CN105543138B - 一株枯草芽孢杆菌及其在小麦纹枯病防治中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株从土壤中分离得到的小麦纹枯病菌具有拮抗作用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BB‑B。保藏编号为CGMCC NO.9373。本发明菌株BB‑B能拮抗小麦纹枯病菌‑禾谷丝核菌，通过检测分析发现其能产生蛋白酶、几丁质酶，纤维素酶和生物表面活性素。不同浓度的发酵液对小麦纹枯病均表现出一定的防治作用，并且随发酵液浓度的增加，其防治效果逐渐增加。其中，75%浓度发酵液的防效最好，达到67.3%，显示出有较高的利用价值。因此，本发明的菌株可以有效地应用于小麦纹枯病的防治，对于解决小麦白粉病害具有重要意义。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在小麦纹枯病防治中的应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其在小麦纹枯病防治中的应用。
背景技术
小麦纹枯病主要是由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)侵染引起的一种土传真菌病害，其分布范围广，几乎遍及世界各地温带小麦种植区。小麦纹枯病发生蔓延迅速，对小麦产量影响极大，一般田块可减产10％～30％，重病田块减产50％以上，个别田块甚至绝收。目前，生产中主要采用立克秀、适乐时、三唑类等化学杀菌剂进行防治。近几年来随着杀菌剂的大量使用，加之使用中存在用药的单一性及用药的不合理性等问题，使得小麦纹枯病菌对一些常用杀菌剂的敏感性降低，化学防治效果逐渐降低。杀菌剂污染环境和农副产品，也大幅度降低有益微生物的数量，因此必须开辟新的防治途径以提高综防效益。利用与植物亲和能力强的细菌来抑制该病原生长、繁殖、进入植物体以及提高植物的抗病性，为有效控制该病害的发生提供了可能。国内外开展了应用细菌防治该病的探寻研究，并表现出明显的效果。土壤中细菌资源丰富，其种的数量庞大，利用其筛选抗菌的菌株，从微生物中寻找发现新型先导化合物，对促进新型生物农药的开发和创制具有十分重要的意义。最新研究表明细菌在病害生物防治、固氮增收方面有潜在的应用和开发价值。
因此，寻找一种能防治小麦纹枯病的细菌就成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明目的是提供一株从土壤中分离得到的对小麦纹枯病菌具有拮抗作用的芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BB-B。
本发明的技术方案为：一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BB-B，保藏编号为CGMCC NO.9373，2014年6月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏。
一种微生物制剂，活性成分为枯草芽孢杆菌BB-B或/和其代谢产物。
枯草芽孢杆菌BB-B或上述微生物制剂在小麦纹枯病防治中的应用。
本发明的枯草芽孢杆菌BB-B能产生蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶和生物表面活性素，可以为生防菌剂的开发奠定基础。
本发明菌株BB-B能拮抗小麦纹枯病菌-禾谷丝核菌，通过检测分析发现其能产生蛋白酶、几丁质酶，纤维素酶和生物表面活性素。不同浓度的发酵液对小麦纹枯病均表现出一定的防治作用，并且随发酵液浓度的增加，其防治效果逐渐增加。其中，75％浓度发酵液的防效最好，达到67.3％，显示出有较高的利用价值。因此，本发明的菌株可以有效地应用于小麦纹枯病的防治，对于解决小麦白粉病害具有重要意义。
保藏信息
