 100 rpm y 28°C.
A partir del preinóculo antes descrito, se preparó un inoculo agregando las cepas de Acinetobacter sp., Bacillus sp. y Serratia sp., en una proporción de 37%, 27% y 36%, respectivamente, a un frasco que contenía un litro de medio LB, con la finalidad de usar la misma proporción de microorganismos, lo cual se calculó en base al crecimiento óptimo antes determinado. Este cultivo se incubó por 24 horas, a 100 rpm y 28°C.
Posteriormente, las bacterias fueron centrifugadas a 5000 rpm, por 10 minutos, a temperatura ambiente. El pellet bacteriano obtenido fue lavado tres veces con una solución salina de NaOH al 0,85 % p/v.
Una vez lavado, el pellet bacteriano fue congelado a -80°C en una solución 10% de leche descremada por una noche. Posteriormente, el proceso de liofilización se llevó a cabo por dos días a una temperatura de -52°C. Una vez obtenido el consorcio bacteriano liofi lizado , se realizó un conteo del liof ilizado , tras el cual el valor obtenido correspondió a 3,3x1016 UFC por gramo de liofilizado.
Ejemplo 3: Preparación de semillas inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado.
El consorcio bacteriano liofilizado obtenido anteriormente fue utilizado para ser aplicado a semillas de trigo.
Para esto primero se desinfectaron 1000 g de semillas de trigo con una solución al 20% de etanol más 1% de hipoclorito de sodio por 5 min. Las semillas se enjuagaron con agua corriente para luego ser mezcladas con 100 g de magnecal®, 150 mL de agua y 20 mL de una mezcla de pegamento adhesivo líquido (cola fría) y agua (proporción 1 :9).
Utilizando el valor del conteo del liofilizado del ejemplo 2, se estimó que por cada kilogramo de semilla se debía agregar 0,5 gramos de liofilizado bacteriano, para llegar a una carga microbiana de 1x1011 UFC.
En base a ello, se agregó a la mezcla de las semillas, 0,05 g del consorcio bacteriano liofilizado para obtener una carga de 1 x1010 UFC. Luego, se homogenize la mezcla anterior a una velocidad de 20 rpm, por un período 10 minutos, a temperatura ambiente, para que las semillas se impregnaran con la mezcla. Finalmente, las semillas inoculadas con el consorcio bacteriano fueron secadas a temperatura ambiente por al menos 3 horas.
Se llevó a cabo el mismo procedimiento utilizando cada una de las cepas del consorcio bacteriano de manera independiente (en lugar del consorcio), de modo de producir semillas inoculadas con solo una de las cepas para verificar el comportamiento particular de cada una de ellas en la inhibición del crecimiento de Ggt en el ejemplo 4. Ejemplo 4: Efecto del consorcio bacteriano liof ilizado en el crecimiento de trigo y en la inhibición del desarrollo de Ggt en trigo.
Para realizar los ensayos, en primer lugar, el hongo Gaeumannomyces graminis var. Trítici (Ggt) se hizo crecer por 7 días en medio agar de papa y dextrosa (PDA) a 25eC de temperatura por 5 a 7 días. Posteriormente, el hongo se inoculó en avena estéril como sustrato, la cual había sido esterilizada en autoclave a 121 eC por tres días consecutivos. Después de 20 días se colectó la avena con el patógeno, se molió y se utilizó como inoculo de infección del suelo. Para ello, el suelo fue inoculado al 1% (1 gramo de inoculo de infección por 100 gramos de suelo), en donde esta concentración es igual o superior a la que se encuentra de manera natural en suelos infectados.
Para evaluar el efecto del consorcio bacteriano liofilizado en el crecimiento de trigo y en la inhibición del desarrollo de Ggt en trigo, se analizaron cuatro condiciones experimentales. En la primera de ellas, se sembraron semillas de trigo, no inoculadas, en macetas usando el suelo infectado antes descrito (Control+Ggt). En la segunda, semillas de trigo inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado obtenidas en el ejemplo 3 fueron sembradas en macetas usando el suelo infectado antes descrito (Consorcio+Ggt). En la tercera, se sembraron semillas de trigo, no inoculadas, en macetas usando el suelo no infectado (Control -Ggt). Finalmente, en la cuarta, semillas de trigo inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado obtenidas en el ejemplo 3 fueron sembradas en macetas usando suelo no infectado (Consorcio -Ggt).
