WO2021018321A2

WO2021018321A2 - Composición biopesticida y biofertilizante

Info

Publication number: WO2021018321A2
Application number: PCT/CU2020/050004
Authority: WO
Inventors: Irene María ALVAREZ LUGO; Ileana Sanchez Ortiz; Idania WONG PADILLA; Danalay SOMONTES SANCHEZ; Rolando MORAN VALDIVIA; Liszoe GALDÓS BETARTEZ; Laritza Caridad DOMINGUEZ RABILERO; Aylin NORDELO VALDIVIA
Original assignee: Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia
Priority date: 2019-07-31
Filing date: 2020-07-30
Publication date: 2021-02-04
Also published as: BR112022001668A2; AR119504A1; EP4005387A2; WO2021018321A3; US20220272986A1; CU20190071A7; CN114501999A; MX2022001282A

Abstract

Composición biopesticida y biofertilizante que comprende Pseudoxanthomonas indica, o metabolitos de dicha bacteria, y excipientes o diluentes. Uso de Pseudoxanthomonas indica, o metabolitos de dicha bacteria, para la fabricación de una composición biopesticida o biofertilizante. Método para el control de fitopatógenos y zoonematodos que comprende la aplicación de una cantidad efectiva de Pseudoxanthomonas indica, o sus metabolitos, a la planta o el animal que lo necesita. Método para la estimulación del crecimiento de las plantas que comprende la aplicación de una cantidad efectiva de Pseudoxanthomonas indica, o metabolitos de dicha bacteria, al suelo o sustrato, planta, o semilla.

Description

COMPOSICIÓN BIOPESTICIDA Y BIOFERTILIZANTE

Campo de la técnica

La presente invención se relaciona con el campo de la agricultura, y se basa en la aplicación de Pseudoxanthomonas indica como un microorganismo beneficioso para la misma. Como se muestra en la invención, las bacterias de esta especie microbiana poseen actividad nematicida, fungicida, inductora de respuesta defensiva, y de promoción del crecimiento en plantas, y ejercen estos efectos sin afectar el medio ambiente.

Estado de la técnica anterior

Las plantas se encuentran asociadas con microorganismos que ejercen acción biofertilizante y de biocontrol. Estos microorganismos, con su efecto biofertilizante, favorecen el buen estado en la planta a través del incremento de la disponibilidad de nutrientes, la fijación de nitrógeno e incrementan la simbiosis. El biocontrol se manifiesta con el incremento del crecimiento vegetal, debido al control de organismos patógenos. Este efecto se desarrolla a través de mecanismos como la producción de antibióticos, sideróforos, sustancias antagonistas de bacterias y hongos, enzimas extracelulares y el incremento de la resistencia a estrés biótico y abiótico. De forma general, dentro de los géneros bacterianos de este tipo se encuentran Pseudomonas, Serratia, Bacillus, Enterobacter y Xanthomonas, y dentro de los hongos se puede citar Trichoderma ( Mabood , Zhou y Smith 2014, Can. J. Plant Sci. 94: 1051-1063 ).

De forma particular, uno de los fitopatógenos más comunes son los nematodos, pues constituyen una de las plagas más importantes en la agricultura de las zonas tropicales, subtropicales y templadas. Entre las especies de nematodos, Meloidogyne ssp. causa pérdidas de las cosechas estimadas entre el 1 1 y el 25%, en muchas áreas tropicales. Las pérdidas anuales por este concepto se estiman en alrededor de 87 billones en todo el mundo. Por su rapidez y eficacia, los nematicidas químicos han sido el método más utilizado para el control de nematodos. Pero los fumigantes, como el bromuro de metilo, se han prohibido en muchos países, por su alta toxicidad a los mamíferos, su acción reductora de la capa de ozono, y su efecto residual. Teniendo en cuenta estas premisas, actualmente se fomenta el uso de microorganismos beneficiosos antagonistas de fitonematodos, para la obtención de productos biológicos ( Jones et al. 2013, Mol Plañí Pathol 14(9), 946-961). Entre los enemigos naturales de los nematodos se encuentran los hongos Paecilomyces lilacinus, Verticillium chlamydosporium, Arthrobotrys oligospora y Trichoderma harzianum. También se hallan bacterias como Pasteuria penetrans, Agrobacterium radiobacter, Bacillus sphaericus, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis ( Dong y Zhang 2006, Plant and Soil 288(1 ):31-45) y Tsukamurella paurometabola cepa C924 (Patente EP 0774906 B1 ). Más recientemente, cepas de los géneros Chromobacterium, Burkholderia, y Flavobacterium se patentaron para modular la infestación de nematodos.

Sin embargo, hasta el momento no se cuenta con bioproductos totalmente efectivos, por lo que existe la necesidad de disponer de microorganismos beneficiosos, hacia los que no se desarrolle resistencia por los patógenos de las plantas, y que posean un mínimo efecto ambiental.

Explicación de la invención

La presente invención resuelve el problema mencionado anteriormente, al proveer una composición biopesticida o biofertilizante que comprende Pseudoxanthomonas indica, o metabolitos de dicha especie bacteriana, y excipientes o diluentes. En la invención se demostró por primera vez que esta especie puede utilizarse como nematicida y fungicida de amplio espectro, y que es capaz de controlar las poblaciones de nematodos y hongos fitopatógenos en los principales cultivos agrícolas. Los experimentos de la invención pusieron en evidencia que la composición biopesticida que comprende Pseudoxanthomonas indica reduce la eclosión de los huevos de Meloidoavne“in vitro”, respecto a la que se observa en los huevos no tratados con dicha bacteria, y que aumenta la mortalidad de las larvas de nematodos. La aplicación al suelo de esta bacteria disminuye el índice de infestación por Meloidogyne spp. en tomate, y reduce el número de agallas en las raíces con una alta eficiencia técnica (ET).