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BB-B，已于2014年6月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.9373，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为拮抗细菌的筛选对照；其中，A为对照，B为拮抗细菌BB-B；
图2为拮抗细菌BB-B的系统进化树；
图3芽胞杆菌BB-B蛋白酶检测结果；
图4几丁质酶检测实验结果；
图5标准葡萄糖标准曲线。
具体实施方式
实施例1拮抗细菌的筛选
采用五点取样法在郑州西郊小麦种植区中取适量土样，装入无菌聚乙烯塑料袋，封口。采用稀释平板分离法分离纯化菌株，从土壤中分离的66株细菌中得到一株对禾谷丝核菌有较好抑制作用的细菌(图1)，命名为BB-B，对禾谷丝核菌的抑制率达75.33％。
实施例2拮抗细菌BB-B的形态分析和生理生化鉴定
显微镜观察发现，细菌BB-B呈浅黄褐色，菌落分布均匀，质地光滑，菌落边缘乳白色，不透明。
对菌株进行生理生化鉴定，结果见表1。
表1拮抗细菌BB-B的生理生化鉴定结果
注：“+”表示阳性；“-“表示阴性。
根据细菌的生理生化鉴定结果，结合《伯杰细菌鉴定手册》，其中关于芽孢杆菌特征的描述与细菌BB-B比较符合，初步鉴定BB-B为芽孢杆菌。
实施例3拮抗细菌BB-B的16rDNA序列鉴定
提取基因组DNA，采用16S rDNA序列通用引物进PCR扩增，用1.0％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测发现一个长度约1500bp长度的扩增片段即为拮抗细菌BB-B的16S rDNA序列。将目的DNA片段进行回收、纯化、克隆、测序后得到1500bp大小的序列，运用生物信息数据库NCBI中的BLAST工具对所得序列进行搜索比对，结果见下图。从BLAST比对结果中选取高度相似、种属地位地位确定的菌株，获得其16S rDNA序列，采用DNAMAN软件构建系统进化树(图2)。
根据这11个菌株建立系统进化树，如图2所示，菌株间种属地位接近，在这11个菌株中拮抗细菌BB-B的相似度至少高于96％，基于BB-B与芽孢杆菌属的高度相似，确定BB-B为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
实施例4枯草芽胞杆菌BB-B发酵液的制备
将拮抗细菌BB-B分别挑取一环接入装有20ml LB液体培养基的100ml三角瓶中，在36℃，160r/min条件下摇床培养10-12h。次日，按4％的接种量，吸取菌液接种到装有100mL发酵培养液的250mL三角瓶(4瓶，空白试验4％接种量用LB液体培养基代替)后，36℃，160r/min，摇床培养48h。经10000r/min，4℃离心15min后(无菌水系滤膜0.22μL)收集上清液(拮抗细菌的发酵液)，4℃保存备用。
实施例5枯草芽胞杆菌BB-B的活性物质检测分析
1.蛋白酶定性检测
蛋白酶通过脱脂牛奶琼脂平板检测。向灭菌的干酵母粉琼脂培养基中加入高温处理脱脂牛奶(100mL/L)，将拮抗菌BB-B穿刺接于平板上，在28℃下培养72h后观察菌落外围是否产生透明圈。蛋白酶平板3d后观察结果如图3所示，菌落周围蛋白质被分解，周围出现透明环，检测结果阳性表明嗜氢菌BB-B含有蛋白酶。
2.几丁质酶定性检测
将培养好的拮抗菌穿刺接种于几丁质酶实验平板上，对照试验只在平板内加入几丁质酶培养基，在28℃下培养3d后每天观察菌落外围是否有透明圈，结果见图4，发现芽孢杆菌BB-B菌落周围出现透明圈，说明几丁质被分解，为阳性。表明嗜氢菌BB-B均含有几丁质酶。
3.纤维素酶活性测定