Después de 60 días en condiciones de invernadero, se determinó el porcentaje de infección mediante la medición de la necrosis radical (raíces negras en relación a las raíces sanas), resultados que se exponen la Figura 2 y en la Tabla 2 a continuación: Tabla 2. Efecto del consorcio bacteriano liofilizado en el porcentaje de infección de Ggt en plantas de trigo
Condición Infección (%) Error estándar
Control+Ggt 11 ,8342008 1 ,35173522
Consorcio+Ggt 2,0424333 0,75375549
Control -Ggt 0,30737705 0,27492639
Consorcio-Ggt 0,28195489 0,25218812
Tal como se muestra en la Tabla 2 y en la Figura 2 se puede observar que las plantas provenientes de semillas inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado disminuyeron en un 80% la infección del fitopatógeno (Consorcio+Ggt) en relación con el control de las plantas provenientes de semillas no inoculadas (Control+Ggt). Además, se puede observar que los tratamientos en los cuales no se ha aplicado el fitopatógeno (“Control- Ggt” y “Consorcio-Ggt”) también presentan un pequeño porcentaje de necrosis que podría ser asociado a cualquier factor de estrés. En consecuencia, a partir de los resultados de la Figura 2, es posible concluir que el consorcio bacteriano liofilizado de la presente invención tiene la capacidad de inhibir el desarrollo del hongo Gaeumannomyces graminis var. Trítici (Ggt) en plantas de trigo.
Adicionalmente, para evaluar el crecimiento de las plantas de trigo se pesó la biomasa de la raíz y la de las hojas (parte aérea) y se calculó el crecimiento a través de la razón biomasa raíz / biomasa parte aérea, utilizando las mismas condiciones antes descritas, es decir, utilizando semillas inoculadas o no inoculadas con el consorcio y crecidas en presencia o ausencia del patógeno Ggt. Los resultados se exponen en la Figura 3 y en la Tabla 3 a continuación: Tabla 3: Efecto del consorcio bacteriano liofilizado en el crecimiento de plantas de trigo.
Condición Razón de biomasa (raíz/parte aérea) Error estándar
Control+Ggt 0,26508572 0,02797187
Consorcio+Ggt 0,41825243 0,06268516
Control -Ggt 0,55301984 0,08012779
Consorcio-Ggt 0,74831961 0,09044248
Sorprendentemente, los inventores encontraron que el consorcio no solo inhibe el desarrollo de Ggt, sino que también, observaron que el consorcio bacteriano liofilizado es capaz de aumentar la biomasa en más de un 37% en el caso de las plantas infectadas con el patógeno provenientes de semillas inoculadas con el consorcio (Consorcio+Ggt) en relación con las plantas infectadas con el patógeno provenientes de semillas no inoculadas (Control+Ggt). Asimismo, el consorcio bacteriano liofilizado aumentó la biomasa en más de un 27% en el caso de las plantas crecidas sin presencia del patógeno provenientes desde semillas inoculadas con el consorcio (Consorcio-Ggt) en relación con las plantas control provenientes desde semillas no inoculadas (Control-Ggt), demostrando así que el consorcio bacteriano liofilizado de acuerdo con la presente invención exhibiría propiedades de promoción del crecimiento vegetal (Figura 3).