En el contexto de esta invención, se entiende por biopesticida un producto que se utiliza para controlar plagas agrícolas, por medio de efectos biológicos específicos. Esto los diferencia de los pesticidas químicos, que tienen una acción más amplia. Como es conocido por los versados en este campo de la técnica, los productos biopesticidas comprenden un agente de control biológico, es decir, un organismo, sus genes o sus metabolitos, para el control de las plagas (Lacey y Sporleder, 2013, Capítulo 16 Biopesticides, Insect Pests of Potato, 463-497pp). En la composición biopesticida de la invención, el efecto de control biológico es ejercido por una bacteria o los compuestos que esta produce.

En el contexto de esta invención, se entiende por biofertilizante un producto que contiene un organismo beneficioso, que favorece el crecimiento y desarrollo de las plantas, como alternativa a los fertilizantes químicos, sin efectos adversos para el ecosistema. Como es conocido por los versados en este campo de la técnica, los productos biofertilizantes facilitan la disponibilidad y la absorción de nutrientes, así como la producción de hormonas vegetales. Además, le confieren a la planta tolerancia frente al estrés, y aumentan la resistencia a los patógenos, lo que resulta en una mejora del cultivo (Bhardwaj et al., 2014 Microbial Cell Faetones 13:66).

De acuerdo a las evidencias experimentales que se muestran, la invención provee un inductor de la respuesta defensiva y un promotor del crecimiento de las plantas tratadas. Este comprende el microorganismo Pseudoxanthomonas indica, que es una bacteria Gram negativa, motil, catalasa y oxidasa positiva, y que forma colonias de color amarillo, a las 24 horas de crecimiento a 28 ^QC, en medio Agar Triptona Soya. En la invención, la bacteria se obtuvo a partir de la rizosfera de una planta de tomate sana, proveniente de una casa de cultivo infestada con Meloidogyne spp., y se identificó como Pseudoxanthomonas indica mediante técnicas bioquímicas convencionales, y biología molecular. Esta especie bacteriana no es nueva, ha sido aislada en suelos de otras regiones del mundo. La cepa representativa de esta especie, nombrada P15, se aisló del suelo de un vertedero de hexaclorociclohexano al aire libre en la India, y se reportó en el 201 1 ( Kumari et al. 2011, Int J Syst Evol Microbiol 61: 2107-2111). La especie se encuentra comercialmente disponible en conocidas colecciones de microorganismos.

En una realización de la invención, la composición biopesticida o biofertilizante comprende la bacteria Pseudoxanthomonas indica viva o inactivada. En la presente invención se demuestra que tanto el sobrenadante de los cultivos, como la bacteria viva, y sus compuestos (metabolitos) volátiles o solubles, tienen actividad nematicida y/o fungicida.

En el contexto de la invención, se entiende por metabolito a aquella sustancia o compuesto producido por Pseudoxanthomonas indica que es capaz de controlar las plagas en las plantas y los zoonematodos, y/o posee actividad estimuladora del crecimiento vegetal. En una materialización de la invención, los metabolitos originalmente producidos por Pseudoxanthomonas indica se obtienen por vía natural, recombinante o por síntesis química. En una materialización particular, los metabolitos son compuestos volátiles o solubles.

Los metabolitos que libera Pseudoxanthomonas indica al medio de cultivo, y los compuestos volátiles que produce, tienen actividad “in vitrd’ sobre los hongos fitopatógenos: Rhizoctonia solani, Sarocladium oryzae, Stemphylium solani, Phytophthora nicotianae, Bipolaris oryzae y Fusarium oxysporum. Además, tienen actividad estimuladora del crecimiento vegetal, y aumentan la longitud y el peso de las plantas, la longitud de la raíz principal y el número de raíces laterales y pelos radiculares.

En una realización de la invención, la composición adicionalmente comprende compuestos estabilizantes, potenciadores, elicitores de la actividad nematicida o cobertores de semillas. En una materialización de la invención, la concentración de la bacteria está entre 1 x10⁸ y 1 x10¹⁰ unidades formadoras de colonia (ufe) por mi de composición. La composición biopesticida es útil para el control directo o indirecto de fitopatógenos y zoonematodos.

En otro aspecto, la invención comprende el uso de Pseudoxanthomonas indica, o metabolitos de esa bacteria, para la fabricación de una composición biopesticida o biofertilizante. En una realización de la invención, para dicho uso, la concentración de la bacteria está entre 1 x10⁸ y 1 x10¹⁰ ufe por mi de composición. En una materialización de la invención, la composición biofertilizante está formulada como un suelo preempacado, un polvo, un líquido, una suspensión, un granulado, un nebulizador o un encapsulado.

Por otra parte, la invención revela un método para el control de fitopatógenos y zoonematodos que comprende la aplicación de una cantidad efectiva de Pseudoxanthomonas indica, o metabolitos de la misma, a la planta o el animal que lo necesita. En una realización de la invención, en dicho método la bacteria se aplica como una suspensión o un concentrado de la cepa viva o inactivada. En una realización particular, en dicho método, la bacteria está formulada como un suelo preempacado, un polvo, un líquido, una suspensión, un granulado, un nebulizador o un encapsulado. En una materialización, en el método de la invención, la cepa es útil para reducir el grado de infestación producida por los nematodos u hongos fitopatógenos en plantas.

