CN105543137B - 一株嗜氢菌及其在小麦白粉病防治中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株从土壤中分离得到的对小麦白粉病菌具有拮抗作用的嗜氢菌(Hydrogenophaga sp.)BB‑E。保藏编号为CGMCC NO.9374。本发明菌株BB‑B能拮抗小麦白粉病菌，通过检测分析发现其能产生蛋白酶、几丁质酶，纤维素酶和生物表面活性素。小麦离体叶段防效实验表明，50.0%浓度发酵液处理后，小麦白粉病的病情指数为23.4%，与对照组的病情指数95.1%相比，防病效果达75.4%。有较好的防治效果，能增强小麦的白粉病抗性。

Description

一株嗜氢菌及其在小麦白粉病防治中的应用
技术领域
本发明涉及微生物及其微生物应用领域。具体涉及一株对小麦白粉病菌有拮抗作用的嗜氢菌，发酵液中含有抗菌活性物质，可用于小麦白粉病的防治。
背景技术
小麦白粉病菌引起的小麦白粉病严重影响世界各个小麦产区中小麦的质量与产量。在小麦生长的整个生育期内均可染病，小麦白粉病菌为专性活体寄生真菌，主要感染于小麦叶鞘、茎与穗中。20世纪70年代以来，随着各产区小麦品种的快速交流、耕作制度的不断改善与趋同，使得小麦白粉病分布越来越广泛、越来越严重，对小麦的减产严重时可达10％～30％，小麦白粉病成为小麦主要病害之一。在我国已有20多个省市发生小麦白粉病且病情逐年加重，在中国西南各省、河南、山东、湖北、江苏和安徽等小麦产区发病较为严重，而西北与东北麦区也日益严重。
在对小麦白粉病的防治过程中，我国主要采用单一的三唑酮类化学药剂，这对专性活体寄生的小麦白粉病菌有严重地后果，在长期的使用这类化学药剂的过程中，由于病菌变异速度较快、抗病品种相对缺乏，使得容易产生对其的严重抗药性，且抗药性逐年递增；在长期、大面积地使用化学药剂的同时也严重破坏土壤土质、间接影响周围物种的正常生长；加之长久使用化学药剂易导致多种的食品安全问题，近年来人们对食品安全空前重视，人们对长期使用化学药剂的小麦食品感到担忧。因此研究一种安全可靠的生防菌种是非常急需也非常重要的。
微生物防治是利用有利可靠的微生物，通过生物间的竞争、抗生、寄生、溶菌及诱导抗性等影响某些病原菌的活动甚至存活。微生物防治具有大量优点，由于自然界中微生物含量极其巨大使得微生防治具有最为得天独厚的优势，且相比化学药剂微生物防治对环境产生的破坏相对小很多，利于和谐发展。当今世界对微生物防治的热门研究更加刺激使其成本得到大幅降低，科学技术的发展使得微生物防治变得更加普遍、高效。
土壤中具有非常丰富的微生物资源，有资料显示，每一克土壤中就包含1010个微生物个体，而其中有大量可供开发利用的有益菌种。在小麦白粉病的生物防治过程中，利用植株上附生的细菌或土壤中的拮抗细菌进行控制小麦白粉病的发病为常用手段，而从土壤中筛选生防细菌为最具有发展潜力的的防治方法之一。
发明内容
本发明目的在于提供一株从土壤中分离得到的对小麦白粉病菌具有拮抗作用的嗜氢菌(Hydrogenophaga sp.)BB-E，该菌株能拮抗小麦白粉病菌。
本发明的技术方案为：嗜氢菌(Hydrogenophaga sp.)BB-E，保藏编号为CGMCCNO.9374。2014年6月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏。
一种微生物制剂，活性成分为嗜氢菌BB-E或嗜氢菌BB-E的代谢产物。
嗜氢菌BB-E或上述微生物制剂在小麦白粉病防治中的应用。
本发明嗜氢菌BB-E能产生蛋白酶、几丁质酶，纤维素酶和生物表面活性素,可以为生防菌剂的开发奠定基础。