A partir de los resultados antes descritos, se demuestra que el consorcio bacteriano liofilizado propuesto permite disminuir la incidencia del patógeno Ggt y aumentar la productividad, en términos de la biomasa producida, de plantas de cereales, como en el ejemplo, de las semillas tratadas de trigo. El experto podrá notar que la elección de las plantas de trigo se realizó únicamente a modo de ejemplo, ya que el método podría ser aplicable en otras plantas de cereales. Finalmente, para evaluar el efecto de cada una de las cepas del consorcio bacteriano de manera independiente, en comparación con el efecto del consorcio bacteriano liofilizado, en la inhibición del desarrollo de Ggt en plantas de trigo, se analizaron cinco condiciones experimentales adicionales. En la primera de ellas, se sembraron semillas de trigo no inoculadas, en macetas usando el suelo infectado antes descrito (Control+Ggt). En la segunda, semillas de trigo inoculadas con la cepa bacteriana de Serratia sp 188.3 (N° de acceso: RGM 2949) obtenidas en el ejemplo 3 fueron sembradas en macetas usando el suelo infectado antes descrito (Serratia+Ggt). En la tercera, semillas de trigo inoculadas con la cepa bacteriana de Bacillus sp 4B (N° de acceso: RGM 2948), obtenidas en el ejemplo 3 fueron sembradas en macetas usando el suelo infectado antes descrito (Bacillus+Ggt). En la cuarta, semillas de trigo inoculadas con la cepa bacteriana de Acinetobacter sp E6.2 (N° de acceso: RGM 3033), obtenidas en el ejemplo 3 fueron sembradas en macetas usando el suelo infectado antes descrito (Acinetobacter+Ggt). Por último, en la quinta, semillas de trigo inoculadas con el consorcio bacteriano liofilizado obtenidas en el ejemplo 3 fueron sembradas en macetas usando el suelo infectado antes descrito (Consorcio+Ggt). Los resultados se exponen en la Figura 4 y en la Tabla 4, que se muestra a continuación:
Tabla 4. Efecto del consorcio bacteriano liofilizado y de cada una de las cepas bacterianas que lo conforman en el porcentaje de infección de Ggt en plantas de trigo
Condición Infección (%) Error estándar
Control+Ggt 11 ,83420076 1 ,351735221
Serratia+Ggt 6,021807354 2,236201839
Bacillus+Ggt 4,390924461 0,75531769
Acinetobacter+Ggt 4,130536695 0,78456296
Consorcio+Ggt 2,042433299 0,753755489 partir de dichos resultados, resulta evidente que el consorcio bacteriano liofilizado de acuerdo con la invención tiene un mayor efecto inhibidor del desarrollo del hongo Ggt, es decir, tiene un porcentaje de infección significativamente menor, al menos un 50% menor, que cada una de las cepas por sí solas, evidenciando un efecto cooperativo entre las cepas bacterianas. Consecuentemente, es posible notar que el consorcio, debido a su composición de las tres cepas bacterianas específicas utilizadas, otorga a la invención una ventaja técnica en términos de una alta capacidad de inhibición del desarrollo del patógeno Ggt en cultivos en campo.
TI

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Consorcio bacteriano liofilizado inhibidor del desarrollo de enfermedades causadas por patógenos de plantas y promotor del crecimiento de las mismas, CARACTERIZADO porque comprende las siguientes cepas bacterianas:
- una cepa de Acinetobacter sp. y una cepa de Serratia sp., ambas cepas endofíticas; y
- una cepa de Bacillus sp que es una cepa rizosférica, en donde la cepa de Acinetobacter sp. es la cepa depositada en la Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM) con el número de acceso RGM 3033; la cepa de Serratia sp. es la cepa depositada en la CChRGM con el número de acceso RGM 2949; y la cepa de Bacillus sp es la cepa depositada en la CChRGM con el número de acceso RGM 2948.
2. Consorcio bacteriano liofilizado de acuerdo con la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque tiene 1 x1014 a 4x1016 UFC por gramo de consorcio bacteriano liofilizado.
3. Cepa bacteriana aislada de Acinetobacter sp inhibidora del desarrollo de enfermedades causadas por patógenos de plantas y promotora del crecimiento de las mismas, CARACTERIZADA porque la cepa de Acinetobacter sp es la cepa depositada en la CChRGM con el número de acceso RGM 3033.
4. Cepa bacteriana aislada de Serratia sp inhibidora del desarrollo de enfermedades causadas por patógenos de plantas y promotora del crecimiento de las mismas, CARACTERIZADA porque la cepa de Serratia sp es la cepa depositada en la CChRGM con el número de acceso RGM 2949.