Es también objeto de la invención, un método para la estimulación del crecimiento de las plantas que comprende la aplicación de una cantidad efectiva de Pseudoxanthomonas indica, o metabolitos de la misma, al suelo, sustrato, planta, o semilla. En dicho método, opcionalmente, la bacteria está formulada como un suelo preempacado, un polvo, un líquido, una suspensión, un granulado, un nebulizador o un encapsulado.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Árbol filogenético de la cepa H32, según el método de Neighbour-joining basado en la secuencia de los genes que codifican para el ácido ribonucleico ribosomal (ARNr) 16s, que muestra la relación de la cepa H32 con los miembros representativos de la familia Pseudoxanthomonas. Como microorganismos fuera del grupo se utilizaron Luteimonas mephitis B1953/27, Arenimonas donghaensis H03- R19, Lysobacter enzymogenes DSM 2043T y Thermomonas haemolytica A50-7-3. Los valores de remuestreo mayores del 70% aparecen en los nodos de las ramas (estos se expresan en % de 1 000 réplicas). La barra representa dos sustituciones por cada 100 nucleótidos.

Figura 2. Efecto de los compuestos orgánicos volátiles (abreviado VOCs, del inglés volatile organic compounds) sobre el crecimiento del hongo Bipolaris oryzae. H32, H36 y H42: Cepas bacterianas en estudio. Control: Grupo no tratado. Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas, según la Prueba de Duncan, p< 0,05.

Figura 3. Longitud de las ramas (A) y peso de las plantas (B) de Arabidopsis thaliana, después de 14 días de exposición a los VOCs de Pseudoxanthomonas indica cepa H32 (H32) o del medio de cultivo Caldo Triptona Soya (Control). El asterisco indica diferencias estadísticamente significativas, según la prueba Test de Student p< 0,05.

Figura 4. Longitud de la raíz principal en las plantas de Arabidopsis thaliana, luego de ocho días de co-cultivo con Pseudoxanthomonas indica, cepas H32, H36 y H42, o con MgS0₄ (10 mmol/L) como control negativo (Control). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas, según la prueba de Duncan, p< 0,05. Figura 5. Número de raíces laterales en las plantas de Arabidopsis thaliana expuestas a Pseudoxanthomonas indica, cepas H32, H36 y H42, o a MgS0₄ (10 mmol/L) como control negativo (Control). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas, según la prueba de Duncan, p< 0,05.

Figura 6. Número de pelos radiculares en 1 cm de la raíz principal de las plantas de Arabidopsis thaliana expuestas a Pseudoxanthomonas indica, cepas H32, H36 y H42, o a MgS0₄ (10 mmol/L) como control negativo (Control). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas, según la prueba de Duncan, p< 0,05.

Figura 7. Efecto de Pseudoxanthomonas indica, cepa H32, aplicada en raíces, sobre la expresión de los genes de defensa PR1 y PDF1.2 en hojas de Arabidopsis thaliana. Grupos experimentales: Plantas controles tratadas con agua (C) y plantas tratadas con la cepa bacteriana H32 (H32). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas, según la prueba de Duncan, p< 0,05.

Figura 8. Efecto de Pseudoxanthomonas indica, cepa H32, aplicada en raíces, sobre la expresión de genes de defensa: osmotina (panel A), hidroperóxido liasa (HPL) (panel B), quitinasa (panel C), glutatión peroxidasa (GPx) (panel D), PR-1 (panel E), aleño óxido sintasa (AOS) (panel F) y fenilalanina-amonio liasa (FAL) (panel G). Letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas, según la prueba de Duncan, p< 0,05. La expresión de los genes se midió a nivel sistémico, en hojas de tomate.

Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos de realización

Ejemplo 1. Aislamiento y conservación de cepas bacterianas con propiedades nematicidas.

Para el aislamiento de cepas bacterianas con propiedades nematicidas, se colectaron muestras de suelo rizosférico de plantas de tomate menos afectadas, en una casa de cultivo con alta infestación por Meloidogyne spp. en Ciego de Ávila. Primeramente, se realizó un pre-enriquecimiento selectivo. Para ello, se tomó un gramo de suelo rizosférico y se incubó durante 48 horas a 30 ^QC, en Medio Mínimo M9 que contenía 100 huevos de Meloidogyne por mL de cultivo, cómo única fuente de carbono y energía. A partir de este preparado, se realizaron diluciones seriadas que se inocularon en placas de Petri, con medio mínimo M9 con quitina al 0,05%; para la selección de cepas. Se seleccionaron las colonias con halo, que mostraron características morfológicas diferentes, y se denominaron con una H seguida por el número consecutivo del aislamiento. A continuación, se realizó una segunda selección de las colonias, mediante la determinación de la actividad desulfurasa y gelatinasa. La actividad desulfurasa se observa por ennegrecimiento de un papel de filtro embebido en acetato de plomo, colocado sobre las colonias en la placa de Petri con Agar Triptona Soya, debido a que las colonias producen ácido sulfhídrico. La actividad gelatinasa se evalúa mediante la observación de halos de hidrólisis, después de 24 horas de crecimiento en agar nutriente con gelatina al 0,5%, y de la adición del reactivo de Frazier.

Las cepas H32, H36 y H42, después de 24 horas de incubación a 30^QC, en medio Agar Triptona Soya, mostraron colonias de entre 3 y 5 mm, opacas, de color amarillo claro, de forma circular y elevación convexa. Los bordes de esas colonias eran enteros, presentaban una superficie lisa y brillante, y su consistencia era cremosa. Para la conservación de los aislamientos, se creció una colonia durante 12 horas en Caldo Triptona Soya, se añadió glicerol como crioprotector (al 20% de concentración final (v/v)), y estas muestras se congelaron a -70 ^QC.