本发明菌株BB-B能拮抗小麦白粉病菌，通过检测分析发现其能产生蛋白酶、几丁质酶，纤维素酶和生物表面活性素。小麦离体叶段防效实验表明，50.0％浓度发酵液处理后，小麦白粉病的病情指数为23.4％，与对照组的病情指数95.1％相比，防病效果达75.4％。有较好的防治效果，能增强小麦的白粉病抗性。
保藏信息
嗜氢菌(Hydrogenophaga sp.)BB-E，已于2014年6月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.9374。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1拮抗细菌BB-E对小麦白粉病菌的孢子萌发抑制效果，A为对照组，B为BB-E发酵液处理组；
图2扩增出的拮抗细菌BB-E的16S rDNA片段，M：DNA Marker，箭头指示目的条带；
图3拮抗细菌BB-E的系统进化树；
图4嗜氢菌BB-E蛋白酶检测结果；
图5几丁质酶检测结果；
图6标准葡萄糖标准曲线。
具体实施方式
实施例1嗜氢菌BB-E的筛选
采用五点取样法在郑州西郊小麦种植区中取适量土样，装入无菌聚乙烯塑料袋，封口。采用稀释平板分离法分离纯化菌株，将细菌发酵液与融化状态的3％琼脂糖混合(1：1)未凝固前滴加于凹型载玻片上，制备成发酵液混合培养基，以未加发酵液的1.5％琼脂培养基作对照，取新鲜小麦白粉病菌孢子抖落于培养基中，培养48h，镜检、统计小麦白粉病菌孢子萌发率，计算孢子萌发抑制率。
实施例2嗜氢菌BB-E的形态分析和生理生化鉴定
显微镜观察发现，细菌BB-E菌落分布均匀，隆起低，边缘光滑，淡黄色，质地光滑，湿润，半透明。
对菌株进行生理生化鉴定，结果见表1。
表1拮抗细菌BB-E的生理生化鉴定结果
注:“+”表示阳性；“-”表示阴性。
根据细菌的生理生化鉴定结果，结合《伯杰细菌鉴定手册》，其中关于噬氢菌特征的描述与细菌BB-E比较符合，初步鉴定BB-E为噬氢菌。
实施例3嗜氢菌BB-E的16rDNA序列鉴定
提取基因组DNA，采用16S rDNA序列通用引物进PCR扩增，用1.0％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测发现一个长度约1500bp长度的扩增片段即为拮抗细菌BB-E的16S rDNA序列(图2)。
将目的DNA片段进行回收、纯化、克隆、测序后得到1490bp大小的序列，运用生物信息数据库NCBI中的BLAST工具对所得序列进行搜索比对，结果见图3。从BLAST比对结果中选取高度相似、种属地位地位确定的菌株，获得其16S rDNA序列，采用DNAMAN软件构建系统进化树(图3)。
根据这11个菌株建立系统进化树，如图3所示，菌株间种属地位接近，在这11个菌株中生防细菌BB-E的相似度至少高于96％，基于BB-E与嗜氢菌属的高度相似，确定BB-E为嗜氢菌属(Hydrogenophaga sp.)。
实施例4嗜氢菌BB-E发酵液的制备
将拮抗菌BB-E分别挑取一环接入装有20mlLB液体培养基的100ml三角瓶中，在36℃，160r/min条件下摇床培养10-12h。次日，按4％的接种量，吸取菌液接种到装有100mL发酵培养液的250mL三角瓶(4瓶，空白试验4％接种量用LB液体培养基代替)后，36℃，160r/min，摇床培养48h。经10000r/min，4℃离心15min后(无菌水系滤膜0.22μL)收集上清液(拮抗细菌的发酵液)，4℃保存备用。
实施例5嗜氢菌BB-E的活性物质检测分析
1.蛋白酶定性检测
蛋白酶通过脱脂牛奶琼脂平板检测。向灭菌的干酵母粉琼脂培养基中加入高温处理脱脂牛奶(100mL/L)，将拮抗菌BB-E穿刺接于平板上，在28℃下培养72h后观察菌落外围是否产生透明圈。蛋白酶平板3d后观察结果如图4所示，菌落周围蛋白质被分解，周围出现透明环，检测结果阳性表明嗜氢菌BB-E含有蛋白酶。