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5. Cepa bacteriana aislada de Bacillus sp inhibidora del desarrollo de enfermedades causadas por patógenos de plantas y promotora del crecimiento de las mismas, CARACTERIZADA porque la cepa de Bacillus sp es la cepa depositada en la CChRGM con el número de acceso RGM 2948.
6. Método de obtención del consorcio bacteriano liofilizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, CARACTERIZADO porque comprende las siguientes etapas: i. inocular un medio de cultivo estéril con una cepa bacteriana de Acinetobacter sp., con una cepa bacteriana de Bacillus sp., y con una cepa bacteriana de Serratia sp., en las proporciones 37%, 27% y 36%, respectivamente, e incubar por 24 a 36 h, con agitación entre 50-150 rpm a una temperatura de 28°C, para obtener un caldo bacteriano;
¡i. centrifugar el caldo bacteriano obtenido en la etapa (i) a entre 4000-6000 rpm por 10-15 minutos, para obtener un pellet bacteriano; iii. lavar el pellet bacteriano obtenido de la etapa (¡i) al menos 3 veces con una solución de lavado; iv. congelar el pellet de la etapa (i¡¡) por 12 a 16 horas a 50 a 80sC, utilizando un medio que contenga un compuesto seleccionado que evite el daño celular; y v. liofilizar el pellet de la etapa (iv) en un liofilizador para obtener el consorcio bacteriano liofilizado.
7. Método de obtención del consorcio bacteriano liofilizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, CARACTERIZADO porque comprende las siguientes etapas: i), inocular un primer medio de cultivo estéril con una cepa bacteriana de
Acinetobacter sp., un segundo medio de cultivo estéril con una cepa bacteriana de Bacillus sp., y un tercer medio de cultivo estéril con una cepa bacteriana de Serratia sp., e incubar por 24 a 36 horas, con agitación entre 50-150 rpm a una temperatura de 28°C, para obtener un primer, un segundo y un tercer caldo bacteriano, respectivamente;
¡i), centrifugar el primer, el segundo y el tercer caldo bacteriano obtenidos en la etapa (i), respectivamente, a entre 4000-6000 rpm, por 10-15 minutos, para obtener un primer, un segundo y un tercer pellet bacteriano, respectivamente; iii). lavar el primer, el segundo y el tercer pellet bacteriano obtenidos en la etapa (¡i), respectivamente, al menos 3 veces con una solución de lavado; iv). congelar el primer, el segundo y el tercer pellet bacteriano obtenidos en la etapa
(iii), respectivamente, por 12 a 16 horas, a -50 a -80sC, utilizando un medio que contenga un compuesto que evite el daño celular; v). liofilizar el primer, el segundo y el tercer pellet bacteriano obtenidos de la etapa
(iv), respectivamente, en un liof ilizador para obtener un primer, un segundo y un tercer liofilizado bacteriano, en donde el primer liofilizado comprende la cepa bacteriana de Acinetobacter sp., el segundo liofilizado comprende la cepa bacteriana de Bacillus sp., y el tercer liofilizado comprende la cepa bacteriana de Serratia sp.-, y vi), mezclar el primer liofilizado, el segundo liofilizado y el tercer liofilizado en las proporciones 37%, 27% y 36%, respectivamente, para obtener el consorcio bacteriano liofilizado. El método de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, CARACTERIZADO porque adicionalmente comprende una etapa previa a la etapa (i), en donde se reactivan las cepas bacterianas, cuando están almacenadas, realizando un preinóculo con dichas cepas bacterianas en un medio de cultivo estéril. . El método de acuerdo con la reivindicación 8, CARACTERIZADO porque las cepas bacterianas, cuando están almacenadas, están en una solución de 20% glicerol y 80% medio de cultivo. 0. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, CARACTERIZADO porque el preinóculo se realiza inoculando las cepas bacterianas diluidas de 50 a 100 veces en un medio de cultivo estéril. 1. El método de acuerdo con la reivindicación 10, CARACTERIZADO porque el preinóculo se incuba por 24 a 36 horas con agitación entre 50-150 rpm a una temperatura de 28°C. 2. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 1 1 , CARACTERIZADO porque la cepa bacteriana de Acinetobacter sp. es la cepa E6.2 (N° de acceso: RGM 3033), la cepa bacteriana de Bacillus sp. es la cepa 4B (N° de acceso: RGM 2948) y la cepa bacteriana de Serratia sp. es la cepa 188.3 (N° de acceso: RGM 2949). 3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12, CARACTERIZADO porque el medio de cultivo estéril es seleccionado desde el grupo que comprende: caldo nutritivo, extracto de malta, medio MRS, medio TSA y medio LB. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 13, CARACTERIZADO porque el medio de cultivo estéril es medio LB.
15. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14, CARACTERIZADO porque la etapa (¡i) de centrifugación se realiza a temperatura ambiente.
16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 15, CARACTERIZADO porque la solución de lavado de la etapa (i¡¡) es agua destilada o una solución salina.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, CARACTERIZADO porque la solución salina es seleccionada desde el grupo que comprende una solución de NaOH y una solución de KOH.
18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, CARACTERIZADO porque la solución salina es NaOH al 0,5-1 %.
19. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 18, CARACTERIZADO porque el compuesto que evita el daño celular, que se utiliza en la etapa (iv), se selecciona desde el grupo que comprende: leche descremada, leche semidescremada, leche entera, suero bovino, caseína, polisorbato 20, polisorbato 80 y tritón.
20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, CARACTERIZADO porque el compuesto que evita el daño celular se encuentra a una concentración entre 10-20 % p/v.
32 El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 20, CARACTERIZADO porque la liofilización de la etapa (v) se lleva a cabo por dos días, a una temperatura de -40sC a -60sC y una presión de 0,080 a 2 mBar (8-200 Pa). Uso del consorcio bacteriano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, CARACTERIZADO porque sirve para inhibir el desarrollo, prevenir y/o tratar enfermedades causadas por patógenos de plantas y para promover el crecimiento de las mismas. El uso de acuerdo con la reivindicación 22, CARACTERIZADO porque la enfermedad infecciosa es causada por el patógeno de plantas Gaeumannomyces graminis var. Tritici (Ggf). El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 22-23, CARACTERIZADO porque la planta es un cereal. El uso de acuerdo con la reivindicación 24, CARACTERIZADO porque el cereal se selecciona desde el grupo que comprende: trigo, centeno y triticale. Método para inhibir el desarrollo de enfermedades causadas por patógenos de plantas y promover el crecimiento de las mismas, CARACTERIZADO porque comprende aplicar el consorcio bacteriano liofilizado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -2 a semillas desde las que crecen dichas plantas, para producir semillas inoculadas con el consorcio bacteriano, en donde la aplicación del consorcio bacteriano liofilizado en las semillas comprende las etapas de:
(a) desinfectar las semillas con un método de desinfección superficial;
33 (b) mezclar las semillas obtenidas en la etapa (a) con 10 - 20 % en peso de una mezcla de magnesio/calcio, 15 % en peso de agua y 0,2 % en peso de una mezcla de pegamento adhesivo líquido y agua (proporción 1 :9);
(c) agregar una carga de 1 x109 a 1 x1011 UFC de dicho consorcio bacteriano liofilizado, a la mezcla de la etapa (b);
(d) combinar y homogenizar la mezcla resultante de la etapa (c) a velocidad de entre 50 y 100 rpm, por un período de 5 a 15 minutos a temperatura ambiente; y
(e) secar las semillas obtenidas en la etapa (d) a una temperatura entre 15 a 25°C por al menos 3 horas, para obtener semillas inoculadas con el consorcio bacteriano. El método de acuerdo con la reivindicación 26, CARACTERIZADO porque el método de desinfección superficial de las semillas de la etapa (a) consiste en lavar las semillas con una solución al 15%-20% de etanol más 1 %-2% de hipoclorito de sodio, por 2-5 min; y enjuagar las semillas. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26-27, CARACTERIZADO porque, opcionalmente, las semillas inoculadas se almacenan a temperatura ambiente.
34
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