Ejemplo 2. Identificación taxonómica de las bacterias aisladas.

Para la identificación, se realizó la tinción de Gram, la prueba de la oxidasa y la catalasa, y la prueba de Hugh Leifson, según el manual de Bacteriología Sistemática de Bergey ( Vos et al. 2009, Springer Dordrecht Heidelberg London New York, 2da Edición, Vol 3, 1450 pp ISBN: 978-0-387-95041 -). Se determinó que las cepas H32, H36 y H42 eran bacilos Gram negativos, mótiles, aerobios y con metabolismo oxidativo. Las pruebas convencionales, realizadas mediante el kit API 20NE (Biomeriux), mostraron un perfil que no coincidió con ninguno de los del catálogo de identificación del kit. Los resultados de las pruebas bioquímicas se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Resultados de las pruebas bioquímicas realizadas mediante el API 20NE. Prueba Resultado

Reducción de Nitrato a Nitrito +

Producción de Indol

Producción de ácido de glucosa

Arginina dihidrolasa

Ureasa

Hidrólisis de esculina +

Hidrólisis de gelatina +

b-galactosidasa +

Asimilación de:

D-Glucosa +

L-Arabinosa D-Manosa +

D-Manitol

N-acetil glucosamina +

D-Maltosa +

Gentibiosa

Ácido caproico

Adipato

Malato +

Citrato

Acido Fenil acetato

Oxidasa +

Las cepas referidas en el Ejemplo 1 también se caracterizaron por biología molecular, mediante la secuenciación de un fragmento del gen que codifica para el ARNr 16S. Los oligonucleótidos que se utilizaron como cebadores para la Reacción en Cadena de la Polimerasa fueron el 63F y el 1387R ( Marchesi et al. 1998 Applied and Environmental Microbiology 64(2):795-9). Las secuencias se compararon con las que estaban disponibles en la base de datos GenBank, del Centro Nacional para la Información Biotecnológica de Estados Unidos, mediante el paquete bioinformático MEGA 7.0 ( Molecular Evolutionary Genetics Analysis Software Versión 7.0, Center for Evolutionary Functional Geno mies, The Biodesign Institute, Arizona State University). El árbol filogenético representado en la Figura 1 , que se obtuvo por el método de Neighbour-joining, confirmó que las cepas H32, H36 y H42 formaban un grupo coherente con los miembros del género Pseudoxanthomonas del phylum Bacteroidetes, y una rama intragénero con Pseudoxanthomonas indica. Luteimonas mephitis B 1953/27, Arenimonas donghaensis FI03-R19, Lysobacter enzymogenes DSM 2043T y Thermomonas haemolytica A50-7-3 se utilizaron como microorganismos fuera del grupo. Los valores de remuestreo mayores del 70% aparecen en los nodos de las ramas. En la Figura 1 se muestra solo lo relativo a la cepa H32. El árbol filogenético obtenido por el método de máxima probabilidad tuvo una topología similar que el de Neighbour-joining.

El análisis de la matriz de distancia permitió determinar la mayor cercanía de la secuencia del gen ARNr 16S de las cepas en estudio con Pseudoxanthomonas indica P15, EF424397.1 . De acuerdo a los resultados del análisis filogenético, se infiere que las cepas estudiadas pertenecen a la especie Pseudoxanthomonas indica, y los resultados de las pruebas bioquímicas de las mismas se corresponden con las principales características descritas para esta especie bacteriana.

Ejemplo 3. Actividad nematicida“in vitro” de las bacterias correspondientes a las cepas seleccionadas.

Se realizaron ensayos in vitro con huevos y juveniles del fitonematodo Meloidogyne spp., y se determinó la actividad nematicida de las células vivas de Pseudoxanthomonas indica. Para ello se extrajeron las masas de huevos, a partir de raíces de plantas de tomate afectadas por esta plaga, se desagregaron las masas con hipoclorito de sodio al 0,5%; y se colocaron tres réplicas (de 100 huevos) para cada muestra a ensayar. Para obtener las larvas, se incubaron los huevos a la temperatura de 28-30 °C, en agua desionizada estéril, durante 6 días. Las muestras testigos se prepararon igualmente, con 100 huevos y 100 larvas de este nematodo contenidos solamente en 1 mi de agua con peptona (al 1 % (w/v)) estéril. Como criterio de actividad frente a huevos de Meloidogyne spp., se determinó el porciento de inhibición de la eclosión de los huevos. Como criterio de actividad frente a larvas o juveniles de este nematodo, se calculó el porciento de reducción de la supervivencia de las mismas.

Las muestras de células vivas completas de Pseudoxanthomonas indica se prepararon a partir de un cultivo fresco de cada cepa, al que se determinó la concentración bacteriana como ufe por mi. Se tomó 1 mi del cultivo, por duplicado, se separaron las células por centrifugación, y se lavaron con peptona (al 1 %) en agua. Posteriormente, se realizaron tres diluciones seriadas, de 1 :100, en la misma solución, que se utilizaron en los ensayos. Las tablas 2 y 3 muestran el efecto de dos de las diluciones de Pseudoxanthomonas indica sobre los huevos y larvas de nematodos.

Tabla 2. Porciento de inhibición de la eclosión de huevos del nematodo Meloidogyne spp. a dos concentraciones de células viables de Pseudoxanthomonas indica.