2.几丁质酶定性检测
将培养好的拮抗菌穿刺接种于几丁质酶实验平板上，对照试验只在平板内加入几丁质酶培养基，在28℃下培养3d后每天观察菌落外围是否有透明圈，结果见图5，发现嗜氢菌BB-E菌落周围出现透明圈，说明几丁质被分解，为阳性。表明嗜氢菌BB-E均含有几丁质酶。
3.纤维素酶活性测定
纤维素酶培养条件优化过程以测定羧甲基纤维素酶活力(CMCase)为主。取BB-E发酵液10mL，4℃，10000r/min离心5min，取上清液用于酶活力测定。取各含量葡萄糖溶液1ml，加入CMC羧甲基纤维素钠(1％)1mL，50℃水浴催化反应15min。反应结束后加入3mL的DNS试剂，混合均匀煮沸5min使样品显色。冷却后加水25mL使其混合均匀，在540nm波长下测定吸光值。空白管:取1mL蒸馏水，再加入底物溶液和DNS液，测定过程同样品测定。测定结果后绘制葡萄糖标准曲线。取离心后上清发酵液1mL，加入CMC羧甲基纤维素钠(1％)1mL，50℃水浴催化反应15min。反应结束后加入3mL DNS试剂，混合均匀煮沸5min使样品显色。冷却后加水25mL使其混合均匀，在540nm波长下测定吸光值。空白管:取等量酶液煮沸10min后灭活，再加入底物溶液和DNS液，测定过程同样品测定。根据葡糖糖标准曲线的回归方程，计算出反映体系的酶活。单位酶活力:50℃，PH8.0下，每分钟水解纤维素生成1mg葡萄糖的量为1个酶活力单位(U)。标准葡萄糖标准曲线如图6所示。
纤维素酶活力测定OD值及平均酶活力如表2：
表2纤维素酶活力
菌种 第一组OD值 第二组OD值 第三组OD值 平均OD值 酶活力(U)
BB-E 0.107 0.126 0.110 0.114 9.7
结果表明，拮抗细菌BB-E表现出一定纤维素酶活力，且拮抗细菌BB-E的酶活力大小为9.7U。
4.生物表面活性素定性检测
取BB-E发酵液10mL，4℃，10000r/min离心5min，取发酵液上清用于生物表面活性素测定。取一直径为12cm的培养皿，加少量蒸馏水，水面上加0.1mL机用柴油，待形成油膜后，在油膜中心加BB-E上清发酵液(100μL)，中性油膜被挤向四周形成一圆圈，其中油圈直径与表面活性物质含量成正比。测量排油圈直径为9cm，表明拮抗细菌BB-E能产生一定的生物表面活性素。
实施例6嗜氢菌BB-E的离体叶段防效实验
将拮抗细菌BB-E进行液体发酵，离体叶段病害防治试验发现，经不同浓度发酵液处理的小麦离体叶段的病情指数比对照组低，发病程度均有所减轻。其中50.0％浓度发酵液处理后，防病效果最好，小麦白粉病的病情指数为23.4％，与对照组的病情指数95.1％相比，防病效果达75.4％(表3)。100.0％浓度发酵液处理组的病情指数为31.7％，与对照组的病情指数95.1％相比，防病效果达66.7％。表明50.0％浓度发酵液处理对小麦白粉病有较好的防治效果，能增强小麦的白粉病抗性，具有进一步开发成菌剂的潜力。
表3不同浓度发酵液处理对小麦白粉病的防治效果
Figure BDA0000902992300000051
注:*表示差异显著，**表示差异极显著。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (3)

1. 嗜氢菌(Hydrogenophaga sp.) BB-E，保藏编号为 CGMCC NO. 9374。
2.一种微生物制剂，活性成分为权利要求1所述的嗜氢菌BB-E或嗜氢菌BB-E的代谢产物。
3.根据权利要求1所述的嗜氢菌BB-E或权利要求2所述的微生物制剂在小麦白粉病防治中的应用。
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