纤维素酶培养条件优化过程以测定羧甲基纤维素酶活力(CMCase)为主。取BB-B发酵液10mL，4℃，10000r/min离心5min，取上清液用于酶活力测定。取各含量葡萄糖溶液1ml，加入CMC羧甲基纤维素钠(1％)1mL，50℃水浴催化反应15min。反应结束后加入3mL的DNS试剂，混合均匀煮沸5min使样品显色。冷却后加水25mL使其混合均匀，在540nm波长下测定吸光值。空白管：取1mL蒸馏水，再加入底物溶液和DNS液，测定过程同样品测定。测定结果后绘制葡萄糖标准曲线。取离心后上清发酵液1mL，加入CMC羧甲基纤维素钠(1％)1mL，50℃水浴催化反应15min。反应结束后加入3mL DNS试剂，混合均匀煮沸5min使样品显色。冷却后加水25mL使其混合均匀，在540nm波长下测定吸光值。空白管:取等量酶液煮沸10min后灭活，再加入底物溶液和DNS液，测定过程同样品测定。根据葡糖糖标准曲线的回归方程，计算出反映体系的酶活。单位酶活力:50℃，PH8.0下，每分钟水解纤维素生成1mg葡萄糖的量为1个酶活力单位(U)。标准葡萄糖标准曲线如图5所示，纤维素酶活力测定OD值及平均酶活力如表2：
表2纤维素酶活力
菌种 第一组OD值 第二组OD值 第三组OD值 平均OD值 酶活力(U)
BB-B 0.136 0.134 0.144 0.138 10.9
结果表明，拮抗细菌BB-B表现出一定纤维素酶活力，且拮抗细菌BB-B的酶活力大小为10.9U。
4.生物表面活性素定性检测
取BB-B发酵液10mL，4℃，10000r/min离心5min，取发酵液上清用于生物表面活性素测定。取一直径为12cm的培养皿，加少量蒸馏水，水面上加0.1mL机用柴油，待形成油膜后，在油膜中心加BB-B上清发酵液(100μL)，中性油膜被挤向四周形成一圆圈，其中油圈直径与表面活性物质含量成正比。测量排油圈直径为7cm，表明拮抗细菌BB-B能产生一定的生物表面活性素。
实施例6枯草芽孢杆菌BB-B的盆栽防效实验
将豫麦49种子煮开花后高温灭菌，放在灭过菌的玻璃瓶中，接种纹枯病菌，25℃培养3～5d，使麦粒感染病菌，直至麦粒长满病菌。将带菌麦粒种到每盆已灭菌的蛭石和土(1：2)中，三个重复，每一重复种30粒带菌麦粒，处理药剂为BB-B细菌酵液，浓度分别为：25％浓度发酵液、50％浓度发酵液、75％浓度发酵液和100％浓度发酵液，设清水作空白对照。每处理各三个重复。播种后保持较高的湿度，以利发病。待对照组发病后调查防治效果。病情分级标准采用5级分类法。抗病性评价标准采用相对抗病指数法。
平均病情指数＝发病级数之和/(小麦棵数*4)
发病指数＝[∑(病害级别×该级别叶片数)/(最高病害级别×检查总叶片数)]×100
防治效果＝[(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数]×100％。
四种不同浓度的BB-B发酵液处理后，小麦的病情指数见表3。由表可知，与对照相比，发酵液处理后，小麦的发病情况均有所减轻，75％发酵液处理后的小麦，病情指数最低，为16.8％。
从盆栽防效结果(表3)可以看出，四个不同浓度的发酵液对小麦纹枯病菌均表现出一定的抑菌作用，并且随发酵液浓度的增加，其抑菌效果逐渐增加。其中，75％发酵液的防效最好，达到67.3％，显示出有较高的利用价值。
表3拮抗细菌不同浓度发酵液对小麦纹枯病菌的防效
药剂处理 病情指数 防效
对照 51.3％ 0
25％发酵液 38.8％ 24.4％
50％发酵液 26.7％ 47.9％
75％发酵液 16.8％ 67.3％
100％发酵液 20.7％ 59.6％
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (3)

1. 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) BB-B，保藏编号为CGMCC NO. 9373。
2.一种微生物制剂，其特征在于，活性成分为权利要求1所述的枯草芽孢杆菌BB-B或/和其代谢产物。
3.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌BB-B或权利要求2所述的微生物制剂在小麦纹枯病上防治中应用。
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