Cepa Inhibición de la eclosión

5x10^b ufc/ml 5x10⁴ ufc/ml

H32 83% 89% H36 75% 80%

H42 74% 85%

Testigo 20% 22%

Tabla 3. Porciento de reducción de la sobrevivencia de larvas del nematodo Meloidogyne spp. a dos concentraciones de células vivas de Pseudoxanthomonas indica.

Cepa Reducción de la sobrevivencia de las larvas

5x10⁶ ufc/ml 5x10⁴ ufc/ml

H32 50% 55%

H36 43% 45%

H42 38% 40%

Testigo 15% 20%

Por tanto, se evidencia que Pseudoxanthomonas indica inhibe la eclosión de los huevos de Meloidogyne spp. También reduce la sobrevivencia de las larvas de este nematodo.

Ejemplo 4. Perfiles de utilización de carbohidratos y actividad enzimática de Pseudoxanthomonas indica.

Para determinar los carbohidratos que utiliza la cepa H32 de Pseudoxanthomonas indica, como única fuente de carbono y energía, se utilizó el kit CH50 de la firma Biomeriux. Las bacterias de la cepa H32 de Pseudoxanthomonas indica oxidaron los siguientes carbohidratos: D-Glucosa, D-Fructosa, D-Mamnosa, N-acetil- Glucosamina, D-Maltosa, D-Lactosa, D-Sacarosa, tal como se informa para la cepa tipo de esta especie ( Pseudoxanthomonas indica P15).

Para la determinación del perfil enzimático de dicha cepa de Pseudoxanthomonas indica, se detectó la producción de quitinasas, mediante el crecimiento en medio M9 con quitina coloidal al 0,5%. Por su parte, la producción de proteasas se detectó por siembra en placas con Agar Nutriente y gelatina al 0,5%, y el revelado subsiguiente con el reactivo de Frazier. Además, se utilizó el kit APIZYM™ para la detección de fosfatasas, esterasas, lipasas, glucoronidasas, galactosidasas, fucosidasa, manosidasa, arilasas, N-acetil-p-glucosaminidasa y Naftol- AS-BI- fosfohidrolasa. Los resultados de estas determinaciones se muestran en la Tabla 4, y demuestran que las bacterias de la cepa H32 de Pseudoxanthomonas indica poseen un metabolismo oxidativo, y que son capaces de degradar un gran número de compuestos orgánicos y otros compuestos químicos complejos.

Tabla 4. Enzimas liberadas por la cepa H32 de Pseudoxanthomonas indica.

Enzima Resultado

Quitinasas +

Proteasas +

Esterasa (C4) +

Esterasa Lipasa (C8) +

Lipasa (C14)

Tripsina +

a quimotripsina +

b-glucosidasa

N-acetil^-glucosaminidasa +

Fosfatasa alcalina +

Leucina arilamidasa +

Valina arilamidasa +

Cistina arilamidasa +

Fosfatasa ácida +

Naftol-AS-BI-fosfohidrolasa +

+: presencia

ausencia

Ejemplo 5. Efecto de Pseudoxanthomonas indica sobre la infestación por Meloidogyne spp. en Solanum lycopersicum.

Se realizó un ensayo para evaluar la actividad nematicida “in vivo” de Pseudoxanthomonas indica en plantas de tomate ( Solanum lycopersicum). Las mismas se trasplantaron a macetas con 1 kg de sustrato, y se infestaron con 500 huevos de Meloidogyne spp. La bacteria se creció en medio Caldo Triptona Soya durante 24 h, y se realizaron diluciones seriadas en agua desionizada, para aplicarla a las plantas en concentraciones entre 4x10⁷y 2x10⁴ ufc/g de sustrato. El esquema que se utilizó fue de dos aplicaciones. Se realizó una aplicación a los 3 días de la infestación del sustrato con nematodos, y 7 días después se trasplantaron las posturas de tomate. La segunda aplicación se realizó a los 14 días después del trasplante. Como control positivo, se utilizó la cepa bacteriana C-924, que posee conocidas propiedades como nematicida (Patente Europea EP 0774906 B1 ). En este experimento, se utilizó agua desionizada como testigo (control negativo).

A los 35 días del trasplante, se extrajeron las plantas de tomate y se determinó el grado de infestación de las raíces, mediante la escala de Bridge y Page, de 0 a l o grados. A partir de estos resultados se determinó la ET (Wong et al. (2017) Biotecnología Aplicada, 34:4301 -43) de cada concentración de la cepa H32. La bacteria fue efectiva frente a nematodos del género Meloidogyne, en todos los tratamientos que se evaluaron, como se muestra en la Tabla 5.

Tabla 5. Grados de infestación de las raíces de Solanum lycopersicum y ET de los tratamientos con Pseudoxanthomonas indica.

Tratamiento ufc/g Gradología ET* (%)

TTÓ 4x10^/ 1 .38 75,32

T 1 1 4x10⁶ 1 ,89 66,10

T 12 4x10⁵ 1 ,29 76,92

T 13 4x10⁴ 2.38 57,37

T 14 2x10⁴ 2,43 56,41

Cepa C-924 2x10⁸ 3,00 46,15

TESTIGO 5,60 0,0

^*ET: Eficiencia Técnica

Por tanto, bacterias de la especie Pseudoxanthomonas indica reducen el índice de infestación por Meloidogyne spp. con una ET superior al 50%.

Ejemplo 6. Actividad antifúngica de los metabolitos liberados al medio de cultivo de Pseudoxanthomonas indica.

Para determinar la actividad antifúngica de los metabolitos liberados al medio de cultivo de la cepa H32 de Pseudoxanthomonas indica, primeramente se colocó un disco, de aproximadamente 7 mm, de medio de cultivo que contiene el hongo en el centro de una placa de Petri con medio Agar Papa Dextrosa (PDA). A ambos lados se depositaron, en forma de una línea, 10 pL de una suspensión bacteriana de la cepa H32 en Caldo Triptona Soya. En el tratamiento control sólo se colocó el mismo medio de cultivo. Se realizaron 2 réplicas en cada caso. A los 5 días de incubación a 28 ^QC, se midió el diámetro de las colonias de los hongos y se determinó el porciento de crecimiento relativo respecto al control como:

% inhibición del crecimiento = ((diámetro de la colonia control - diámetro de la colonia con tratamiento) / (diámetro de la colonia control -7))^*100.

Los resultados se muestran en la Tabla 6, los que indican que Pseudoxanthomonas indica detuvo el desarrollo de un grupo de hongos fitopatógenos que afectan a cultivos de gran importancia económica.

Tabla 6. Inhibición del crecimiento de hongos fitopatógenos por los metabolitos liberados por Pseudoxanthomonas indica.

Hongo Inhibición del crecimiento (%)

fíhizoctonia solani 77,9

Sarocladium oryzae 47,8

Stemphylium solani 72,0

Phytophthora nicotianae 92,6

Bipolaris oryzae 80,9

Fusarium oxysporum cúbense 43,9

Ejemplo 7. Actividad antifúngica de los compuestos orgánicos volátiles producidos por Pseudoxanthomonas indica.

Se montó un sistema con dos fondos de placas de Petri. En la parte inferior, con medio PDA, se colocó un disco, de aproximadamente 7 mm, del hongo Bipolaris oryzae. En la parte superior, con Agar Triptona Soya, se dispersaron 100 mI_ de un cultivo de 12 horas de las cepas bacterianas H32, H36 y H42 en Caldo Triptona Soya. En el tratamiento control sólo se dispersaron 100 mI_ de Caldo Triptona Soya. Se realizaron 2 réplicas en cada caso. El sistema se selló con una película de Parafilm™, y se incubó a 28 ^QC. A los 5 días, se midió el diámetro de las colonias de los hongos. Se determinó la inhibición del crecimiento relativo al tratamiento control como:

% Inhibición del crecimiento = ((diámetro de la colonia control - diámetro de la colonia tratada) / (diámetro de la colonia control -7))^*100

Las tres cepas estudiadas inhibieron el crecimiento de Bipolaris oryzae en más del 50%, sin existir contacto físico con el patógeno, tal como se aprecia en la Figura 2. Por tanto, los compuestos volátiles de Pseudoxanthomonas indica tienen actividad antifúngica.

Ejemplo 8. Producción de compuestos volátiles promotores del crecimiento vegetal por la bacteria Pseudoxanthomonas indica.

Para demostrar la actividad promotora del crecimiento en plantas, semillas de Arabidopsis thaliana (aproximadamente 100 semillas por tratamiento) se esterilizaron con una mezcla compuesta por 1 ml_ de hipoclorito de sodio (2% (v/v)) y 3 mI_ de tritón X100 (1 % (v/v)), para luego colocarlas durante 8 minutos a 37^QC, con agitación. A continuación, se lavaron aproximadamente 5 veces con agua destilada estéril, y se almacenaron a 4^QC durante 4 días. Se colocaron en placas de Petri de diámetro 150 mm, con medio MS, a las que se les puso hacia el centro una placa de Petri pequeña (diámetro 50 mm) con Agar Triptona Soya. A los dos días de la germinación de las plantas, se inoculó el medio Agar Triptona Soya con 10 pi_¬ de un cultivo del microorganismo en estudio, previamente crecido durante 12 h en Caldo Triptona Soya, a 37 ^QC. El sistema se selló con una película de Parafilm™, y se incubó a 20 ± 2 ^QC, con un fotoperíodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad.

A los 14 días se tomaron muestras, para evaluar el largo y peso de las ramas y el número de las hojas. Las plantas de Arabidopsis thaliana, después de 14 días de incubación en placas de Petri que contenían Pseudoxanthomonas indica, mostraron mejor crecimiento que el control sin bacteria (Figura 3). Esto evidenció la estimulación del crecimiento de dichas plantas por los compuestos volátiles producidos por dicha bacteria.

Ejemplo 9. Efecto de compuestos solubles liberados por Pseudoxanthomonas indica sobre la morfología de las raíces.

Se expusieron las semillas de Arabidopsis thaliana var Col 0 a los compuestos solubles liberados al medio de cultivo por Pseudoxanthomonas indica. Previamente, se esterilizaron las semillas mediante la inmersión durante 8 minutos a 37 ^QC, con agitación, en una solución que contenía 1 mL de hipoclorito de sodio (2% (v/v)) y 3 pL de Tritón X100 (1 % (v/v)). Las semillas se lavaron cinco veces con agua destilada estéril, y se mantuvieron a 4 ^QC durante 4 días.

Se depositaron 10 semillas, en línea recta y equidistantes, en el extremo superior de una placa de Petri de 100 mm, que contenía medio MS. Las placas se colocaron verticalmente en el cuarto iluminado, a una temperatura de 22 ± 2 ^QC y a un fotoperíodo de 16 h luz y 8 h oscuridad. A los 4 días de la germinación de las plantas se añadieron 240 mI_ de una suspensión bacteriana de las cepas H32, H36 y H42 sobre el medio de cultivo, a una distancia de 2-3 cm del extremo inferior de las raíces. Estas suspensiones se prepararon a partir de un cultivo en medio Caldo Triptona Soya crecido a 28 ^QC, durante 18 h, que se centrifugó y se resuspendió en MgSC>4 10 mmol/L. El sistema se selló con Parafilm™, y se incubó en el cuarto iluminado, bajo las mismas condiciones. Como control negativo, se utilizó la solución de MgS0₄ 10 mmol/L. Se montaron 3 réplicas en cada caso.

A los 8 días de co-cultivo, se evalúo el largo de la raíz primaria, el número de raíces laterales, y el número de pelos radiculares en 1 cm de raíz primaria, desde el extremo inferior hacia arriba. Para esta evaluación, se emplearon el estereoscopio y el microscopio invertido. Las raíces de las plantas co-cultivadas con las cepas bacterianas presentaron diferente morfología, en comparación con el grupo control. Esto evidenció las posibles alteraciones en la arquitectura de las raíces, inducidas por esta bacteria. La longitud de la raíz primaria, en las plantas sometidas a los tratamientos con la bacteria, fue mayor (con significación estadística p<0,05) que la longitud de la misma en el tratamiento control (Figura 4).

El número de raíces laterales y el número de pelos radiculares también fueron significativamente mayores que en el tratamiento control {p<0,05), tal como se aprecia en la Figura 5 y la Figura 6. Por lo tanto, la aplicación de Pseudoxanthomonas indica aumenta el área superficial de las raíces y, por consiguiente, la posibilidad de absorción de los nutrientes.

Ejemplo 10. Evaluación de la capacidad de Pseudoxanthomonas indica para inducir la expresión de marcadores de respuesta inmune en Arabidopsis thaliana y tomate.

Las semillas de A. thaliana se incubaron en agua a 4 °C, durante cuatro días, y a continuación se sembraron en sustrato compuesto por arena:turba (1 :1 ). A las seis semanas de germinadas, se trasplantaron hacia macetas pequeñas que contenían la misma composición de sustrato. Una semana después, se dividieron las macetas aleatoriamente en dos grupos. El primer grupo fue tratado con bacterias de la cepa H32, a razón de 1 mL por planta, con una suspensión que contenía 10⁹ ufc/mL, en solución salina. El segundo grupo (control) solo se trató con 1 mL de solución salina. Se realizaron cuatro aplicaciones, a intervalos de siete días. A las dos horas posteriores a la última aplicación, se colectaron muestras de hojas y raíces de las plantas de cada tratamiento, y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. La expresión de los genes PR1 (marcador de respuesta inmune mediada por ácido salicílico) y PDF1.2 (marcador de respuesta inmune mediada por ácido jasmónico) se determinó mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Como control interno se empleó el gen de la ubiquitina. Como muestra la Figura 7, se observó una expresión aumentada del gen PDF1.2 en las hojas de las plantas tratadas con bacterias de la cepa H32, respecto al control del experimento. El nivel de expresión del gen PR1 no resultó ser diferente del observado en el grupo control. Por lo tanto, las bacterias de la especie

Pseudoxanthomonas indica indujeron la expresión de PDF1.2, de forma sistémica, lo cual se reporta como un mecanismo de defensa relacionado con la resistencia frente a la infestación por nematodos.

Ensayo en tomate

El objetivo del estudio fue evaluar la capacidad de Pseudoxanthomonas indica para modular la respuesta inmune en tomate ( Solanum lycopersicum), a nivel sistémico. Bacterias de la cepa H32 se aplicaron como una suspensión celular de 10⁹ ufc/mL, en la rizosfera de las plantas. Se realizaron tomas de muestra a las 12 h, 3 días y 7 días de aplicada la bacteria. En cada tiempo de colecta, se tomaron aleatoriamente muestras de seis plantas de cada tratamiento, las cuales se distribuyeron en dos réplicas, para homogenizar las variaciones. Una vez colectadas las muestras, se conservaron inmediatamente en nitrógeno líquido, hasta su posterior procesamiento. Mediante el método de RT-qPCR, se determinó la expresión relativa de los genes de defensa fenilalanina-amonio liasa (FAL), glutatión peroxidasa (GPx), osmotina, quitinasa, hidroperóxido liasa (HPL), aleño óxido sintasa (AOS) y PR1 en hojas. Se utilizó la actina como control interno del ensayo.

La Figura 8 muestra que Pseudoxanthomonas indica puede inducir, en las etapas tempranas de la interacción con la planta, la expresión de los genes osmotina, HPL, quitinasa, GPx y FAL. Por otro lado, se observó supresión del gen PR1 a las 12 horas y a los 3 días de aplicada la bacteria a las plantas, y sobreexpresión del mismo gen a los siete días, respecto a las plantas del grupo control. La expresión del gen AOS, en los tiempos evaluados, no aumentó respecto a los controles. Los resultados obtenidos evidencian que Pseudoxanthomonas indica puede modular el sistema inmune vegetal, para favorecer la resistencia al ataque de patógenos. Ejemplo 11. Obtención de una formulación de Pseudoxanthomonas indica y demostración de su estabilidad.

Se obtuvo una formulación compuesta por un concentrado de Pseudoxanthomonas indica, cepa H32, como ingrediente activo, extracto de levadura como fuente de materia orgánica rica en aminoácidos, vitaminas y factores de crecimiento, una sustancia tensoactiva y agua. La composición final de la formulación fue: Extracto de levadura 70,4%; Sacarosa 1 ,4%; Glanapón DG-158™ al 3,2%, y 20% de biomasa seca del microorganismo Pseudoxanthomonas indica. En la composición, la bacteria queda a una concentración entre 10⁹ y 10¹° ufc/mL. La humedad residual de la composición fue de 5,0%. Se realizó un estudio de estabilidad a tiempo real de 3 lotes del formulado, para lo que se determinó el conteo de células viables y la actividad nematicida contra el fitonematodo Meloidogyne incógnita, en macetas, a los 6 y 12 meses de almacenada la formulación.

En la Tabla 7 se muestra el número de células viables y la ET de la formulación para los tiempos indicados. Esta refleja que la formulación o composición para el control biológico de fitonematodos es estable al menos durante 12 meses.

Tabla 7. Estudio de estabilidad de la formulación.

ET^*: Eficiencia técnica

Ejemplo 12. Evaluación “in vivo” del efecto nematicida de Pseudoxanthomonas indica sobre tres especies de fitonematodos.

Se realizó un procedimiento, a nivel de casa de cultivo, para evaluar el efecto nematicida“in vivo” de la formulación descrita en el Ejemplo 1 1 , sobre las especies Meloidogyne incógnita, Meloidogyne arenaria y Radopholus similis. Los ensayos con las especies Meloidogyne incógnita y Meloidogyne arenaria se realizaron con plantas de tomate ( Solanum lycopersycum ), y el ensayo con Radopholus similis en plantas de plátano ( Musa spp.). Las plántulas de tomate y plátano se trasplantaron a macetas con 2 kg de sustrato compuesto por arena:turba (1 :1 ). Previo al trasplante, al sustrato se le inocularon 3 000 huevos de Meloidogyne incógnita, 3 000 huevos de Meloidogyne arenaria o 500 especímenes de Radopholus similis. En los ensayos con Meloidogyne incógnita y Meloidogyne arenaria, el esquema que se utilizó fue de dos aplicaciones; la primera a los 3 días de la infestación del sustrato. La segunda aplicación se realizó a los 14 días después del trasplante. A los 35 días del trasplante se extrajeron las plantas, y se determinó el grado de infestación. Para las plantas de plátano infestadas con Radopholus similis se realizaron 3 aplicaciones: a los 15, 49 y 63 días. A los 80 días del trasplante, se evaluó la cantidad de nematodos por 100 g de raíz. En los dos cultivos, a partir de estos resultados, se determinó la ET de la formulación de Pseudoxanthomonas indica. Como se muestra en la Tabla 8, la bacteria fue efectiva frente a las tres especies de nematodos evaluadas.

Tabla 8. Eficiencia técnica de la formulación de Pseudoxanthomonas indica frente a varias especies de fitonematodos.

ET^*: Eficiencia técnica

Claims

REIVINDICACIONES COMPOSICIÓN BIOPESTICIDA Y BIOFERTILIZANTE

1. Composición biopesticida o biofertilizante que comprende Pseudoxanthomonas indica, o metabolitos de dicha especie bacteriana, y excipientes o diluentes.

2. La composición de la reivindicación 1 que comprende la suspensión o el concentrado de Pseudoxanthomonas indica viva o inactivada.

3. La composición de la reivindicación 1 donde los metabolitos se obtienen por vía natural, recombinante o por síntesis química.

4. La composición de la reivindicación 1 donde los metabolitos son compuestos volátiles o solubles.

5. La composición de la reivindicación 1 que adicionalmente comprende compuestos estabilizantes, potenciadores, elicitores de la actividad nematicida o cobertores de semillas.

6. La composición de la reivindicación 1 donde la concentración de Pseudoxanthomonas indica está entre 1 x10⁸ y 1 x10¹⁰ ufc/ml.

7. La composición de la reivindicación 1 donde el biopesticida se utiliza para el control directo o indirecto de fitopatógenos y zoonematodos.

8. Uso de Pseudoxanthomonas indica, o metabolitos de dicha especie bacteriana, para la fabricación de una composición biopesticida o biofertilizante.

9. El uso de la reivindicación 8 donde la concentración de Pseudoxanthomonas indica está entre 1 x10⁸ y 1 x10¹⁰ ufc/ml.

10. El uso de la reivindicación 8 donde el biopesticida se utiliza para el control directo o indirecto de fitopatógenos y zoonematodos.

1 1. El uso de la reivindicación 8 donde la composición biofertilizante está formulada como un suelo preempacado, un polvo, un líquido, una suspensión, un granulado, un nebulizador o un encapsulado.

12. Método para el control de fitopatógenos y zoonematodos que comprende la aplicación de una cantidad efectiva de Pseudoxanthomonas indica, o metabolitos de dicha especie bacteriana, a la planta o el animal que lo necesita.

13. El método de la reivindicación 12 donde Pseudoxanthomonas indica se aplica como una suspensión o un concentrado de dicha bacteria viva o inactivada.

14. El método de la reivindicación 12 donde Pseudoxanthomonas indica está formulada como un suelo preempacado, un polvo, un líquido, una suspensión, un granulado, un nebulizador o un encapsulado.

15. El método de la reivindicación 12 donde Pseudoxanthomonas indica se utiliza para reducir el grado de infestación producida por nematodos u hongos fitopatógenos en plantas.

16. Método para la estimulación del crecimiento de las plantas que comprende la aplicación de una cantidad efectiva de Pseudoxanthomonas indica, o metabolitos de dicha especie bacteriana, al suelo, sustrato, planta, o semilla.

17. El método de la reivindicación 16 donde Pseudoxanthomonas indica está formulada como un suelo preempacado, un polvo, un líquido, una suspensión, un granulado, un nebulizador o un encapsulado.